Proposal Isolasi Andrographolide dari Herba Sambiloto (Andrographis paniculata Ness)

Diajukan untuk memenuhi salah satu tugas mata kuliah praktikum Fitokimia II

Disusun Oleh : Asep Somantri Ayu Sartika (24111008) (24111009)

Nuroniah Nuri Lestari (24111037) Ratna Melinda Serli Yulianti (24111039) (24111044)

Laboratorium Fitokimia Sekolah Tinggi Farmasi Bandung 2014

1. Tinjauan Pustaka a. Tinjauan Botani Sambiloto yang juga dikenal sebagai King of Bitters bukanlah tumbuhan asli Indonesia, tetapi diduga berasal dari India. Menurut data spesimen yang ada di Herbarium Bogoriense di Bogor, sambiloto sudah ada di Indonesia sejak 1893. Di India, sambiloto adalah tumbuhan liar yang digunakan untuk mengobati penyakit disentri, diare, atau malaria. Hal ini ditemukan dalam Indian Pharmacopeia dan telah disusun paling sedikit dalam 26 formula Ayurvedic. Dalam Traditional Chinese Medicine (TCM), sambiloto diketahui penting sebagai tanaman cold property dan digunakan sebagai penurun panas serta membersihkan racun-racun di dalam tubuh. Tanaman ini kemudian menyebar ke daerah tropis Asia hingga sampai di Indonesia. Sambiloto dapat tumbuh di semua jenis tanah sehingga tidak heran jika tanaman ini terdistribusi luas di belahan bumi. Habitat aslinya adalah tempat-tempat terbuka yang teduh dan agak lembab, seperti kebun, tepi sungai, peka-rangan, semak, atau rumpun bambu. Sambiloto memiliki batang berkayu berbentuk bulat dan segi empat serta memiliki banyak cabang (monopodial). Daun tunggal saling berhadapan, berbentuk pedang (lanset) dengan tepi rata (integer) dan permukaannya halus, berwarna hijau. Bunganya berwarna putih

keunguan, berbentuk jorong (bulan panjang) dengan pangkal dan ujungnya yang lancip. Di India, bunga dan buah bisa dijumpai pada bulan Oktober atau antara Maret sampai Juli. Di Australia bunga dan buah antara bulan Nopember sampai bulan Juni tahun berikutnya, sedang di Indonesia bunga dan buah dapat ditemukan sepanjang tahun. Di beberapa daerah di Indonesia, sambiloto dikenal dengan berbagai nama. Masyarakat Jawa Tengah dan Jawa Timur menyebutnya dengan bidara, sambiroto, sandiloto, sadilata, takilo, paitan, dan sambiloto. Di Jawa Barat disebut dengan ki oray, takila, atau ki peurat. Di Bali lebih dikenal dengan samiroto. Masyarakat Sumatera dan sebagian besar masyarakat Melayu menyebutnya dengan pepaitan atau ampadu. Sementara itu, nama-nama asing sambiloto diantaranya chuan xin lian, yi jian xi, dan lan he lian (Cina), kalmegh, kirayat, dan kirata (India), xuyen

tam lien dan congcong (Vietnam), quasabhuva (Arab), nainehavandi (Persia), green chiretta dan king of bitter (Inggris). Semua bagian tanaman sambiloto, seperti daun, batang, bunga, dan akar, terasa sangat pahit jika dimakan atau direbus untuk diminum. Diduga ini berasal dari andrographolide yang dikandungnya. Sebenarnya, semua bagian tanaman sambiloto bisa dimanfaatkan sebagai obat, termasuk bunga dan buahnya. Namun bagian yang paling sering digunakan sebagai bahan ramuan obat tradisional adalah daun dan batangnya.

a.1 Klasifikasi Tanaman Dalam sistematika (taksonomi), tumbuhan sambiloto dapat diklasifikasikan sebagai berikut : Kingdom : Plantae (Tumbuhan)

Subkingdom : Tracheobionta (Tumbuhan berpembuluh) Super Divisi : Spermatophyta (Menghasilkan biji) Divisi Kelas Sub Kelas Ordo Famili Genus Spesies a.2 Morfologi Tumbuhan sambiloto dapat tumbuh liar di tempat terbuka, seperti kebun kopi, tepi sungai, tanah kosong yang agak lembab, atau di pekarangan. Merupakan daun yang berasa pahit dan dingin. Tumbuh di dataran rendah sampai ketinggian 700 meter di atas permukaan laut. Tumbuhan sambiloto merupakan tumbuhan semusim, dengan tinggi 50-90 cm, batang yang disertai dengan banyak cabang berbentuk segi empat. Daun tunggal, bertangkai pendek, letak berhadapan bersilang, bentuk lanset, pangkal runcing, ujung meruncing, tepi rata, permukaan atas daun berwarna hijau tua, bagian : Magnoliophyta (Tumbuhan berbunga) : Magnoliopsida (berkeping dua / dikotil) : Asteridae : Scrophulariales : Acanthaceae : Andrographis : Andrographis paniculata Nees

bawah daun berwarna hijau muda, panjang 2-8 cm, lebar 1-3 cm. Bunga tumbuh dari ujung batang atau ketiak daun, berbentuk tabung, kecil-kecil, warnanya putih bernoda ungu. Memiliki buah kapsul berbentuk jorong, panjang sekitar 1,5 cm, lebar 0,5 cm, pangkal dan ujung tajam, bila masak akan pecah membujur menjadi 4 keping. Biji gepeng, kecil-kecil, warnanya cokelat muda. Tumbuhan ini dapat dikembangbiakkan dengan biji atau stek batang.

b. Tinjauan Kimia b.1 Kandungan Kimia Tanaman Secara kimia mengandung flavonoid dan lakton. Pada lakton, komponen utamanya adalah andrographolide, yang juga merupakan zat aktif utama dari tanaman ini. Andrographolide sudah diisolasi dalam bentuk murni dan menunjukkan berbagai aktivitas farmakologi. Zat aktif herba ini dapat ditentukan dengan metode gravimetrik atau dengan high performance liquid chromatography [HPLC]. Berdasarkan penelitian lain yang telah dilakukan, kandungan yang dijumpai pada tanaman sambiloto diantaranya diterpene lakton dan glikosidanya, seperti andrographolide, deoxyandrographolide, 11,12didehydro-14-eoxyandro-grapholide, dan neoandrographolide.

Flavonoid juga dilaporkan ada terdapat pada tanaman ini. Daun dan percabangannya lebih banyak mengandung lakton sedangkan komponen flavonoid dapat diisolasi dari akarnya, yaitu polimetoksiflavon, androrafin, panikulin, mono-0-metilwithin dan apigenin-7,4 dimetileter. Selain komponen lakton dan flavonoid, pada tanaman sambiloto ini juga terdapat komponen alkane, keton, aldehid, mineral (kalsium, natrium, kalium), asam kersik dan damar. Di dalam daun, kadar senyawa andrographolide sebesar 2,5-4,8% dari berat keringnya. Ada juga yang mengatakan biasanya sambiloto distandarisasi dengan kandungan andrographolide sebesar 4-6%. Senyawa kimia lain yang sudah diisolasi dari daun yang juga pahit yaitu diterpenoid viz, deoxyandro-grapholide-19-D-glucoside, dan neo-andrographolide.

b.2 Tinjauan Kimia Khusus (Andrographolide) Andrographolide, yang merupakan senyawa yang masuk dalam grup trihidroksilakton memiliki rumus molekul C20H30O5. Struktur molekul andrographolide disajikan pada Gambar 1.

Gambar 1 Struktur Molekul Andrographolide Andrographolide, komponen utama daun sambiloto dapat dengan mudah larut dalam metanol, ethanol, pyridine, asam asetat, dan aceton, tetapi sedikit larut dalam ether dan air. Sifat fisika dari andrographolide adalah sebagai berikut: titik leleh 228-230C, spectrum ultraviolet dalam etanol maskimal 223nm(Kumoro, 2007). c. Tinjauan Farmakologi c.1 Farmakokinetik Beberapa studi sudah dilakukan untuk melihat disposisi

andrographolide dalam berbagai organ tubuh. Dalam suatu penelitian pada hewan percobaan menunjukkan bahwa 48 jam setelah pemberian andrographolide, komponen ini dijumpai tersebar luas ke seluruh organ tubuh. Konsentrasi yang dijumpai di otak sebesar 20,9%, limpa 14,9%, jantung 11,1%, paruparu 10,9%, rektum 8,6%, ginjal 7,9%, hati 5,6%, uterus 5,1%, ovarium 5,1%, dan usus halus sebesar 3,2%. Menurut penelitian terakhir, andrographolide memiliki

bioavailabilitas tinggi pada manusia. Setelah pemberian peroral, 20 mg andrographolide segera diabsorbsi, mencapak nilai puncak plasma dalam waktu 1,5 sampai 2 jam dengan waktu paruh 6,6 jam.16 Sementara pada penelitian lainnya menunjukkan waktu paruh andrographolide relatif singkat, lebih kurang dalam waktu 2 jam.

Setelah 72 jam, hampir 90% andrographolide dieksresikan. Sebagian besar eksresinya ini melalui urin, sebagian lainnya melalui saluran cerna. Pada beberapa studi dikatakan bahwa 80% dari dosis

andrographolide yang dikonsumsi akan dieksresikan dari tubuh dalam waktu 8 jam.

c.2 Farmakodinamika Distribusi yang luas di jaringan dan organ tubuh serta adanya khasiat yang mengatur dan meningkatkan sistem imun menyebabkan sambiloto menjadi calon ideal untuk mencegah dan mengobati berbagai penyakit. Pemberian sambiloto menunjukkan efek protektif aktivitas enzim superoxide dismutase, catalase, terhadap glutathione

peroxidase dan glutathione yang menurun dengan pemberian hexachloro cyclohexane (BHC). Hasilnya menunjuk-kan adanya khasiat antioksidan dan hepatoprotektif dari sambiloto. Shukla, dkk. mengkaji efek hepatoprotektif ekstrak daun sambiloto terhadap kerusakan hati yang diinduksi karbon tetraklorida. Ekstrak dengan dosis 300 mg/kg (1/6 dari LD50) diperoleh dengan maserasi dingin. Hasilnya, ekstrak ini dijumpai efektif dalam mencegah kerusakan hati dengan parameter penilaiannya mencakup morfologi, biokimia dan fungsional. jumlah Andrographolide yang juga mencegah toksisitas

menurunnya

empedu

disebabkan

acetaminophen. Efek hipoglikemik sambiloto sudah diteliti dengan berbagai cara. Salah satunya, penelitian Borhanuddin, dkk. pada kelinci

menunjukkan bahwa ekstrak air sambiloto dengan dosis 10 mg/kg berat badan dapat mencegah hiperglikemia yang diinduksi dengan pemberian glukosa per oral dengan dosis 2 mg/kg berat badan secara signifikan. Mekanismenya kemungkinan sambiloto mencegah

absorpsi glukosa dari usus. Zoha, dkk. mengkaji efek antifertilitas sambiloto pada mencit. Ketika serbuk sambiloto dicampur dengan makanan hewan (Rats Pelletts) dengan dosis 2 gram per kilogram berat badan per hari,

kemudian diberikan pada mencit betina setiap hari selama enam minggu, tidak seekorpun (100%) yang hamil ketika dikawinkan dengan mencit jantan. Ini dilakukan untuk membuktikan fertilitas yang tidak diberi obat. Sebaliknya, sebagian besar mencit kelompok control (95,2%) yang tidak diberi obat, menjadi hamil ketika dikawinkan dengan jantan dengan jenis yang sama seperti pada kelompok perlakuan, dan melahirkan dalam jumlah normal (rata-rata 5 sampai 6 ekor) setelah 6 perkawinan berikutnya. Wang, dkk. mengobservasi efek komponen sambiloto terhadap nitric oxide, endothelin, cyclic guanosine monophosphate, lipid peroxide dan super-oxide dismutase, pada model kelinci percobaan yang memiliki aterosklerotik dengan cara memberi diet tinggi kolesterol. Kesimpulannya, sambiloto memiliki efek antioksidan, menjaga fungsi endothelial, dan mempertahankan keseimbangan nitric oxide/endothelin. Studi psikofarmakologi sudah dilakukan Mandal, dkk. dengan menggunakan ekstrak herba sambiloto. Hasilnya menunjukkan adanya perubahan yang signifikan pada pola tingkah laku dan berkurangnya pergerakan spontan. Ekstrak ini juga memperlama waktu tidur hewan percobaan yang diinduksi pentobarbitone dan menurunkan suhu tubuh. Calabrese, dkk. melakukan uji klinis fase I andrographolide yang berasal dari sambiloto pada relawan sehat, yaitu 13 orang positif HIV dan 5 orang tidak terinfeksi HIV. Objektifnya terutama untuk menilai keamanan dan tolerabilitas serta menilai efek andrographolide terhadap kadar plasma RNA virus HIV-1 dan kadar limfosit CD4 (+). Selama penelitian, tidak satu subjekpun yang menggunakan

pengobatan antiretroviral. Bila terdapat kelainan hati dan ginjal, maka akan dikeluarkan dari penelitian. Regimen yang direncanakan adalah 5 mg/kg berat badan selama 3 minggu, ditingkatkan menjadi 10mg/kg berat badan selama 3 minggu dan akhirnya sampai 20 mg/kg berat badan selama 3 minggu. Penelitian dihentikan pada minggu keenam karena adanya reaksi yang tidak diinginkan termasuk reaksi anafilaktik pada satu orang relawan. Semua kejadian yang tidak diinginkan diatasi dengan menghentikan pengamatan. Peningkatan

yang signifikan pada rata-rata kadar limfosit CD4 (+) pada subjek HIV terjadi se-telah pemberian 10 mg/kg berat badan andrographolide (dari 405 sel/mm menjadi 501 sel/mm). Tidak ada perubahan statistik yang signifikan pada rata-rata kadar plasma RNA HIV-1 selama penelitian. Andrographolide mungkin menghambat disregulasi siklus sel yang diinduksi HIV, seiring dengan peningkatan kadar limfosit CD4 (+) pada penderita yang terinfeksi HIV-1. Satu studi yang dilakukan oleh Caceres, dkk. satu kelompok pelajar di sekolah pedesaan diberi plasebo dan kelompok lainnya diberi Kan Jang (sambiloto), kemudian diobservasi untuk melihat kejadian flu setelah tiga bulan. Dosis yang diberikan pada kelompok studi sebesar 200 mg per hari. Hasilnya, setelah satu bulan tidak ada perbedaan yang signifikan, tetapi setelah tiga bulan, terjadi perbedaan yang signifikan, yaitu kelompok Kan Jang yang menderita flu, 2,1 kali lebih rendah dibanding kelompok plasebo, dengan laju insidennya 30 persen, sedangkan kelompok plasebo sebesar 62 persen. Pada studi lainnya, Caceres, dkk. mengukur keefektifan ekstrak Andrographis, dibandingkan dengan plasebo, dalam mengurangi gejala yang berhubungan dengan common cold. Kelompok pasien dewasa terdiri dari 158 orang laki-laki dan perempuan. Efek Andrographis diukur pada hari 0, 2, dan 4 setelah pengobatan. Pada hari ke-2, kelompok pasien yang mendapatkan Andrographis menunjukkan adanya pengurangan beberapa gejala, dan pada hari ke-4, kelompok yang sama menunjukkan pengurangan gejala yang signifikan dibandingkan dengan kelompok plasebo. Kesimpulannya, sambiloto menunjukkan efektivitas yang tinggi dalam menurunkan prevalensi dan intensitas gejala common cold tanpa komplikasi dimulai hari kedua pengobatan. Pada penelitian ini, tidak ada efek samping yang dilaporkan. Darwin membuktikan ekstrak sambiloto pada dosis 10 mg/kg berat badan yang diberi peroral mampu mengurangi kejadian adhesi intraperitonium pada hewan percobaan tikus (86%). Sambiloto dapat menghambat edema sebesar 60% dalam waktu tiga jam pada dosis 200 mg/kg berat badan, dan pada dosis 400 mg/kg berat badan sebesar 62,7%. Khasiat antiinflamasi ini

kemungkinan melalui mekanisme yang melibatkan kelenjar adrenal. Efek ini hilang bila kelenjar adrenal diangkat dari binatang percobaan. Andrographolide menunjukkan adanya efek koleretik (4.8-73%) tergantung dosis (1,5-12 mg/kg) yang ditunjukkan dengan adanya aliran empedu, garam empedu, dan asam empedu pada tikus dalam keadaan sadar dan guinea pig yang teranastesi. KajiancZulkarnain Rangkuty menunjukkan adanya efek kolekinetik 250 mg simplisia akar, batang, dan daun sambiloto pada relawan sehat. Selain yang tersebut di atas, khasiat sambiloto yang lain yang sudah diteliti diantaranya, sebagai antimalaria dan antidiare.

c.3 Interaksi Obat Ekstrak sambiloto kemungkinan memiliki efek sinergis dengan isoniazide. Selain itu, sampai saat ini belum diketahui interaksi obat lain dengan sambiloto.

c.4 Efek Samping Sakit kepala, fatique, rasa pahit, dan peningkatan enzim hati dilaporkan terjadi pada uji klinis pada pasien yang terinfeksi HIV yang diberi andrographolide dosis tinggi. Hal ini tidak ada dilaporkan pada orang yang menggunakan andrographis atau ekstrak terstandard pada jumlah yang direkomendasikan. Seperti semua herba yang pahit, sambiloto mungkin menyebabkan ulkus dan adanya rasa terbakar. Keamanan terhadap wanita hamil dan menyusui sampai saat ini belum diketahui.

c.5 Toksisitas Dalam pengobatan tradisional China, Thailand dan India,

sambiloto sudah menunjukkan keamanannya. Uji toksikologi pada hewan coba dan manusia menunjukkan bahwa andrographolide dan senyawa lain yang terdapat pada sambiloto memiliki toksisitas yang sangat rendah. Pada mencit yang diberi ekstrak sambiloto secara oral (10 gr/kgBB) sekali sehari selama 7 hari, tidak ada seekorpun tikus yang mati. Jantung, ginjal, hati, dan limpa dijumpai dalam keadaan normal pada hewan percobaan ini. Ketika sambiloto dengan dosis 500

mg/kg berat badan diberikan selama 10 hari setiap hari pada mencit, tidak ada efek pada pertumbuhan, selera makan dan produksi feses. Hewan coba tersebut tetap energik dan hasil jumlah darah lengkapnya berada pada batas normal. Pada kelinci yang diberi andrographolide (10 mg/kg berat badan) secara intravena,

menunjukkan tidak ada respons kardiovaskuler yang abnormal. Uji enzim hati, jantung, ginjal dan limpa juga berada dalam keadaan normal pada hewan coba ini. Pada uji toksisitas lainnya, tikus atau kelinci yang diberi andrographolide atau neoandrographolide dengan dosis 1 gr/kg berat badan secara oral selama 7 hari, menunjukkan tidak ada pengaruh terhadap berat badan, jumlah darah, fungsi hati dan ginjal, serta organ penting lainnya. 2. Metodologi a. Penapisan Fitokimia Penapisan fitokimia serbuk simplisia dilakukan terhadap golongan alkaloid, flavonoid, saponin, tannin, kuinon, steroid-triterpenoid. a.1 Pemeriksaan Alkaloid Sebanyak 5 gram simplisia dilembabkan dengan 5 mL amonia 25% dan digerus dalam mortir. Setelah ditambah 20 mL kloroform digerus lagi kuat-kuat dan disaring. Filtrat berupa larutan organik digunakan diteteskan untuk pada percobaan kertas selanjutnya.Sebagian yang telah larutan ini

saring

ditetesi

pereaksi

Dragendorff. Terbentuknya warna merah atau jingga pada kertas saring menunjukkan adanya alkaloid. Sisa larutan organik diekstraksi dua kali dengan asam klorida (1:10 v/v). Ke dalam dua tabung reaksi yang masing-masing berisi 5 mL larutan ini ditambahkan beberapa tetes pereaksi Dragendorff dan Mayer. Terbentuknya endapan merah bata dengan pereaksi dragendorff atau endapan putih dengan pereaksi Mayer menunjukkan adanya alkaloid.

a.2 Pemeriksaan Flavanoid Sebanyak 10 gram simplisia ditambahkan 100 mL air panas, dididihkan selama 5 menit dan disaring. Ke dalam 5 mL filtrat ditambahkan serbuk magnesium, 1 mL asam klorida pekat,dan 2 mL

amil alkohol dikocok kuat dan dibiarkan memisah. Adanya flavanoid ditunjukkan dengan adanya warna merah , kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol. a.3 Pemeriksaan Saponin Sebanyak 10 mL larutan percobaan yang berasal dari

pemeriksaan flavonoid dimasukkan ke dalam tabung reaksi, dikocok kuat secara vertikal selama 10 detik. Terbentuknya busa setinggi 1 sampai 10 cm yang stabil tidak kurang dari 10 menit dan tidak hilang pada penambahan setetes asam klorida 2 N menunjukkan adanya saponin. a.4 Pemeriksaan Tanin Sebanyak 10 gram simplisia dalam 100 mL air dididihkan selama 5 menit, kemudian didinginkan dan disaring. Filtrat dibagi menjadi tiga bagian. Ke dalam filtrat pertama ditambahkan larutan besi(III) klorida 1%, timbulnya warna hijau biru atau hitam menunjukkan adanya tanin. Pada filtrat kedua ditambahkan larutan gelatin, terbentuknya endapan putih menunjukkan adanya tanin. Ke dalam filtrat ketiga ditambahkan pereaksi Steasny (campuran formaldehida 30% dan asam klorida pekat 2:1), kemudian dipanaskan dalam tangas air. Terbentuknya endapan warna merah muda menunjukkan adanya tanin katekat. Kemudian endapan disaring, filtrat dijenuhkan dengan natrium asetat dan ditambahkan beberapa tetes besi(III) klorida 1%. Terbentuknya warna biru tinta menunjukkan adanya tanin galat.

a.5 Pemeriksaan Kuinon Sebanyak 1 gram simplisia dalam 10 mL air dididihkan selama 5 menit, kemudian didinginkan dan disaring. Ke dalam 5 mL filtrat ditambahkan natrium hidroksida 1 N. Terbentuknya warna merah menunjukkan adanya kuinon. a.6 Pemeriksaan Steroid / Triterpenoid Sebanyak 5 gram simplisia dimaserasi dalam 20 mL eter selama 2 jam kemudian disaring. Sebanyak 5 mL filtrat diuapkan dalam cawan

penguap sampai kering. Ke dalam residu ditambahkan dua tetes asam asetat glasial dan setetes asam sulfat pekat. Terbentuknya warna merah-ungu menunjukkan triterpenoid, dan jika terbentuk warna hijau-biru menunjukkan steroid. b. Ekstraksi dan Alasan Pemilihan Metode Sebanyak 50 gram simplisia yang telah berupa serbuk diekstraksi secara maserasi menggunakan 200 mL metanol di dalam labu Erlenmeyer 250 mL. Campuran tersebut lalu digojog kuat setiap 10 menit selama 1 jam setelah itu disaring menggunakan kertas saring. Filtrat yang didapatkan ditampung, dan ditambah 150 mL metanol kembali. Replikasi ini dilakukan sebanyak 2 kali. Filtrat yang diperoleh diuapkan diatas cawan porselen di atas penangas air, hingga didapatkan volume filtrat 10 mL. Selanjutnya disebut dengan ekstrak metanol sambiloto. Metode ekstraksi yang digunakan adalah metode maserasi karena ditinjau dari segi teksturnya yang lunak, selain itu juga untuk mencegah terjadinya kerusakan komponen kimia yang tidak tahan terhadap pemanasan. Penyari yang digunakan untuk mengekstraksi adalah metanol, karena metanol merupakan pelarut yang bersifat semi polar, dengan demikian metanol dapat menyari komponen-komponen kimia yang sifatnya polar maupun yang sifatnya non polar. Kumoro et al. (2009) menyatakan bahwa metanol merupakan pelarut yang terbaik dalam ekstraksi diterpenoid lakton dari A. paniculata dalam hal rendemen dan komponen yang dihasilkan tinggi, sedangkan etanol dan aseton juga merupakan pelarut yang mampu untuk mengekstrak andrographolide, namun hasilnya lebih kecil. c. Pemantauan Ekstrak Lakukan Kromatografi lapis tipis seperti yang tertera pada Kromatografi <61> dengan parameter sebagai berikut : Fase gerak : Kloroform P-metanol P (9:1) Fase diam : Silika gel 60 F254 Larutan uji : 5% dalam etanol P, gunakan Larutan uji KLT seperti yang tertera pada Kromatografi <61> Larutan pembanding : Andrografolid 0,1% dalam etanol P Volume penotolan : Totolkan 20 L Larutan uji dan 2 L Larutan pembanding Deteksi : UV254 d. Fraksinasi (metode ke-1) dan Alasan Pemilihan Metode Ekstrak metanol sambiloto diencerkan dengan air panas sebanyak 100 ml, diaduk terus sampai encer dan homogen, kemudian dimasukkan

dalam corong pisah, difraksinasi berturut-turut secara ekstraksi cair-cair dengan pelarut n-heksan dan etilasetat. Mula-mula difraksinasi dengan pelarut n-heksan sebanyak 150 ml. Diperoleh fraksi n-heksan dan fraksi air. Fraksi n-heksan dipisahkan, kemudian fraksi air difraksinasi dengan etilasetat sebanyak 100 ml, diperoleh fraksi etilasetat dan fraksi air. Ekstraksi setiap fraksi dilakukan sebanyak 3 kali dengan

menggunakan 50 ml pelarut untuk sekali penyarian. Sari pertama, kedua, dan ketiga dikumpulkan. Ekstrak hasil fraksinasi dipekatkan dengan penguap vakum.

e. Pemantauan Fraksi Ambil sedikit cuplikan dari fraksi yang telah dipekatkan untuk dilakukan uji Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dengan menggunakan fase gerak n-heksan dan etilasetat secara gradien. f. Fraksinasi (metode ke-2) dan Alasan Pemilihan Metode Fraksi etilasetat dipekatkan, kemudian dikrornatografi cair vakum dengan pelarut etil asetat dan n-heksan secara gradien. Sisa dari cuplikan ditambahkan 2 gram serbuk silika gel (adsorben) lalu diuapkan hingga kering. Dalam hal ini, bobot silika gel yang digunakan harus mempunyai bobot yang sama dengan ekstrak. Dengan demikian, silika gel tersebut akan tersalut ekstrak. Silica gel yang telah tersalut ekstrak harus diuapkan hingga benar-benar kering, karena jika tidak kering maka akan merusak proses pemisahannya. Silika gel yang telah tersalut ekstrak tersebut digerus sampai homogen, dikeringkan dan dimasukkan ke dalam kolom G-3 sampai setinggi 5 cm kemudian diratakan dan dipadatkan dengan bantuan vakum. Kemudian di lapisan paling atas ditutup dengan kapas. Sebelum vakum dijalankan, pelarut yang kepolarannya lebih rendah dituangkan ke permukaan adsorben kemudian vakum dijalankan. Elusi diawali dengan pelarut yang kepolarannya rendah lalu kepolaran ditingkatkan perlahan-lahan (polaritas meningkat) dengan harapan bahwa komponen kimianya terelusi secara berurutan berdasarkan tingkat kepolarannya.. Oleh karena itu, Kromatografi Cair Vakum menggunakan tekanan yang rendah untuk meningkatkan laju aliran fase gerak. Kolom

dihisap perlahan-lahan ke dalam wadah penampung fraksi sampai kering dengan cara memvakumkannya. g. Pemantauan Subfraksi Ambil sedikit cuplikan dari fraksi yang telah dipekatkan untuk dilakukan uji Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dengan menggunakan fase gerak n-heksan dan etilasetat secara gradien.

h. Pemurnian dan Uji Kemurnian Fraksi yang mengandung andrographolide selanjutnya dimurnikan dengan krornatografi kolorn dengan fasa gerak n-heksan dan etil asetat secara gradien. Fraksi yang diperoleh dipekatkan, kemudian didiamkan hingga terbentuk kristal dan disaring. Dilakukan rekristalisasi berulang dengan metanol panas hingga diperoleh andrographolide isolat, dimana jika diuji dengan KLT menunjukkan satu noda. Uji kemurnian isolat dilakukan dengan pengujian titik leleh.

i.

Karakterisasi dan Identifikasi Untuk mengidentifikasi kemudian andrografolida, maka perlu karakter dilakukan standart.

karakterisasi,

dibandingkan

dengan

Karakterisasi menggunakan KLT, spektrum IR, UV pada panjang gelombang 200-300 nm serta karakterisasi Resonansi Magnet Inti. Identifikasi andrographolide hasil isolasi dilakukan dengan

spektrofotometri FTIR, 1H - 13CNMR dan MS serta dibandingkan dengan andrografolida standar dari Aldrich.

3. Daftar Pustaka 1. Ratnani, R.D., Hartati, I., & Kurniasari, L. (2012). Potensi Produksi Andrographolide dari Sambiloto (Andrographis paniculata Nees) melalui Proses Ekstraksi Hidrotropi. Momentum, 8(1), 6-10. 2. Srijanto, B., Bunga P.O., Khojayanti, L., Rismana, L., & Sriningsih. (2012, Nopember). Pemurnian Ekstrak Etanol Sambiloto (Andrographis

paniculata Ness.) dengan Teknik Ekstraksi Cair-Cair. Jakarta: Pusat Teknologi Farmasi dan Medika-BPPT 3. Suharmiyati, & Handayani, L. (2001). Isolasi dan Identifikasi

Andrografolida dari Herba Andrographis paniculata Ness. Media Litbang Kesehatan, XI(2), 33-38. 4. Sukardiman, Rahman, A., Ekasari, W., & Sismindari. (2005). Induksi Apoptosis Senyawa Andrographolida dari Sambiloto (Andrographis paniculata Ness) terhadap Kultur Sel Kanker. Media Kedokteran Hewan, 21(3),105-110. 5. Yellita, Y., Cahyaningsih, U., Iswantini Pradono, D., Winarsih, W., & Manalu, W. (2011). Ekstrak Sambiloto Menurunkan Patogenitas Ookistan Eimeria Tenella. Jurnal Veteriner ISSN 1411-8327, 12(4), 307-318. 6. Widyawati, T. (2007). Aspek Farmakologi Sambiloto (Andrographis paniculata Nees). Majalah Kedokteran Nusantara, 40(3), 216-222. 7. http://www.plantamor.com/index.php?plant=96, diakses tanggal 25 Maret 2014. 8. http://moko31.wordpress.com/2010/06/08/kromatografi-cair-vakumdalam-skrining-fitokimia-daun-sambiloto-androgaphis-paniculata/, diakses tanggal 26 Maret 2014