LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI Materi Isolasi DNA

Nama NIM Kelom%o& Asiste(

: Nurul Lailiyatul F : 1 !"#" "11111!$ : 'e(i() 11*"" + 1 *#" : Layli

PROGRAM 'TUDI AGROEKOTEKNOLOGI FAKULTA' PERTANIAN UNI,ER'ITA' BRA-I.A/A MALANG "10

BAB 1 PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan se ara seluler. DNA terdapat pada nukleus! mitikondria! dan kloroplas. Perbedaan ketiganya adalah DNA nukleus berbentuk linier dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon! sedangkan DNAmitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon."elain itu DNA mitokondria dan kloroplas memiliki iri khas! yaitu hanya me#ariskan sifat$sifat yang berasal dari garis ibu. "edangkan DNA nukleus memiliki pola pe#arisansifat dari kedua orangtua. Dilihat dari organismenya! struktur DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular! sedangkan DNA eukariot berbentuk linier dan memiliki protein histon DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang anti pararel dengan komponen$komponennya! yaitu gula pentosa %deoksiribosa&! gugus fosfat dan pasangan basa. "ebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan bersifat herediter pada seluruhsistem kehidupan. DNA 'uga dapat diisolasi! baik pada manusia maupun tumbuhan. DNA manusia dapat diisolasi melalui darah.(omponen darah yang diisolasi yaitu sel darah putih! karena memiliki nukleus dimanaterdapat DNA didalamnya.

1.) *u'uan $ +engetahui definisi isolasi DNA $ +engetahui metode dan tahapan dalam isolasi DNA $ +engetahui manfaat isolasi DNA

1., +anfaat +ahasis#a dapat mengetahui dan melakukan proses$proses yang berkaitan langsung untuk melakukan isolasi DNA.

BAB -*-N.AUAN PU"*A(A ).1 Pengertian isolasi DNA

-solasi DNA merupakan langkah mempela'ari DNA. "alah satu prinsisp isolais DNA yaitu dengan sentrifugasi. "entrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan ampuran berdasarkan berat molekul komponennya. +olekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian ba#ah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung. Hasil sentrifugasi akan menun'ukkan dua ma am fraksi yang terpisah! yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian ba#ah. %Arsis! )/1/& -solasi DNA adalah proses pengeluaran DNA dari tempatnya berada %ekstraksi atau lisis& biasanya dilakukan dengan homogenasi dan penambahan buffer ekstraksi atau buffer lisis untuk men egah DNA rusak. %0u#ono! )//1& DNA isolation is a routine pro edure to olle t DNA for subse2uent mole ular or forensi analysis.

% -solasi DNA adalah prosedur rutin untuk mengumpulkan DNA untuk analisis molekuler atau forensik berikutnya.& %Doyle! 133/&

).)

+a am metode -solasi DNA a. (it hen Preparation ada 4 hal penting yang harus kita lakukan untuk melakukan isolasi DNA yaitu5

1. melisis sel se ara fisik! dengan ara penggerusan. ). peme ahan dinding sel. ,. peme ahan membran sel. 4. pemisahan DNA dari bahan yang lain. Bahan yang kita gunakan biasanya berupa 'aringan tumbuhan atau 'aringan he#an! untuk itu langkah pertama yang harus kita lakukan adalah meme ahkan 'aringan men'adi sel$sel yang mandiri. Proses dilakukan se ara fisik dengan menumbuk atau menggerus bahana yang akan kita gunakan. bahkan bahan yang lunak seperti stro#berry ukup hanya diremas$remas sa'a. (edua adalah meme ahkan dinding sel dan membran sel lapisan pembungkus DNA. struktur utama pembentuk membran dan dinding sel adalah lemak! untuk itu kita gunakan deter'en dan garam dapur. (edua bahan ini digunakan untuk melubangi dan merusak sel sehingga isi inti sel %DNA&bisa keluar.

.ika perlu kita dapat menambahkan proteinase %en6im pengurai protein& untuk menyingkirkan protein yang mungkin akan mengotori bahan yang kita inginkan. Proteinase alami yang dapat kita gunakan adalah papain yang merupakan ekstrak daun pepaya! atau bromelin yang merupakan ekstrak buah nanas. *ahap selan'utnya adalah pemisahan DNA dari bahan yang lain. Pemisahan dilakukan dengan menggunakan ethanol7alkohol dingin berkonsentrasi 3/$ 389. Ethanol7Alkohol tidak melarutkan DNA dan berat 'enis alkohol yang lebih ringan dari air membuat DNA naik dan melayang$layang di permukaan. %*ohib! )/1)& b. :*AB

:*AB merupakan se'enis deter'en yang dapat mendegradasi dinding sel! denaturasi protein! memisahkan karbohidrat merusak membran sel dan melarutkan DNA. Apabila dinding sel terdegradasi maka semua isi sel dapat keluar termasuk DNA dan dilepaskan ke dalam buffer ekstraksi. Dalam proses isolasi DNA tanaman! penambahan senya#a pereduksi seperti mer haptoetanol dapat men egah proses oksidasi senya#a fenolik sehingga menghambat akti;itas radikal bebas yang dihasilkan oleh oksidasi fenol terhadap asam nukleat. +er haptoetanol 'uga berfungsi untuk melindungi <NA dari senya#a 2uinon! disulphide! peroksida! poliphenoksidase! dan protein. Proses pemansan pertama bertu'uan untuk melarutkan :*AB dan

mer aptoetanol. "edangkan pemanasan yang kedua bertu'uan untuk memdegradasi protein dan dinding sel. (lorofrom dan isoamilalkohol %:-AA& berfungsi untuk mengekstrak dan dan mengendapkan komponen polisakarida di dalam buffer ektraksi yang mengkontaminasi larutan DNA. Pemberian isopropanol dan etanol dilakukan agar ter'adi dehidrasi DNA sehingga ter'adi presipitasi. "etelah pemberian etanol! pellet yang dipeoleh dikeringanginkan. Hal ini bertu'uan untuk mengeringkan pellet dari sisa$sisa buffer maupun etanol. *ahapan terakhir dari ektraksi ini adalah penambahan buffer *E. Buffer *E berfungsi untuk melarutkan DNA yang dihasilkan dan men'aga DNA agar tidak mudah rusak. Dalam buffer *E mengandung ED*A yang berfungsi sebagai senya#a pengkelat yang mengikat ion +agnesium! yaitu kofaktor yang diperlukan untuk alti;tas berbagai en6im nu lease . +etode ekstraksi DNA dengan :*AB akan menghasilkan pita DNA yang berukuran tebal dan dapat memisahkan DNA dari polisakarida karena adanya perbedaan karakteristik kelarutan %differensial of solubility&. Disamping deperoleh fragmen DNA! dengan metode :*AB 'uga akan diperoleh <NA dengan pita tipis yang terletak 'auh berada di ba#ah pita DNA. (eberadaan pita <NA tergantung bahan yang diekstraksi. +etode ini tidak membutuhkan biaya yang lebih mahal dibandingkan dengan menggunakan kit. "elain itu! kelebihan dari ektraksi ini adalah pita DNA yangdiproleh lebih tebal bila dibandinglan dengan

ektraksi metode fenol dan tanpa fenol. Akan tetapi! dari hasil dengan metode ini masih terdapat pita smear dan DNA yang dihasilkan lebih sedikit daripada ektraksi dengan menggunakan kit. (endala yang umum ter'adi dalam ekstraksi :*AB adalah adanya inhibitor pada inang! rendahnya konsentrasi ;ius dan pengaruh ara maupun lama #aktu penyimpanan %Pur#antara! )//1&. )., a. *ahap -solasi DNA

-solasi 'aringan *ahap pertama yang dilakukan yaitu mengisolasi 'aringan yang ingin digunakan. b. Pelisisan dinding dan membran sel

*ahap selan'utnya yaitu melisiskan dinding dan membran sel dengan ara penggerusan %homogenasi&! sentrifugasi dengan ke epatan lebih dari 1/./// rpm atau dengan menggunakan larutan pelisis sel atau buffer ekstraksi. -nti sel harus dilisiskan! karena substansi gen yang diinginkan ada didalamnya. Penambahan larutan pelisis sel ini bertu'uan untuk melisiskan sel yang tidak mengandung DNA agar sel yang mengandung inti sel dapat diisolasi atau dipisahkan dari komponen$komponen sel lainnya yang tidak berfungsi. . Pengekstraksian dalam larutan

"elan'utnya supernatan yang terbentuk dibuang dan kemudian dilakukan ekstraksi di dalam larutan. Hal tersebut bertu'uan agar didapat ekstrak. d. Purifikasi

*ahap ini bertu'uan untuk membersihkan hasil ekstrak dari 6at$6at lainnya. Pada larutan tersebut kemudian diberikan <NAse dan diinkubasi selama 1/ menit pada suhu 18=:. Hal tersebut bertu'uan untuk mengoptimalkan ker'a en6im yang sangat dipengaruhi oleh temperatur. Penambahan <NAse berguna untuk menyingkirkan kontaminasi <NA sehingga DNA dapat diisolasi se ara utuh. e. Presipitasi *ahap terakhir! yaitu presipitasi bertu'uan untuk mengendapkan protein histon! sehingga untai$untai DNA tidak lagi menggulung % oiling& dan berikatan dengan protein histon! yang menyebabkan DNA men'adi terlihat. *ahap presipitasi dilakukan dengan ara meneteskan larutan presipitasi protein dan kemudian di;orte> yang bertu'uan untuk menghomogenkan larutan. Larutan presipitasi protein terdiri atas amonium asetat yang 'ika berikatan dengan protein mengakibatkan terbentuknya senya#a baru dengan kelarutan lebih rendah! sehingga menyebabkan protein mengendap. Larutan tersebut kemudian disentrifugasi kembali selama 8 menit dengan ke epatan 1,./// rpm. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat 'enis molekul dengan ara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar! sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas % 0u#ono! )//1 & ).4 +anfaat -solasi DNA %khususnya bagi pertanian&

-solasi DNA diperlukan untuk analisis genetik! yang digunakan untuk tu'uan ilmiah! medis! atau

forensik. Para ilmu#an menggunakan DNA di se'umlah aplikasi! seperti pengenalan DNA ke dalam sel dan binatang atau tanaman! atau untuk tu'uan diagnostik. Dalam obat aplikasi yang terakhir adalah yang paling umum. Di sisi lain! ilmu forensi perlu memulihkan DNA untuk identifikasi indi;idu %bagi pemerkosa misalnya! pen uri ke il! ke elakaan! atau korban perang&! penentuan ayah! dan pabrik atau identifikasi he#an. %Pur#antara! )//1&.

BAB --+E*?D?L?@,.1 Alat dan Bahan Aungsi ,.1.1 Alat -solasi DNA - *imbangan analitik! untuk menimbang bahan - -n ubator! sebagai tempat untuk menginkubasi dan untuk mengaktifkan :*AB - "entrifuge! untuk memisahkan antara supernatant!fase organi dan fenol - +ikropipet dan tip$nya ! digunakan untuk membantu memasukkan larutan - Beaker glass! sebagai tempat bahan - *abung reaksi! tempat mereaksikan larutan - +ortar dan penumbuknya! untuk menumbuk daun kubis supaya lebih halus - Labu Erlenmeyer! sebagai tempat larutan

Borte> ! untuk menghomogenkan larutan Aree6er! untuk menginkubasi larutan *UB! sebagai tempat larutan

,.1.) Bahan -solasi DNA - Daun kubis! sebagai bahan praktikum - Alkohol! untuk mensterilkan - Nitrogen air! untuk membantu penggerusan dan penghalusan tumbukan daun dan merusak dinding sel - :*AB C +er hapbethanol! untuk meme ah dinding sel dan men'aga DNA agar tidak rusak - :-A %:hloroform -soamile Al ohol&! untuk mengeluarkan isi sel dan untuk mengurangi kontaminasi protein dan polisakarida -soprophanol dingin! untuk membantu dalam proses penggumpalan DNA men'adi benang$ benang DNA - Buffer pen u i! untuk men u i larutan - *ris ED*A! untuk meresistensi ,.) Langkah (er'a D dokumentasi :ampur buffer ekstraksi %1 ml& dengan karbon %/!8 #7u& dan mer aptoethanoll *imbang /!1 gr sampel daun

+asukkan dalam 4 El %ko ok sebelum digunakan& mortar!tambahkan "edikit p;p! *ambahkan N) air "egera digerus "ampai halus %'angan sampai

+en air& +asukkan 1 ml kedalam tube Ukuran 1!8 ml dan tutup tube %beri label pada tube& Segera masukkan

*ube berisi buffer ekstraksi

"egera ;orte> sampai rata

-nkubasi dalam o;en %18/: 1/ menit& bolak balik ketube setiap 8 menit (eluarkan tube dari o;en dan didinginkan sebentar

"etelah dingin!sentrifuge %1,./// rpm selama 8 menit& Ambil supernatant dan dipindahkan ke tube baru %tube ) ml 7 1!8 ml& *ambahkan 8// El ;orte> hiasm pada supernatant dan

"entrifuge %1,./// rpm selama 8 menit&

Pindahkan supernatant ke tube 1!8 tambahkan hiasm 8// El dan ;orte>

ml!

dan

"entrifuge 1,./// rpm selama 8 menit

Pindahkan supernatant ke tube baru 1!8 ml dan tambahkan ,// El isopropanol dingin se ara perlahan

Bolak balik tube se ara perlahan %'angan sampai tergun ang keras dan inkubasi dalam free6er selama 1/ menit& (eluarkan tube dan biarkan hingga tidak terlalu dingin! sentrifuge 1/./// rpm selama 8 menit

Buang supernatant ! tambahkan buffer pen u i 8// El pada pellet dalam tube ;orte>

"entrifuge %1/./// rpm selama 8 menit&

Buang supernatant dan kering anginkan pellet sampai kering *ambahkan buffer *E 8/$1// El dan larutan pellet DNA dengan ara mengetuk$ketuk tube se ara perlahan

,.,

Analisis Perlakuan

Dalam praktikum isolasi DNA pertama yang dilakukan siapkan alat dan bahan yang akan dipergunakan. :ampur buffer ekstraksi 1ml dengan karbon %/!89 #7u& dan mer aptoethanol 4 El %ko ok sebelum digunakan&. Lalu masukkan 1 ml ke dalam tube ukuran 1!8 ml dan tutup tube dengan diberikan label pada tube tersebut. *imbang /!1 gram sampel daun lalu masukkan dalam mortar dan tambahkan sedikit p;p guna untuk melisiskan dinding sel lalu tambahkan nitrogen air lalu segera digerus sampai halus %'angan sampai men air& ! setelah d gerus masukkan ke dalam tube yang berisi buffer ekstraksi. "etelah di ;orte> sampai rata guna untuk menghomogenkan! diinkubasi dalam o;en dengan suhu 18/: selama 1/ menit bolak balik tube setiap 8 menit. (eluarkan tube dari o;en dan dinginkan sebentar! setelah dingin di sentrifuge selama 8 menit. Ambil supernatant dan di pindahkan ke tube baru ) atau 1!8 ml. *ambahkan 8// El hiasm pada supernatant dan di ;orte>. Di sentrifuge kembali selama 8 menit! pindahkan supernatant ke tube lalu tambahkan hiasm 8//El dan di ;orte>. Lalu di sentrifuge lagi selama 8 menit! setelah itu dipindahkan ke tube baru! tambahkan ,//El isopropanol dingin se ara perlahan. Bolak balik tube se ara perlahan 'angan sampai tergun ang keras dan diinkubsi dalam free6er selama 1/ menit. (eluarkan tube dan biarkan hingga tidak terlalu dingin! sentrifuge selama 8 menit. Buang supernatant dan tambahkan buffer pen u i 8//El pada pellet dalam tube ;orte>. "etelah itu di sentrifuge

selama 8 menit. Buang supernatant dan kering anginkan pellet sampai kering. Lalu *ambahkan *E 8/$1//El dan larutan pellet DNA dengan ara mengetuk$ketuk tube se ara perlahan

BAB -B HA"-L DAN PE+BAHA"AN 4.1 Hasil %DNA *erlihat7tidak D dokumentasi hasil& 4.) pembahasan Bariasi pada modifikasi masingmasing metode memberikan hasil yang terbaik! yaitu menghasilkan pita DNA yang tebal dan sedikit kontaminan. Bariasi modifikasi pada metode Doyle C Doyle %133/& dengan nitrogen air memiliki ;ariasi terbaik! yaitu ;ariasi

menggunakan Proteinase ( setelah pen u ian pelet DNA dengan ethanol F19. Bariasi modifikasi pada metode Doyle C Doyle %133/& tanpa nitrogen air 'uga memiliki ;ariasi terbaik! yaitu menggunakan Proteinase ( setelah inkubasi bufer dan <NAse pada tahap akhir isolasi. Bariasi modifikasi metode Gheng et al. %1338& memiliki ;ariasi terbaik! yaitu menggunakan Proteinase ( setelah inkubasi bufer dan <NAse pada tahap akhir isolasi. %

BAB B PENU*UP 8.1 (esimpulan -solasi DNA merupakan suatu proses untuk mendapatkan DNA murni yang dapat digunakan untuk keperluan pemeriksaan atau diagnosa. Dalam praktikum ini! diguanakan daun kubis untuk proses pengisolasian DNA. Alat yang digunakan antara lain mikropipet! mortar! forte>! sentrifuse! elektroforesis! dan lainnya. Bahan yang digunakan diantaranya nitrogen air! Buffer :*AB! PBP! :hisam! -sopropanol! dan lainnya. Pada praktikum isolasi DNA ini saat disentrifuse pertama kali didapati hasil adanya , larutan yang terpisah satu sama lain yaitu! lapisan atas disebut supernatant %:hisamDDNA&! lapisan tengah yaitu fase organi ! dan lapisan ba#ah yang disebut fenol. "edangkan sentrifuse yang kedua yaitu hanya larutan supernatant yang digunakan sehingga ada ) material yang terpisah yaitu lapisan atas %DNA& ber#arna putih dan lapisan ba#ah %:hisam& ber#arna bening. 8.) (ritik dan "aran 8.).1 (ritik dan "aran untuk Praktikum *ahun Depan Untuk sistematika praktikum lebih dipersiapkan!agar tidak menyusahkan praktikan

8.).) (ritik dan "aran untuk Asisten

Asisten agar tidak seenaknnya sendiri dalam mengganti dan menentukan 'ad#al.

DAA*A< PU"*A(A Asris. )/1/. Definisi Isolasi DNA dan Manfaat Isolasi DNA.http577asris/F.student.ipb.a .id7)/1/7/17137iso lasi$dna7.diakses pada 1 Desember )/1, Doyle. .. . and Doyle .. L. 133/. Isolation of Plant DNA from Fresh Tissue Focus. +os o#. 1) %1&5 1,. Pur#antara! A. )//1. Principles of DNA Isolation and Manipulation. Horkshop on Plant Pathogens Dete tion by +ole ulae *ehni2ues. )4$)1 .anuari )//1. *ohib. )/1). Macam Metode Isolasi DNA. http577###.tohib.#eb.id7)/1)7/37isolasi$dna metode$kit hen$preparation.html diakses pada 1 Desember )/1, 0u#ono! *ri#ibo#o. )//1. Bioteknolgi Pertanian. @ad'ah +ada Uni;ersity Press. 5 0ogyakarta