Pembahasan : Pada praktikum kali ini dilakukan isolasi DNA kromosom yang bertujuan untuk memahami metode isolasi

DNA kromosom sel prokariot berupa bakteri Gram negatif menggunakan GeneJETTM Genomic DNA Purification it! Prinsipnya adalah memisahkan DNA kromosom atau DNA genom" yaitu seluruh DNA yang ada pada suatu organisme #makhluk hidup$" baik yang berfungsi atau yang tidak" baik yang ada di inti sel" mitokondria" atau kloroplas" atau dengan kata lain DNA genom adalah DNA mentah yang masih memiliki komponen lengkap seperti promoter gen" bagian exon #m%NA yang akan dikirim keluar nukleus untuk ditranslasikan$" dan bagian intron #m%NA yang akan tetap berada di dalam nukleus karena kemungkinan m%NA tersebut akan membentuk protein yang tidak fungsional #tidak berguna$ jika ditranslasikan$! &akteri gram negatif yang digunakan adalah bakteri Eshericia coli! &akteri gram negatif digunakan karena struktur dinding sel bakteri gram negatif lebih tipis dibandingkan bakteri gram positif sehingga akan lebih mudah dipecahkan! DNA kromosom yang diisolasi adalah DNA kromosom dari bakteri Eschericia coli! romosom E.coli merupakan ' untai ganda sirkular dengan ukuran sekitar (!)**kb! +kuran DNA kromosom ini lebih besar daripada DNA plasmid" oleh karena itu isolasi DNA kromosom harus dilakukan secara lebih hati,hati supaya DNA tidak patah! -al pertama yang dilakukan adalah bakteri E.coli ditumbuhkan dengan cara bakteri E!coli yang didapatkan dalam praktikum sebelumnya dimasukkan kedalam . ml /& cair steril dan ditambahkan antibiotik Ampisilin . 0/! Media /& #Luria-Bertani$ merupakan salah satu media yang paling umum digunakan untuk memelihara dan menumbuhkan strain rekombinan dari Escherichia coli dan digunakan pada industri sejak tahun '1.*,an. 2elain itu" media /& juga merupakan medium optimal untuk pertumbuhan bakteri! omposisi umum media /& cair diantaranya adalah tryptone" Na3l" ekstrak ragi" dan a4ua bidest #fungsi masing5 6at 777$! Penambahan antibiotik bertujuan untuk agar bakteri yang sudah terdapat plasmid yang resisten terhadap antibiotik tetap stabil dan berkembang

dengan baik!

arena apabila /& cair biakan tidak mengandung antibiotik nanti

dikha8atirkan bakteri yang sudah mempunyai plasmid tersebut melepaskan kembali plasmid resisten yang telah dimilikinya! 2etelah itu" campuran diinkubasi pada suhu 9:o3 selama '5,') jam dengan pengocokan yang bertujuan agar koloni bakteri E.coli tersebar homogen dalam media /& cair. ;nkubasi tersebut bertujuan untuk memberikan kondisi yang sesuai dengan kondisi pertumbuhan bakteri sehingga bakteri dapat tumbuh secara maksimal! Dan dihasilkan bakteri yang dipanen dalam bentuk suspensi bakteri E.coli! Pada praktikum yang dilakukan" terdapat kesalahan pada penambahan antibiotik yang dilakukan" dimana pada praktikum sebelumnya dilakukan transformasi dengan penyisipan gen resisten kanamisin sedangkan antibiotik yang ditambahkan adalah ampisilin! <alaupun demikian" bakteri E.coli tetap tumbuh sehingga dapat disimpulkan kemungkinan bakteri telah mempunyai gen resisten terhadap ampisilin! 2uspensi E.coli yang didapatkan selanjutnya dimasukkan kedalam . tabung appendorf masing,masing ' m/! Pembagian kedalam . tabung eppendorf tersebut agar dapat sekaligus disentrifugasi dan proses sentifugasi bisa dilakukan lebih cepat" karena jika digunakan hanya ' tabung appendorf lalu . ml suspensi bakteri dimasukkan maka 8aktu yang disentrifugasi menjadi lebih lama yakni 5. menit! 2elain itu" kapasitas tabug appendorf yang hanya '". m/ dan agar endapan yang dihasilkan lebih banyak sehingga sel yang DNAnya akan diisolasi menjadi lebih banyak! emudian disentrifugasi pada kecepatan .***g selama . menit! 2entrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya! Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian ba8ah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung! Pemisahan sentrifugal menggunakan prinsip dimana objek diputar secara hori6ontal pada jarak tertentu! Apabila objek berotasi di dalam tabung atau silinder yang berisi campuran cairan dan partikel" maka campuran tersebut dapat bergerak menuju pusat rotasi" namun hal tersebut tidak terjadi karena adanya gaya yang berla8anan yang menuju kearah dinding luar silinder atau tabung" gaya tersebut adalah gaya sentrifugasi! Gaya inilah yang menyebabkan partikel,partikel menuju dinding tanbung dan terakumulasi membentuk endapan! -asil sentrifugasi

akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah" yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian ba8ah! Pada sentrifugasi ini" didapatkan endapan dari sel,sel DNA bakteri" karena sel,sel bakteri mempunyai berat molekul yang cukup besar sehingga akan mengendap sebagai pelet di bagian ba8ah tabung! emudian supernatan dari masing,masing tabung appendorf yang tidak mengandung sel,sel bakteri #hanya mengandung sisa /& cair$ dibuang! 2upernatan dapat dibuang dengan cara langsung dituang dari tabung appendorfnya kemudian sisa supernatan yang sulit terbuang dipipet secara hati,hati dan jangan sampai pelletnya ikut terpipet=terbuang! emudian pellet dari . tabung appendorf disatukan #dijadikan ' tabung$ dengan cara ditambahkan .**0/ dd-5> steril dimasukkan kedalam tabung appendorf pertama" kemudian dilakukan pipetting sampai pellet tersuspensi dalam tabung! 2elanjutnya dipipet dan dimasukan ke tabung kedua" lakukan pipeting lagi hingga pellet tersuspensi lalu dipipet dan dimasukkan ke tabung ketiga begitu selanjutnya hingga tabung ke .! Penambahan a4ua bidest bertujuan untuk memudahkan dalam pemindahan pelet dari satu tabung ke tabung selanjutnya dengan mengubah bentuknya menjadi suspensi! A4ua bidest digunakan karena a4ua yang diperoleh dari proses destilasi=penyulingan sebanyak 5 kali ini mempunyai kandungan bakteri yang sangat kecil= tidak ada akibat proses penguapan lalu pendinginan yang dilakukan saat pembuatannya! 2elanjutnya suspensi pellet tersebut disentrifugasi pada kecepatan .***g selama . menit dan supernatan dibuang! 2entrifugasi dengan kecepatan .*** g ini berfungsi untuk !!!!!!!!!!!!!!! 2aat sentrifugasi" peletakan tabung yang akan disentrifugasi harus berhadapan dengan tabung kelompok 5 agar selama sentrifugasi keseimbangannya terjaga! Jika hanya ' tabung yang akan disentrifugasi" maka harus digunakan tabung kosong untuk membuat seimbang! emudian pellet ditambahkan kembali dengan .** 0/ a4ua bidest dilanjutkan dengan pipeting dan disentrifugasi pada kecepatan .*** g selama . menit" supernatan dibuang! Proses ini bertujuan agar sel,sel bakteri tersebut bersih dan bebas dari 6at,6at yang larut bersamanya sebelumnya! 2etelah itu" kedalam tabung yang berisi pellet ditambahkan (.0/ digest solution lalu dilakukan pipetting agar pelet tersuspensi" lalu ditambahkan .0/

proteinase

lalu ?orte@! Penambahan proteinase

berfungsi untuk

menghancurkan=mendegradasi dengan memotong,motong atau memutus ikatan peptida dari protein,protein yang terdapat pada sel bakteri tersebut seperti dinding sel yang tersusun atas protein yang berikatan dengan polisakarida #peptidoglikan$ atau membran sel yang tersusun atas lemak dan protein! Digest solution adalah campuran apa77!!!!!!! berfungsi untuk melisis membran bakteri dan membebaskan isi sel bakteri! 2edangkan ?orte@ dilakukan untuk mengocok campuran sehingga diperoleh campuran yang homogen dan agar pemutusan ikatan,ikatan peptida karena penambahan Protease dan pelisisan membran bakteri karena penambahan digest solution tersebut dapat terjadi lebih cepat! 2elanjutnya suspensi sel yang pecah diinkubasi pada suhu .)o3 di dalam shaking 8aterbath sampai sel lisis secara sempurna kira,kira selama 9* menit! -al tersebut bertujuan untuk mengoptimalkan kerja en6im yang sangat dipengaruhi oleh temperatur dan sesekali di?orte@ untuk menghomogenkan larutan" agar lisis dari sel terjadi sempurna! emudian ekstrak sel ditambahkan .u/ %nase A kemudian ?orte@ lalu dan dari remukan sel masih tercampur dengan %NA arena dalam praktikum yang akan diisolasi diinkubasi pada suhu ruangan! DNA yang telah dibersihkan dari protein dengan menggunakan proteinase sehingga penambahan %NAse diperlukan untuk menghancurkan %NA sehingga DNA dapat diisolasi secara utuh! adalah DNA maka perlu penambahan %Nase untuk menghancurkan %NA begitupun sebaliknya jika yang akan diisolasi adalah %NA" maka yang harus dihancurkan adalah DNA dengan DNase! 2uhu ruangan digunakan untuk menginaktifasi en6im yang mendegradasi DNA #DNase$ dan tahapan ini termasuk dalam pemecahan dinding sel dan membran inti secara fisik! 2elanjutnya ke dalam ekstrak ditambahkan lisis solution lalu ?orte@ selama '. detik hingga doperoleh campuran yang homogen! /isis solution berisi !!!!!! konsentrasi !!!!!!!! berfungsi untuk membantu memaksimalkan kerja dari digestion solution! emudian kedalamnya ditambahkan '**0/ etanol .*A lalu ?orte@! Bungsi dari penambahan etanol juga untuk mengikat strand DNA yang telah terkumpul atau agar terjadi dehidrasi DNA sehingga terjadi praecipitasi" karena etanol .*A akan melarutkan senya8a lain selain DNA! 2trand,strand DNA yang terikat oleh etanol akan

nampak sebagai benang,benang putih yang terapung diatas filtrat! Pemekatan dengan etanol pada lapisan atas sampel sehingga terjadi presipitasi DNA! Etanol yang digunakan mempunyai konsentrasi .*A karena!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! /alu ekstrak dimasukkan kedalam kolom GeneJETTM #Genomic DNA Purification 3olumn$ yang diba8ahnya telah ditaruh tabung kolektor! Ekstrak dimasukkan dengan cara dipipet tegak lurus dan secara perlahan mengarah ke tengah membran kolom plasmid tetapi tip mikropipet tidak boleh menyentuh membran kolom agar kolom tidak rusak! 2elanjutnya disentrifugasi pada kecepatan )***g selama ' menit! -al ini bertujuan untuk memisahkan kontaminan yang mungkin masih terdapat pada supernatan! Prinsip kerja dari kromatografi kolom adalah didasarkan pada absorbsi komponen,komponen terhadap afinitas berbeda terhadap fase diam! Absoben bertindak sebagai fase diam dan fase geraknya adalah cairan yang mengalir memba8a komponen campuran sepanjang kolom! 2ampel yang mempunyai afinitas besar terhadap absorben akan tertahan secara selektif dan yang afinitasnya paling kecil akan mengikuti aliran pelarut! Dalam hal ini" fase diam merupakan menbran plasmid yang dapat berikatan dengan DNA! emudian supernatan yang berisi etanol .*A dan tidak mengandung DNA #karena telah terikat pada membran plasmid$ dalam tabung kolektor dibuang! Dan kolom dimasukkan kembali ke dalam tabung kolektor yang sama dan disentrifugasi dengan kecepatan )*** g selama ' menit agar pemisahan berlangsung sempurna! 2upernatan yang tertampung pada tabung kolektor dibuang! /alu ke dalam kolom dimasukkan 8ash buffer sebanyak 5.*0/ lalu disentrifugasi dengan kecepatan C***g selama ' menit! <ash buffer ; berisi!!!!!!!!!!!!!!!!! 2edangkan sentrifugasi dengan kecepatan C*** g kolektor dibuang! berfungsi untuk !!!!!!!!!!! 2etelah disentrifugasi supernatan yang tertampung di tabung emudian ke dalam kolom dimasukkan 8ash buffer ;;" lalu disentrifugasi dengan kecepatan '5** g selama ' menit! <ash buffer ;; berisi!!!!!!!!!!!!!!! &erbeda dengan sentrifugasi sbelumnya" sentrifugasi dengan kecepatan '5*** g berfungsi untuk !!!!!!!!!!! 2elanjutnya supernatan yang tertampung di dalam tabung kolektor dibuang! Proses penambahan 8ash buffer sebagai fase gerak pertama ini merupakan proses pencucian DNA #mencuci DNA

dari pengotor$ karena 8ash buffer akan mengelusi residu dari kolom sedangkan DNA akan tetap terikat pada membran plasmid #fase diam=kolom$! Jika masih ada larutan residu yang terlihat" maka disentrifugasi lagi dengan kecepatan yang sama selama ' menit! Pengulangan ini dimaksudkan agar mendapatkan pellet yang lebih murni" sehingga hasil yang didapatkan akan lebih baik dibandingkan dengan sentrifugasi tanpa pengulangan! Pada proses pencucian ini digunakan 8ash buffer ; dan ;; yang telah ditambahkan etanol 1),'**A dengan perbandingan 9D'! enapa beda77 Penampung di ba8ah kolom diganti dengan tabung appendorf '". m/! edalam kolom dimasukkan Elution buffer kebagian tengah membran kolom plasmid #kolom mikropipet tidak boleh menyentuh membran kolom$ sebanyak 9*0/ yang berisi '*mM Tris3l" p- 1"* dan *". mM EDTA! Penambahan Ellution &uffer berfungsi untuk mengelusi DNA dan mengikat pengotor selain DNA dalam kolom sehingga DNA terpisah sempurna dari pengotor dan dapat diba8a keluar dari membran plasmid #kolom$! Elution buffer dapat mengelusi DNA karena !!!!!!!!! Eolume Elution &uffer yang digunakan cukup kecil karena DNA diisolasi dari jumlah sampel yang sedikit dan diperlukan konsentrasi DNA yang lebih pekat" tetapi semakin sedikit ?olume Ellution &uffer maka akan semakin sedikit pula kadar DNA yang terelusi! emudian diinkubasi pada suhu ruangan berfungsi selama 5 menit berfungsi untuk !!!!!!!!!!!!!!!!! /alu disentrifugasi dengan kecepatan C***g selama ' menit! 2entrifugasi dengan kecepatan C*** g untuk !!!!!!!!!!! -asil dari penambahan elution buffer yang telah disentrifugasi tersebut ditampung di tabung appendorf '".m/ dan selanjutnya disebut fraksi A dan disimpan pada suhu ,5* o3! 2etelah itu" kolom yang telah dilepas ditempatkan pada tabung appendorf '". m/ baru untuk menampung hasil elusi kedua dan ditambahkan kembali elution buffer sebanyak 9*0/! /alu diinkubasi pada suhu ruangan selama 5 menit dan disentrifugasi pada kecepatan C***g selama ' menit! Braksi yang tertampung pada appendorf selanjutnya disebut fraksi & lalu disimpan pada suhu ,5* o3! Perlakuan tersebut dilakukan sebanyak 5 kali agar !!!!!!!!!!!!!!!!

Bungsi 2entrifugasi dengan kecepatan .***g" )*** g" C***g dan '5***g bisa dilihat di ncbi kata akangnya!

<arna merah D aku ga yakin ja8abannya uning D aku ga tau ja8abnnya !! hehehe