BAB I

PENDAHULUAN
1.1.Latar Belakang
Bacillus sp merupakan bakteri Gram positif, berbentuk batang, dapat tumbuh pada kondisi aerob
dan anaerob. Sporanya tahan terhadap panas (suhu tinggi), mampu mendegradasi Xylandan karbohidrat
(Cowandan Stells, 1973). Bacillus spp mempunyai sifat: (1) mampu tumbuh pada suhu lebih dari 50 oC
dan suhu kurang dari 5 oC, (2) mampu bertahan terhadap pasteurisasi, (3) mampu tumbuh pada
konsentrasi garam tinggi (>10%), (4) mampu menghasilkan spora dan (5) mempunyai daya proteolitik
yang tinggi dibandingkan mikroba lainnya. Bacillus adalah salah satu genus bakteri yang berbentuk
batang dan merupakan anggota dari divisi Firmicutes. Bacillus merupakan bakteri yang bersifat aerob
obligat atau fakultatif, dan positif terhadap uji enzim katalase.
Bacillus secara alami terdapat dimana-mana, dan termasuk spesies yang hidup bebas atau bersifat
patogen. Beberapa spesies Bacillus menghasilkan enzim ekstraseluler seperti protease, lipase, amilase,
dan selulase yang bisa membantu pencernaan dalam tubuh hewan (Wongsa dan Werukhamkul, 2007).
Jenis Bacillus (B. cereus, B. clausii dan B. pumilus) termasuk dalam lima produk probiotik komersil
terdiri dari spora bakteri yang telah dikarakterisasi dan berpotensi untuk kolonisasi, immunostimulasi, dan
aktivitas antimikrobanya (Duc et al., 2004).
Beberapa penelitian telah berhasil mengisolasi dan memurnikan bakteriosin Bacillus sp. Gram
positif diantaranya yaitu subtilin yang dihasilkan oleh Bacillus subtilis (Kleinetal.1993), megacin yang
dihasilkan oleh B. megaterium (Tagg et al., 1976), coagulin dihasilkan oleh B. coagulans (Hyronimus,
1998), cerein dihasilkan oleh B. cereus (Oscariz dan Pisabarro, 2000), dan tochicin yang dihasilkan oleh
B. thuringiensis (Paik et al., 1997).
Bakteriosin merupakan zat antimikroba berupa polipeptida, protein, atau senyawa yang mirip
protein. Bakteriosin disintesis diri bosom oleh bakteri selama masa pertumbuhannya dan umumnya hanya
menghambat pertumbuhan galur-galur bakteri yang berkerabat dekat dengan bakteri penghasil bakteriosin
(Kone & Fung, 1992). Menurut Tagg et al., (1976), kriteria yang merupakan ciri-ciri bakteriosin adalah
sebagai berikut: (1) memiliki spektra aktivitas yang lebih sempit, (2) senyawa aktif merupakan
polipeptida atau protein, (3) bersifat bakterisida, (4) mempunyai reseptor spesifik pada sel sasaran, 5) gen
determinan terdapat pada plasmid. Senyawa antibiotik yang dihasilkan Bacillus sp adalah basitrasin,
pumulin, laterosporin, gramisidin, dan tirocidin yang efektif melawan bakteri Gram positif serta kolistin
1

dan polimiksin bersifat efektif melawan bakteri Gram negatif. Sedangkan difficidin memilikis pektrum
lebar, mikobacilin dan zwittermicin bersifat antijamur (Todar, 2005).

1.2 Rumusan Masalah

1.
2.
3.
4.
5.

Apa karakteristik dan jenis (spesies) bakteri Bacillus sp ?

Bagaimana patogenitas dan penyakit yang ditimbulkan bakteri Bacillus sp?
Apa sumber, asal, penyebaran dan penularan bakteri Bacillus sp?
Bagaimana pencegahan dan pengobatan bakteri Bacillus sp?
Bagaimana diagnosis laboratorium (bahan pemeriksaan, isolasi, identifikasi) bakteri Bacillus sp?

1.1 TUJUAN
1. Menjelaskan tentang karakteristik dan jenis (spesies) bakteri
2. Menjelaskan tentang patogenitas dan penyakit yang ditimbulkan
3. Menjelaskan sumber, asal, penyebaran dan penularan
4. Menjelaskan pencegahan dan pengobatan
5. Menjelaskan diagnosis LAB (bahan pemeriksaan, isolasi dan identifikasi)

BAB II
2

PEMBAHASAN
2.1 KARAKTERISTIK DAN JENIS (SPESIES) BAKTERI
Secara umum kelompok Bacillus merupakan bakteri berbentuk batang (basil), dan tergolong
dalam bakteri gram positif yang umumnya tumbuh pada medium yang mengandung oksigen (bersifat
aerobik) sehingga dikenal pula dengan istilah aerobic sporeformers. Kebanyakan anggota genus Bacillus
dapat membentuk endospora yang dibentuk secara intraseluler sebagai respon terhadap kondisi
lingkungan yang kurang menguntungkan, oleh karena itu anggota genus Bacillus memiliki toleransi yang
tinggi terhadap kondisi lingkungan yang berubah-ubah.
Bakteri Bacillus sp. biasanya banyak ditemukan di tanah. Cara untuk mendapatkan bakteri
Bacillus sp. yaitu dengan mengambil sampel tanah menggunakan sendok yang telah disterilisasikan
terlebih dahulu kemudian ambil tanah sekitar kedalaman 3 cm dari permukaan tanah. Bacillus sp.
merupakan bakteri gram positif dengan sel batang berukuran 0,3-22x1,27-7 m, sebagian bersifat motil
(gerak) mobilitasnya ini disebabkan oleh flagel, jika dipanaskan akan membentuk endospora, yaitu bentuk
dorman sel vegetatif sebagai bentuk pertahanan diri yang muncul saat kondisi ekstrim yang
tidak menguntungkan bagi bakteri.
Letak endospora dalam sel ukuran selama pembentukannya tidak sama antara spesies satu dengan
lainnya. Beberapa spesies memiliki spora sentral, terminal, atau letal. Endospora dapat berbentuk oval,
silindris, bulat, atau lainnya. Untuk memastikan bahwa koloni-koloni tersebut adalah Bacillus, maka
dilakukan serangkaian pengujian yang bersifat spesifik yaitu pengecetan gram, pengecetan negatif dan
motilitasnya. Bacillus dibedakan dari anggota familia Bacillaceae lainnya berdasarkan sifat-sifatnya yaitu:
keseluruhannya merupakan pembentuk spora, hidup pada kondisi aerob baik sebagai jasad yang
sepenuhnya aerob maupun aerob fakultatif, selnya berbentuk batang, dan memproduksi katalase.
Kebanyakan anggota genus Bacillus adalah organisme saprofit yang lazim terdapat dalam tanah,
air, udara, dan tumbuh-tumbuhan, seperti Bacillus cereus dan Bacillus subtilis. Beberapa di antaranya
patogen bagi insekta. Bacillus cereus dapat tumbuh pada makanan dan menghasilkan enterotoksin yang
menyebabkan keracunan makanan. Organisme ini kadang-kadang dapat menimbulkan penyakit pada
orang fungsi imun yang terganggu (misalnya meningitis, endokarditis, endoftalmitis, konjungtivitis, atau
gastroenteritis akut). Seperti Bacillus anthracis, penyebab antraks adalah bakteri patogen utama genus ini

2.1.1 Bacillus anthracis

Batang dengan ukuran 1 x 3-4 m, dapat tersusun dengan seperti bambu, bentuk batangnya
persegi atau cekung ujungnya, sendiri-sendiri, berpasangan atau membentuk rantai pendek, tidak
bergerak, berspora oval yang letaknya sental, kadang-kadang berkapsul. Bacillus anthracis adalah
bakterium Gram-positif berbentuk tangkai yang berukuran sekitar 1x6 mikrometer dan merupakan
penyebab penyakit antraks.B. anthracis adalah bakterium pertama yang ditunjukkan dapat menyebabkan
penyakit. Hal ini diperlihatkan oleh Robert Koch pada tahun 1877. Nama anthracis berasal dari bahasa
Yunani anthrax (), yang berarti batu bara, merujuk kepada penghitaman kulit pada korban.Bakteria
ini umumnya terdapat di tanah dalam bentuk spora, dan dapat hidup selama beberapa dekade dalam
bentuk ini. Jika memasuki sejenis herbivora, bakteria ini akan mulai berkembang biak dalam hewan
tersebut dan akhirnya membunuhnya, dan lalu terus berkembang biak di bangkai hewan tersebut. Saat
gizi-gizi hewan tersebut telah habis diserap, mereka berubah bentuk kembali ke bentuk spora.Bacillus
anthracis mempunyai gen dan ciri-ciri yang menyerupai Bacillus cereus, sejenis bakterium yang biasa
ditemukan dalam tanah di seluruh dunia, dan juga menyerupai Bacillus thuringiensis, pantogen kepada
larva Lepidopt.

2.1.2 Bacillus cereus

Bacillus cereus merupakan salah satu anggota genus Bacillus yang pertama kali diisolasi pada
tahun 1969 dari darah dan cairan pleura pasien pneumonia. Bacillus cereus memiliki beberapa karakter
morfologi diantaranya: gram positif dengan lebar sel 0,9 1,2 m dan panjang 3 5 m. motilitas
positif, spora elipsoidal, sentral atau parasentral, spora jarang keluar dari sporangia. Tidak membentuk
kapsul, biasanya muncul dalam bentuk rantai panjang tipe R. Bentuk koloni irregular, opague terkadang
waxy. Pada medium cair membentuk turbiditas moderate
4

Sel vegetatif dari Bacillus cereus dapat tumbuh pada rentang temperatur 5 50 oC dengan
temperatur optimal antara 35 - 40 oC, resisten terhadap pH 4,59,3. Dapat tumbuh pada anaerobic agar
dan nutrien broth dan penambahan NaCl 7%, nutritive agar serta nutritive agar dengan 7 10 % darah
domba. Waktu generasi relatif singkat, antara 20 30 menit. Dalam medium GA, Bacillus cereus telah
mencapai fase eksponensial pada 6 jam inkubasi dan mencapai fase stasioner 20 jam setelah inkubasi.
Bacillus cereus memiliki karakter yang mirip dengan Bacillus thuringiensis dan Bacillus
anthracis, namun tetap dapat dibedakan berdasarkan determinasi motilitas (kebanyakan Bacillus cereus
bersifat motil) dan adanya kristal toxin (hanya dihasilkan oleh B. thuringiensis), aktivitas hemolisis (B
cereus memiliki sifat ini, sedangkan B. anthracis bersifat non-hemolitik).
Beberapa strain dari Bacillus cereus bersifat patogen dan berbahaya bagi manusia karena dapat
menyebabkan foodborne illness, namun beberapa diantaranya yang bersifat saprofitik dapat bermanfaat
sebagai probiotik dan juga penghasil antibiotik yang potensial. Bacillus cereus kebanyakan ditemukan
terkandung dalam bahan pangan dan menyebabkan 2 tipe keracunan makanan: 1) emetic yang merupakan
keracunan yang dimediasi oleh toksin yang sangat stabil yang dapat bertahan pada temperatur tinggi, pH
ekstrim serta tahan terhadap enzim pencernaan seperti: trypsin, pepsin. 2) diarrhoeal yang dimediasi oleh
enterotoksin yang labil terhadap panas dan asam. Bacillus cereus merupakan mikroorganisme yang dapat
tumbuh pada kisaran temperatur yang luas dan terdapat strain yang tergolong psychrophilic hingga
thermophilic. Karena kebanyakan strain Bacillus cereus hidup dalam gastro-intestinal dan menyebabkan
infeksi diarrhoeal, maka temperatur 37oC merupakan temperatur pertumbuhan yang optimal.

2.1.3 Bacillus subtilis

Karakter
Bentuk
Gram
Sumber
Berdasarkan spora
Respirasi
Pergerakan
Suhu Optimum Pertumbuhan
pH Optimum Pertumbuhan
Katalase

Bacillus Subtilis
Batang (tebal maupun tipis), rantai maupun
tunggal
Positif
tanah, air, udara dan materi tumbuhan yang
terdekomposisi
Bakteri penghasil endospora
Aerob obligat
Motil dengan adanya flagella
25-350C
7-8
Positif

2.2 PATOGENITAS DAN PENYAKIT YANG DITIMBULKAN

2.2.1 Bacillus anthracis
Patogenitas
Antraks terutama merupakan penyakit pada biri-biri, sapi, kuda, dan hewan lainnya;
manusia jarang terserang. Infeksi biasanya didapat dengan masuknya spora melalui lukapada kulit
atau selaput lendir, jarang dengan inhalasi spora ke dalam paru-paru. Eksudat antraks mengandung
polipeptida yang identik dengan polipeptida pada simpai Bacillus, dan dapat menimbulkan reaksi
histologik yang sama seperti reaksi akibat infeksi antraks. Protein lain yang diisolasi dari eksudat
merangsang kekebalan yang kuat terhadap antraks bila disuntikkan pada hewan
Penyakit
Bacillus anthracis merupakan bakteri penyebab penyakit antraks yang biasanya menyerang
hewan ternak. Namun pada perkembangannya penyakit dapat menular ke manusia melalui luka
dan juga makanan.
2.2.2 Bacillus cereus
Patogenitas
Bacillus cereus bertanggung jawab untuk sebagian kecil penyakit bawaan makanan(2-5%),
menyebabkan mual, muntah parah dan diare penyakit bawaan makanan.Terjadi karena
6

kelangsungan hidup hidup endospora bakteri ketika makanan tidak benar matang.Memasak suhu
kurang dari atau sama dengan 100 c memungkinkan beberapa spora Bacillus cereus untuk
bertahan hidup.Masalah ini diperparah ketika makanan makanan tidak benar didinginkan,yang
memungkinkan endospora untuk berkecambah.
Penyakit
Penyakit dengan gejala diare (tipe diare) disebabkan oleh protein dengan berat molekul
besar, sementara penyakit dengan gejala muntah (tipe emetik) diyakini disebabkan oleh peptida
tahan panas dengan berat molekul rendah.
Gejala-gejala keracunan makanan tipe diare karena Basillus cereus mirip dengan gejala
keracunan makanan yang disebabkan oleh Clostridium perfringens. Diare berair, kram perut, dan
rasa sakit mulai terjadi 6-15 jam setelah konsumsi makanan yang terkontaminasi. Rasa mual
mungkin disertai diare, tetapi jarang terjadi muntah (emesis). Pada sebagian besar kasus, gejalagejala ini tetap berlangsung selama 24 jam.

2.2.3 Bacillus subtilis

Patogenitas dan Penyakit
Bacillus subtilis merupakan kelompok bakteri enterobacteriaceae yang hidup di dalam
saluran pencernaan manusia sebagai penghuni usus (enteron) dan bersifat patogen. Bakteri B.
subtilis dapat menyebabkan kerusakan pada makanan kaleng yang juga dapat mengakibatkan
gastroenteritis pada manusia yang mengkonsumsinya. Penyakit infeksi hingga saat ini masih
menjadi masalah kesehatan masyarakat, penyakit ini merupakan penyebab kematian manusia
sepanjang sejarah

2.3 SUMBER DAN PENYEBARAN PENULARAN

2.3.1 Bacillus anthracis
Pada hewan, yang menjadi tempat masuknya kuman adalah mulut dan saluran cerna. Sumber
utama infeksi adalah tanah dan air.dalam beberapa kejadian penyakit terbukti bahwa bahan pakan yang
tercemar oleh spora dan kuman, terutama tepung tulang yang ditambahkan ke dalam ransum
menyebabkan terjadinya wabah antraks. Pada kebanyakan kasus antraks terjadi pada waktu ternak
7

digembalakandi padang rumput. Padang rumput yang baru saja menerima air berlebihan dari daerah lain
merupakan padang penggembalaan yang berbahaya.
Adapun pada manusia penularan penyakit antraks seringnya melalui hal-hal sebagai berikut :
Kontak langsung dengan bibit penyakit yang ada di tanah/rumput, hewan yang sakit, maupun bahanbahan yang berasal dari hewan yang sakit seperti kulit, daging, tulang dan darah.
Bibit penyakit terhirup orang yang mengerjakan bulu hewan (domba dll) pada waktu mensortir. Penyakit
dapat ditularkan melalui pernapasan bila seseorang menghirup spora Antraks.
Memakan daging hewan yang sakit atau produk asal hewan seperti dendeng, abon dll
2.3.2 Bacillus cereus
Bila seseorang menelan bakteri atau bentuk sporanya, kemudian bakteri bereproduksi dan
menghasilkan toksin di dalam usus, atau seseorang mengkonsumsi pangan yang telah mengandung toksin
tersebut. Ada dua tipe toksin yang dihasilkan oleh
Bacillus cereus, yaitu toksin yang menyebabkan diare dan toksin yang menyebabkan muntah (emesis).
Gejala keracunan:
Bila seseorang mengalami keracunan yang disebabkan oleh toksin penyebab diare, maka gejala
yang timbul berhubungan dengan saluran pencernaan bagian bawah berupa mual, nyeri perut
seperti kram, diare berair, yang terjadi 8-16 jam setelah mengkonsumsi pangan.
Bila seseorang mengalami keracunan yang disebabkan oleh toksin penyebab muntah, gejala yang
timbul akan bersifat lebih parah dan akut serta berhubungan dengan saluran pencernaan bagian
atas, berupa mual dan muntah yang dimulai 1-6 jam setelah mengkonsumsi pangan yang tercemar.
Bakteri penghasil toksin penyebab muntah bisa mencemari pangan berbahan beras, kentang
tumbuk, pangan yang mengandung pati, dan tunas sayuran. Sedangkan bakteri penghasil toksin
penyebab diare bisa mencemari sayuran dan daging.
2.3.3 Bacillus subtilis
Media perantara pertumbuhan Bacillus subtilis antara lain adalah tanah, air, udara dan materi
tumbuhan yang terdekomposisi. Selain itu, B.subtilis juga ditemukan pada produk makanan seperti

produk susu, daging, nasi dan pasta. Bakteri ini dapat tumbuh pada produk makanan karena produkproduk makanan tersebut menyediakan nutrisi yang baik untuk pertumbuhan B.subtilis.

2.4 PENCEGAHAN DAN PENGOBATAN

2.4.1 Bacillus anthracis
Pencegahan
Tanah tercemar oleh spora antraks dari bangkai hewan. Spora-spora ini dapat tetap hidup selama puluhan
tahun. Mungkin spora dapat tumbuh dalam tanah pada pH 6,5 pada suhu yang cocok. Hewan merumput yang
terinfeksi melalui luka pada selaput lendir menjadi penyambung rantai infeksi terus-menerus. Kontak
dengan hewan yang terinfeksi atau dengan kulit, rambut dan bulunya merupakan sumber infeksi pada
manusia.
Tindakan pencegahan dan pengendalian meliputi:

Pembuangan bangkai hewan dengan membakar atau mengubur pada sumur yang dalam disertai
kapur , Dekontaminasi produk-produk hewan (biasanya dengan autoklaf), Baju dan sarung tangan
pelindung waktu mengenai bahan-bahan yang mungkin tercemar, Imunisasi aktif hewan peliharaan
dengan vaksin hidup yang dilemahkan. Orang yang mempunyai resiko besar karena pekerjaanya harus diimunisasi
dengan vaksin bebas-sel yang dapat diperoleh dari Centers for Disease Control, Atlanta, GA 30333.

Pengobatan

Banyak antibiotika efektif terhadap antraks pada manusia, tetapi pengobatan harus dimulai sedini
mungkin. Penisilin cukup memuaskan, kecuali pada pengobatan antraks pernapasan, dimana mortilitas
tetap tinggi. Beberapa basil Gram-positif lainnya mungkin resisten terhadap penisilin karena membentuk
-laktamase. Tetrasiklin, eritromisin, atau clyndamicin mungkin efektif.
2.4.2 Bacillus cereus

Pencegahan

Pencegahan secara total mungkin tidak dapat dilakukan. Namun demikian, makanan yang dimasak,
dipanaskan, dan disimpan dengan benar umumnya aman dari racun yang menyebabkan muntah. Resiko paling besar
yaitu kontaminasi silang.
9

Pengobatan

Pengobatan diare dapat dilakukan dengan sistem pengobatan simtomatik ( atau menghilangkan rasa
sakit ) dan pengobatan kausatif . untuk pengobatan kausatif kuman penyebabnya dimatikan dengan zat
anti bakteri . tujuan dari pengobatan adalah mengurangi terjadinya infeksi terhadapat manusia dari bakteri
Bacillus cereus .
2.4.3 Bacillus subtilis

Pencegahan

Menjaga sanitasi diri dan lingkungan karena bakteri ini dapat mencemari makanan .

Pengobatan

Pengobatan jarang dilakukan karena bakteri hanya mencemari makanan tanpa menimbulkan keracunan
makanan dan penyakit lain yang berkelanjutan .

2.5 DIAGNOSA LABORATORIUM

2.5.1 Bacillus anthracis
a) Bahan : Cairan atau nanah dari lesi lokal, darah, dahak.
b) Pewarnaan Sediaan : Dari lesi lokal atau darah hewan yang mati; rantai bakteri terbentuk batang besar
Gram-positif sering terlihat. Antraks dapat diidentifikasi pada sediaan kering dengan teknik pewarnaan
imunofluoresensi.
c) Biakan : Bila dibiakkan pada lempeng agar darah, organisme ini membentuk koloni kelabu non
hemolitik dengan morfologi mikroskopis yang khas. Peragian karbohidrat tidak bermanfaat. Pada
perbenihan setengah padat, basil antraks selalu tidak bergerak, sedangkan organisme tidak patogen
yang sejenis (misalnya : Basillus cereus) menunjukkan pergerakkan dengan menyebar. Biakan
antraks virulen mematikan mencit atau marmot bila disutikkan secara intra peritoneal.
d) Tes serologi : Antibodi penyebab presipitasi atau hemaglutinasi dapat diperlihatkan dalam serum orang
atau hewan yang telah divaksinasi atau terinfeksi.

10

2.5.2 Bacillus cereus

Bacillus cereus non pathogen menunjukkan pergerakan dengan penyebaran(swarming) pada media
kultur setengah padat. Sel vegetatif dari Bacillus cereus dapat tumbuh pada rentang temperatur 5 50 C
dengan temperatur optimal antara 35 - 40 C, resisten terhadap pH 4,5 9,3. Dapat tumbuh pada aerobic
agar dan nutrien broth dan penambahan NaCl 7%, nutritive agar serta nutritive agar dengan 7 10 % darah
domba.Waktu generasi relatif singkat, antara 20 30 menit.
2.5.3 Bacillus subtilis

2.6 ISOLASI DAN IDENTIFIKASI

2.6.1 Alat
Jarum ose
Objeck glass
Mikroskop
Mikrometer
Kertas merang
Tabung reaksi
Pipet tetes
Beaker glass
Cawan petri
Oven
Pembakar spirtus
11

Inkubator
Wrapper
2.6.2 Bahan
Aquadest
Alkohol 70%
Aluminium foil
Medium Nutrient Agar (NA)
Nitrat Broth (NB)
Malachite Green
Sterch Agar (SA)
Semisolid
Skim Milk Agar
Simon citrat
MR-VP Broth
KOH Alfanaptol
Reagen A dan B
NB 0%
NB + Nacl(6,5% dan 10 %)
Kristal violet
Lugol iodine
Safranin
Etanol 96%
Reagen H2O2
Media rafinosa
Laktosa
Reagen oksidase
2.6.3 Metode

Hari 1
Spesimen ditanam pada Blood agar plate dan Mac conkey
Hari II
Koloni yang tersangka dari Blood agar plate dicat gram.kalau ditemukan gram (+) batang
kemudian ditanam pada media gula dan media lainnya.Masuk inkubator 37c 24 jam.(hasil pada

hari III)
Hari III
Dibaca dan dicatat pertumbuhan pada media gula dan media lainnya,dilakukan test kimia.

2.6.4 Cara Kerja

a. Pengambilan sampel
1. Tanah diambil secara aseptik
12

2. Aluminium foil disiapkan yang sebelumnya disterilkan terlebih dahulu dengan alkohol 70%
3. Sampel diambil dengan cepat dan dengan hati-hati dimasukan kedalamaluminium foil steril
kemudian ditutup rapat.

b. Tahap isolasi Bacillus

1. Preparasi suspensi dilakukan
2. Sampel tanah dimasukkan kedalam tabung pengencer pertama
3. Sampel tanah direbus pada suhu 80oC selama 10 menit
c. Tahap pemurniaan dengan metode streak kuadran
1. Dipilih salah satu koloni yang nampak terdiri dari satu tipe sel
2. Jarum ose dibakar,setelah dingin disentuhkan ke permukaan koloni bakteri yang akan distreak pada
plating NA
3. Streak ini dianggap sebagai streak primer pada permukaan NA
4. Jarum ose dibakar, diangkat lalu didinginkan dan disterilkan melalui streak primer kesatu atau
kedua dan kemudian dilanjutkan ke streak sekunder tanpa ke streak primer
5. Jarum ose dibakardiangkat lalu didinginkan melewati streak sekunder dan kemudian dilanjutkan ke
streak tersier tanpa kembali ke streak primer dansekunder,inkubasi pada suhu 30oc selama 2x24 jam
d. Pengamatan morfologi
1. Dibuat biakan pada media NA
2. Diinkubasi 2x 24 jam pada suhu 30oc
3. Diamati perbedaan bentuk koloni,ukuran,margin elevasi,dan permukaan
e. Pengukuran panjang dan lebar sel
1. Disiapkan mikroskop yang telah dipasang mikrometer okuler yang sudah terkalibrasi
2. Dibuat preparat ulas bakteri uji dengan metode pewarnaan sederhana menggunakan pewarnaan
Methylen Blue
3. Diukur panjang dan leher sel kemudian dihitung panjang dan leher sel sebenarnya
f. Uji pewarnaan gram
1. Dibuat ulasan bakteri pada objek glass kemudian diinkubasi
2. Ditetesi dengan Kristal violet biarkan selama 60 detik
3. Dicuci dengan air mengalir lalu keringkan
4. Ditetesi dengan lugol iodine dibiarkan selama 60 detik
5. Dicuci dengan air mengalir lalu keringkan
6. Dicuci dengan ethanol 96% setes demi setetes sampai etanol yang jatuh berwarna bening
7. Ditetesi dengan safranin dibiarkan selama 45 detik,dicuci lalu keringkan
8. Diamati dibawah mikroskop
g. Uji pewarnaan Endospora
13

1. Dibuat ulasan bakteri pada objek glass lalu ditutupi dengan kertas merang
2. Ditetesi dengan Malachite green diatas kertas merang dan diletakkan
diatas air mendidih
3. Dibiarkan lama selama 5 menit,jika pinggiran mulai mengering ditambahkan lagi malachite green
h. Uji motilitas
1. Diinokulasi bakteri uji pada medium SIMA semisolid sebanyak 1 ose
2. Diinkubasi selama 2x 24 jam pada temperatur 30oc
3. Dilihat pertumbuhan koloni bakterinya yang ada pada amedium SIMA semisolid
i.Uji hidrolisi starch
1. Diinokulasi bakteri uji pada medium padat starch agar sebanyak 1 ose
2. Diikubasi selama 2x 24 jam pada temperatur 30oC
3. Permukaan media ditetesi dengan larutan lugol iodine
4. Diamati perubahan yang terjadi,jika berbentuk zona jernih (warna biru reagen) menandakan hasil
uji negatif

j. Uji hidolisis kasein

1. Diinokulasi bakteri uji pada medium padat SMA sebanyak 1 ose
2. Diinkubasi selama 2x 24 jam pada suhu 30oc
3. Diamati perubahan yang terjadi,jika terbentuk zona jernih disekitar koloni menandakan hasil uji
positif dan jika warna media tetap menandakan hasil uji negatif
k. Uji katalase
1. Dibuat preparat ulas bakteri pada objek glass
2. Ditetesi dengan larutan H2O2
3. Diamati perubahan yang terjadi
l. Uji MR-VP
1 Diinokulasikan bakteri uji paad medium cair MR-VP sebanyak 1 ose
2 Diinkubasi selama 2x 24 jam pada suhu 30oc
3 Bakteri ditetesi dengan alfanaftol 3 tetes dan KOH 40% 2 tetes
4 Diamati perubahan yang terjadi,jika media berubah menjadi merah muda sampai dengan merah
setelah penambahan alfanaftol dan KoH 40 % menandakan hasil uji positif, dan jika tidak
terbentuk warna tersebut makan menandakan hasil uji negatif.
m. Uji oksidase
1. Dibuat preparat ulas bakteri pada objek glass,ditutup dengan potongan tissue
2. Ditetesi dengan reagen oksidase
3. Diamati perubahan yang terjadi
4. Hasil positif jika berwarna biru marun , hasil uji negatif yaitu tidak terbentuk warna biru marun.

n. Uji penggunaan sitrat

1. Diinokulasi bakteri uji padamedium agar miring Simon citrate sebanyak 1 ose
14

2. Diinkubasi selama 2x 24 jam pada temperatur 30oc

3. Diamati perubahan yang terjadi,jika hasil positif media berwarna biru dan jika hasil negatif media
berwarna hijau.
o. Uji gula
1. Bakteri uji ditumbuhkan pada medium Rafinosa dan laktosa
2. Diinkubasi selama 2 x 24 jam pada suhu 30oc
3. Diamati perubahannya,hasil positif jika media berubah warna dari ungu menjadi kuning dan hasil
negatif jika media tetap berwarna ungu.
p. Uji reduksi nitrat
1. Diinokulasikan bakteri uji pada medium cair Nitrate Broth sebayak 1 ose
2. Diinkubasi selama 2x 24 jam pada suhu 30oc
3. Diteteskan 1 mL nitrat reagen a dan dilanjutkan dengan nitrate reagen b
4. Hasil positif jika terbentuk warna merah tua / merah gelap,jika belum terbentuk warna merah,
ditambahkan bubuk seng (sampai dengan 5mg/ml media) dan diamati jika terbentuk warna merah
maka hasil pengujian positif.
q. Uji toleransi Nacl
1. Dibuat tiga buah tabung nutrient broth yang mengandung Nacl 0%,6,5% dan10%.
2. Isolat diinokulasikan dengan streak kontinyu
3. Diinkubasi selama 2x 24 jam pada suhu 30oc
4. Diamati hasilnya dengan melihat tingkat kekeruhan pada media

DIAGNOSA LAB
Identifikasi species Bacillus sp
Alat :
1. Jarum ose
2. Objeck glass
3. Mikroskop
4. Inkubator
5. Pipet tetes
6. Pembakar spirtus
Bahan :
1. Sampel ( darah , nanah , dsb)
2. media agar darah
3. perlengkapan perwarnaan gram seperti : kristal violet , lugol iodine , safranin .
15

4. media uji gula - gula .

Cara kerja :

1. Hari I :
specimen ditanam pada blood agar plate . masukan ke inkubator suhu 37 derajat celcius
selama 24 jam . ( hasil pada hari ke 2)
2. Hari II
koloni tersangka dari blood agar plate dicat pada pewarnaan gram . kalau ditemukan gram (+) batang
kemudian ditanam pada media gula ( hasil pada hari IV )
Cara penanaman uji gula - gula :
1. tanam bakteri pada media gula - gula dengan cara aseptik
2. diinkubasi selama 2x24 jam pada suhu 30 derajat celcius
3. Diamati perubahannya hasil positif jika media berubah warna dari ungu menjadi kuning dan
hasil negatif jika media berwarna ungu
interpretasi hasil
No

Species
1.
2.
3.

B.anthacis
B. Cereus

Glukosa

Laktosa

+
+
-

B. subtilis

16

Mannitol
+

Maltosa
+
+
+/-

Sukrosa
+
+/+

KESIMPULAN
Secara umum kelompok Bacillus merupakan bakteri berbentuk batang (basil), dan tergolong
dalam bakteri gram positif yang umumnya tumbuh pada medium yang mengandung oksigen (bersifat
aerobik) sehingga dikenal pula dengan istilah aerobic sporeformers. Kebanyakan anggota genus Bacillus
dapat membentuk endospora yang dibentuk secara intraseluler sebagai respon terhadap kondisi
lingkungan yang kurang menguntungkan, oleh karena itu anggota genus Bacillus memiliki toleransi yang
tinggi terhadap kondisi lingkungan yang berubah-ubah.
Bacillus sp memiliki ciri-ciri morfologi sebagai berikut :koloni bakteri berbentuk bulat atau
circular,berukuran sedang atau moderate, elevasi convex , permukaan halus mengkilap, dan margin
entre.Lebar sel Bacillus sebenrnya 2,5 sedangkan panjang sel sebenarnya 2,5.Hasil uji positif yaitu uji
pewranaan gram, pewarnaan endospora, ujihidrolisi starch, uji hidrolisis kasein, uji VP, uji katalase, dan
uji oksidase.Hasil uji negatif yaitu uji laktose dan raffinosa, uji motilitas, ujipenggunaan sitrat, dan uji
toleransi Nacl.

DAFTAR PUSTAKA

17

ABIS encyclopedia, 2009. Bacillus cereus. http://www.tgw1916.net/ABIS/ encyclopedia. html. diakses: 20

Februari 2010.
Buda. G. 2009. Bacillus Cereus. http://wvlc.uwaterloo.ca/biology447/assign 2000/buda/ assignment2.htm .
diakses: 20 Februari 2010.

Sri Wulandari Nursal dan Wildan Sukma Juwita.2006. Bioaktifitas Ekstrak Jahe (Zingiber
officinale Roxb.) dalam Menghambat Pertumbuhan Koloni Bakteri Escherichia coli dan
Bacillus subtilis.Jurnal Biogenesis Vol. 2(2):64-66. Laboratorium Pendidikan Biologi PMIPA
FKIP Universitas Riau.Riau.

Lampiran
IDENTIFIKASI DAN STUDI AKTIVITAS PROTEASE
18

Bacillus sp ASAL LIMBAH CAIR RUMAH POTONG AYAM TRADISIONAL SEBAGAI

KANDIDAT PENGHASIL BIODETERJEN
IDENTIFY AND STUDY OF Bacillus Sp PROTEASE ACTIVITY LIQUID WASTE OF
TRADITIONAL POULTRY SLAUGHTER HOUSE TO PRODUCE BIODETERGENT
Mohammad H. Yusufa, Masdiana C. Padaga, Dyah A. Octavianie
Program Studi Pendidikan Dokter Hewan Program Kedokteran Hewan Universitas Brawijaya
hartantoyusufa@yahoo.co.id
ABSTRAK
Bacillus sp merupakan salah satu bakteri yang dapat ditemukan pada limbah cair Rumah Potong Ayam
(RPA) tradisional. Bacillus sp adalah bakteri yang mampu menghasilkan protease dalam jumlah besar.
Protease merupakan salah satu enzim yang dibutuhkan dalam industri bidoterjen Tujuan penelitian ini
adalah untuk mengidentifikasi dan melakukan studi aktivitas protease Bacillus sp asal limbah cair RPA
tradisional sebagai kandidat penghasil biodeterjen. Penelitian ini dilakukan dengan melakukan isolasi
bakteri, identifikasi Bacillus sp, dan uji aktivitas protease Bacillus sp secara kualitatif dan kuantitatif.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa enam isolat Bacillus sp berhasil diisolasi dan dikarakterisasi dari
limbah cair RPA tradisional. Empat dari enam Bacillus sp mampu menunjukkan aktivitas protease secara
kualitatif. Hasil uji kuantitatif aktivitas protease menghasilkan satu isolat Bacillus sp yang mampu
menunjukkan aktivitas protease tertinggi sebesar 0,117 U/ml. Protease yang dihasilkan termasuk dalam
kategori cukup tinggi dan memiliki potensi untuk dikembangkan sebagai biodeterjen.
ABSTRACT
Bacillus sp is one of bacteria which is found in liquid waste of traditional poultry slaughter house.
Bacillus sp can produce protease in considerable high amount. Protease is known as enzyme needed for
biodetergent industry. This research was aimed was to identify and study Bacillus sp protease activity in
liquid waste of traditional poultry slaughter house to produce biodetergent. The research steps were
consisted of bacteria isolation, Bacillus sp identification, and protease activity test both qualitatively and
quantitatively. The results showed that six isolates were found in liquid waste of traditional poultry
slaughter house. Four of six isolates show protease activity. The highest protease activity was 0.117 U/ml
indicated that the isolate has the potency to be used as biodetergent producer.
Keywords : Poultry Slaughter House, Bacillus sp, Protease, Biodetergent

19

PENDAHULUAN
Rumah Potong Ayam (RPA) merupakan salah satu
industri di bidang peternakan yang bergerak dalam
fungsi pemotongan ayam hidup dan mengolah
menjadi karkas yang siap konsumsi (Singgih dan
Kariana, 2008). Dampak negatif dari industri ini
yaitu menghasilkan limbah berbentuk padat dan
cair. Menurut Del and Damianovic dalam Tarntip
dan Thungkao (2011), pemotongan ayam akan
menghasilkan limbah cair terutama di proses
pemotongan dan pencucian karkas. Kandungan
limbah cair RPA diantaranya adalah limbah kimiafisik dan mikrobiologi. Mikroba yang terkandung
dalam limbah cair RPA diantaranya adalah
Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, dan
Lysinibacillus fusiformis (Tarntip dan Thungkao,
2011).
Menurut Baehaki (2011), Bacillus sp merupakan
salah satu jenis bakteri yang memiliki kemampuan
untuk menghasilkan protease. Protease merupakan
satu diantara tiga kelompok enzim komersial yang
diperdagangkan sebagai katalisator hayati.
Protease dimanfaatkan dalam berbagai aplikasi
industri pangan dan non-pangan. Salah satu
industri non-pangan yang memanfaatkan protease
adalah industri biodeterjen.
Biodeterjen adalah zat pencuci yang
memanfaatkan enzim sebagai bahan aktif utama.
Saat ini, penggunaan biodeterjen telah mencapai
hampir di seluruh dunia karena memiliki kelebihan
dibandingkan dengan deterjen sintetik. Biodeterjen
lebih ramah lingkungan dibandingkan dengan
deterjen sintetik. Hal ini didasarkan bahwa
komponen utama biodeterjen adalah protease yang
bersifat efisien, selektif dan mengkatalisis reaksi
tanpa produk samping (Naiola, 2002). Kebutuhan
biodeterjen yang meningkat menyebabkan
peningkatan terhadap kebutuhan protease. Oleh
karena itu, perlu adanya pengembangan produksi
protease yang mudah serta biaya yang relatif
rendah.
Menurut Naiola (2002), penggunaan
mikroorganisme untuk produksi protease memiliki
beberapa kelebihan diantaranya mudah diproduksi
dalam skala besar, waktu produksi relatif pendek
serta dapat diproduksi berkesinambungan dengan
biaya yang relatif rendah. Salah satu

mikroorganisme yang termasuk dalam kategori di

atas adalah Bacillus sp. Berdasarkan penelitian
Tarntip dan Thungkao (2011) telah ditemukan
isolat Bacillus sp asal limbah cair RPA sebagai
biomeulsifier serta memiliki sifat proteolitik dan
lipolitik. Oleh karena itu, pada penelitian ini
dilakukan identifikasi dan studi aktivitas protease
Bacillus sp asal limbah cair RPA tradisional untuk
mengetahui potensinya sebagai penghasil
biodeterjen.
MATERI DAN METODE
Alat dan Bahan
Bahan yang diperlukan adalah Pepton HIMEDIA
REF RM 001-500G, Tryptone Soya Agar (TSA)
OXOID CM0131, Nutrient Broth (NB) HIMEDIA
REF RM 002-500G, Skim Milk Agar Mediax Merk
CRITERION-USA, O/F Basal Medium MERCK
1.10282, oksidase stick, bahan-bahan untuk
pewarnaan Gram, laktosa, glukosa, tryptone,
substrat kasein, larutan buffer, TCA, tirosin.
Sedangkan peralatan yang akan digunakan adalah
seperangkat alat gelas, cawan petri, objek glass,
vortex, spektrofotometer UV-VIS 1601
(Shimadzu), oven, inkubator, autoklaf, Laminar
Air Flow (LAF) Nuaire Class II, timbangan,
sentrifus.
Prosedur Penelitian
Isolasi Bakteri
Isolasi bakteri dilakukan sesuai dengan standar
metode uji mikrobiologi menrut Standar Nasional
Indonesia (SNI) 6887-1:2012. Limbah cair RPA
tradisional di wilayah kota Malang diambil
sebanyak 60 ml yang dimasukkan ke dalam botol
steril. Limbah diperlakukan pengenceran berseri
10-110-6 menggunakan pepton water steril.

20

Hasil pengenceran 10-2, 10-4, dan 10-6 ditanam

menggunakan metode pour plate pada media
Trypthone Soya Agar (TSA), diinkubasi pada suhu
30C selama 48 jam. Hasil koloni yang ditumbuh
dilakukan penghitungan koloni serta pengamatan
morfologi koloni. Pemurnian bakteri dilakukan
dengan menanam pada media TSA diinkubasi pada
suhu 30C selama 48 jam. Target pemurnian
adalah setiap koloni yang memiliki perbedaan
morfologi. Selanjutnya, dipilih 5 jenis koloni
dominan untuk dilakukan karakterisasi koloni dan
bakteri. Masing-masing jenis koloni sejumlah 2
sehingga diperoleh 56 isolat yang berasal dari
limbah pemotongan dan limbah cucian karkas.
Hasil permunian ditumbuhkan pada agar miring
media TSA diinkubasi pada suhu 30C selama 48
jam dan disimpan pada suhu -20C. Untuk uji
selanjutnya, dilakukan penanaman pada agar
miring media TSA untuk mendapatkan fresh
culture.
Identifikasi Bacillus sp
Isolat yang tumbuh di agar miring (fresh culture)
diuji dengan pewarnaan Gram. Selanjutnya
dilakukan identifikasi menentukan Bacillus sp
menurut Barrow (1993) yaitu uji katalase,
oksidase, motilitas, spora, laktosa, sukrosa dan
glukosa.
Uji Kualitatif Protease
Uji kualitatif protease dilakukan menurut
Pakpahan (2009) yaitu isolat Bacillus sp
ditumbuhkan pada media selektif agar susu skim
(pH 6,5). Isolat diinkubasi pada suhu 37C selama
24 jam. Hasil positif ditandai dengan adanya zona
bening disekitar tumbuhnya koloni bakteri.
Sebaliknya, hasil negatif ditandai dengan tidak
adanya zona bening disekitar tumbuhnya koloni
bakteri.
Uji Aktivitas Protease
Uji aktivitas protease dilakukan menurut Baehaki
(2011) yaitu dengan cara Isolat Bacillus sp yang
memiliki nilai positif hasil uji kualitatif

ditumbuhkan pada media pertumbuhan yaitu

Nutrient Broth (NB). Selanjutnya dilakukan proses
produksi protease dan pengukuran aktivitas
protease.
a) Produksi Protease
Ekstraksi enzim protease dilakukan dengan cara
sentrifugasi media pertumbuhan bakteri dengan
kecepatan 3000 rpm selama 15 menit pada suhu
4C. Dengan teknik ini, sel akan mengendap oleh
adanya gaya gravitasi sedangkan enzim tetap
terdapat pada supernatan. Supernatan sebagai
sampel uji aktivitas protease.
b) Pengukuran Aktivitas Protease
(1)Pembuatan Kurva Baku Tirosin
Disiapkan 10 labu ukur dan masing-masing diisi
larutan baku tirosin 20 ppm 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10
mL sehingga dihasilkan konsentrasi
2,4,6,8,10,12,14,16,18,20 ppm. Setelah itu
ditambah akuades sampai tanda batas kemudian
tabung ditutup dengan penutupnya lalu dikocok.
Selanjutnya serapan cahaya/UV pada masingmasing konsentrasi larutan baku diukur pada
panjang gelombang maksimum yaitu 275 nm.
Blanko yang digunakan adalah akuades.
(2)Pengukuran Aktivitas Protease
Langkah awal yang dilakukan adalah
mencampurkan 200 L kasein 500 ppm, 300 L
larutan bufer fosfat pH 7 dan 100 L enzim
protease lalu didiamkan 60 menit pada suhu 37C
di atas penangas air. Kemudian ditambahkan 400
L larutan TCA 4% didiamkan selama 30 menit
pada suhu 27C (suhu kamar). Selanjutnya diputar
dengan alat sentrifugasi 4000 rpm selama 10
menit. Supernatan diambil 100 L dan diencerkan
5 kali volume sampel dengan bufer fosfat lalu
diukur nilai absorbansinya pada maks tirosin
sebesar 275 nm. Blanko yang digunakan dibuat
dengan prosedur sama dengan penentuan aktivitas,
tetapi untuk perlakuan penambahan TCA
dilakukan secepatnya setelah penambahan larutan

21

enzim. Adapun pengukuran aktivitas enzim protease

dilakukan dengan menggunakan rumus :
Aktivitas enzim = x x fp
Dimana : v = volume total sampel (mL)
q = waktu inkubasi (mL)
fp = faktor pengencaran
p = jumlah enzim (mL)

22

HASIL DAN PEMBAHASAN

Bacillus sp pada Limbah Cair Rumah Potong Ayam (RPA) Tradisional
Ada lima jenis koloni dominan yang selanjutnya dilakukan karakterisasi
berdasarkan
pengamatan morfologi koloni dan bakteri. Hasil karakterisasi koloni dan bakteri
dapat dilihat pada Tabel 1.
Morfologi Koloni
Morfologi Bakteri
Rerata Jumlah Koloni
Bakteri
Warna
Bentuk Tepi
Bentuk
Gram
Limbah
Limbah
Pemoton Cucian
gan
Karkas
(cfu/ml)* (cfu/ml)*
1 Putih
bulat
Rata
cocobacill negatif
27 x 102 35 x
14.3
10319.2
2 Putih
bulat
Rata
bacill
positif
5.3 x
4.4
10214.3 x10319.
2
3 Putih
bulat
Rata
coccus
negatif
1.4 x
10319.2
4 Putih
tak
tidak
bacill
positif
3.5 x
beraturan rata
10214.3
5 Kuning
bulat
Rata
cocobacill negatif
8.5 x
10319.2
Rerata
7.2 x
9.7 x
10214.3
10319.2

Lampiran
23

KARAKTERISASI DAN UJI AKTIVITAS Bacillus spp.

SEBAGAI AGENSIA
PENGENDALIAN HAYATI PENYAKIT LINCAT PADA
TEMBAKAU
TEMANGGUNG
ABSTRACT
Lincat disease of tobacco causing severe losses of the product. Control of the
disease with any available measure unlikely giving enough control. A number of
Bacillus spp. isolates could suppressed the growth of pathogen in vitro and
suppressed the development of lincat disease in the field. This article report the
charactheristics of six isolates of Bacillus spp. (Ba-4, Ba-22, Ba-24, Ba-30, Ba33, dan Ba-41). These isolates proven could suppressed lincat disease in the field.
Characterization of the isolates include the morphological, physiological
characteristics, and pathogenicity against tobacco plant. The results indicated
that the bacterial isolates were belong to the genus Bacillus with the following
charactheristics. The bacteria were rod shapes, forming endospore, Gram
positive, fermentative, positive reaction in katalase, oksidase, and Voges
Proskaeur tests. Negative results were obtained for Methyl Red test, hydrolysis of
starch, gelatine, and casein. The present isolates could use citrate and several
carbohydrates as carbon sources. Reduce nitrate to nitrite. The isolates could
grow in the medium with high osmotic pressure, i.e. could grow in the medium
with 7% NaCl. The present isolates grew well in the medium with pH of 4.510
and could grow in the temperature range of 1050 C. According to pathogenicity
test, the present isolates were not belong to the plant pathogenic bacteria. The
present isolates could suppressed the growth of Ralstonia solanacearum in vitro,
and could reduce the egg number of Meloidogyne incognita. According to the
physiological charactheristics tested, it seem that isolates of Ba-4, Ba-24, Ba-30,
dan Ba-33, and Ba-41 having similar charactheristics with Bacillus cereus. The
Ba-22 isolate, however, having similar characteristics with B. licheniformis.
PENGANTAR
Penyakit lincat pada tembakau temanggung menyebabkan kerugian yang tidak
sedikit. Kematian tanaman yang disebabkan oleh penyakit ini mencapai 50%
(Dalmadiyo et al., 2000 ). Berbagai usaha pengendalian telah dilakukan namun
belum memberikan hasil yang memuaskan. Penyakit lincat ini disebabkan oleh
interaksi antara bakteri Ralstonia solanacearum dan nematoda Meloidogyne
incognita (Dalmadiyo, 200 4). Pengendalian yang dilakukan haruslah ditujukan
terhadap kedua patogen tersebut sehingga diperoleh hasil yang memuaskan. Pada
tahun 2004, Bacillus spp. dari risosfer beberapa tanaman di daerah pertanaman
tembakau diisolasi kemudian dilakukan seleksi langsung kemampuannya

24

menghambat penyakit lincat di lapangan terhadap isolat yang diperoleh

(Arwiyanto et al., 2007). Hasilnya menunjukkan bahwa enam isolat di
antaranya mampu menekan patogen in vitro dan mampu menekan perkembangan
penyakit di lapangan. Karakterisasi fisiologis dan beberapa sifat lainnya perlu
dilakukan dalam usaha perbaikan kemampuan isolat yang akan digunakan
dalam program pengendalian secara biologis. Tulisan ini melaporkan sifat-sifat
fisiologis dari enam isolat Bacillus spp. yang nantinya dapat digunakan sebagai
dasar pengembangannya sebagai agensia pengendalian hayati penyakit lincat
tembakau temanggung.
BAHAN DAN CARA KERJA
Isolat Bakteri
Isolat bakteri yang digunakan dalam penelitian ini merupakan koleksi dari
Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan, Fakultas Pertanian UGM, yang pada
penelitian sebelumnya dilaporkan bakteri tersebut mampu menekan
penyakit lincat di lapangan, sebagaimana disajikan pada Bakteri ditumbuhkan
dengan digoreskan pada permukaan medium YPA miring pada suhu kamar (28
C) selama dua hari sebelum digunakan dalam penelitian.
Isolat R. solanacearum
Isolat Rs-13, Rs-16, dan Rs-22 merupakan isolat R. solanacearum yang diisolasi
dari lahan tembakau di daerah Temanggung pada tahun 2004.
Isolat Bakteri Antagonis Lainnya
Dikarenakan tujuan akhir dari penelitian pengendalian hayati penyakit lincat
adalah mendapatkan agen-agen hayati yang kompatibel sehingga dilakukan pula
pengujian kompatibilitas antaragen hayati yang diteliti. Isolat agen
hayati tersebut adalah Streptomyces spp
Tanaman
Tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah tembakau varietas klemoko.
Cara Kerja
Pengamatan Sifat Morfologis
Semua isolat Bacillus ditumbuhkan secara terpisah pada medium YPA (Yeast
Pepton Agar) selama 2 hari. Bentuk dan warna koloni diamati secara visual.
Pengecatan negatif dilakukan berdasarkan metode Jutono et al. (1973) untuk
melihat morfologi individu sel. Pewarnaan endospora dan flagela mengikuti
metode Schaad (2001).
Pengamatan Sifat Fisiologis, Biokimia, dan Patogenisitas terhadap Tanaman
Pengujian berbagai sifat-sifat fisiologis dan biokimia dilakukan sebagai berikut:
pengujian sifat Gram, katalase, uji VP, dan MR (Sands, 1990); oksidatif
fermentatif, oksidase, (Hayward, 1994); hidrolisis pati, penggunaan sitrat,
pertumbuhan pada berbagai suhu, pH medium, pertumbuhan pada medium yang
mengandung berbagai konsentrasi NaCl (Chun dan Vidaver, 200 1); hidrolisis

25

kasein, reduksi nitrat (Jutono et al., 1973); hidrolisis gelatin dan penggunaan
sumber karbon (Nishiyama dan Ezuka, 1991); uji reaksi hipersensitif, uji
patogenisitas (Klement, 1990); pertumbuhan pada berbagai pH media,
produksi hidrogen sulfida, hidrolisis eskulin, pertumbuhan pada berbagai suhu
inkubasi, pertumbuhan pada 0,1% fenol, toleransi terhadap NaCl, penggunaan
sumber nitrogen, hidrolisis gelatin, dan penggunaan sumber karbon (Nishiyama
dan Ezuka, 1991); aktivitas enzim lecithinase (Gordon et al., 1973).
Pengujian Antibiosis terhadap Patogen Lincat dan Pengujian Antagonisme
Antaragensia Pengendali Hayati
Pengujian antarisolat bakteri dilakukan seperti yang dilaporkan oleh Arwiyanto et
al. (2006 ) sedangkan pengujian penekanan terhadap nematoda oleh Bacillus spp.
dilakukan seperti yang dilakukan oleh Dropkin (1996) dan Dalmadiyo (2004).
Morfologi Bakteri
Koloni Bacillus spp. yang diamati berbentuk bulat, berlendir, tepi rata, dan tidak
tembus cahaya. Sel bakteri berbentuk batang dengan ukuran sel yang bervariasi
Semua isolat membentuk endospora. Pewarnaan dengan malachite green
memperlihatkan endopsora berwarna hijau dengan sel vegetatif berwarna merah.
Endopsora berbentuk elips dengan posisi berada di tengah sel atau di dekat ujung
sel.
Sifat Fisiologi dan Biokimia
Semua isolat yang diuji menunjukkan sifat Gram positif, mampu tumbuh pada
kondisi oksigen berkecukupan maupun dalam kondisi oksigen terbatas, bentuk
batang, dan membentuk endopsora. Enzim katalase dibentuk oleh
semua isolat, uji VP positif sedangkan uji MR negatif yang berarti semua isolat
mampu membentuk asam dari glukosa namun pH yang terbentuk tidak mencapai
4,2. Sitokrom oksidase dibentuk oleh semua isolat, hidrolisis pati dan kasein
positif, sebagian besar menghidrolisis gelatin (kecuali isolat Ba-41), sitrat
digunakan oleh semua isolat sebagai sumber karbon, nitrat dapat direduksi
menjadi nitrit. Beberapa senyawa karbohidrat dapat digunakan
sebagai sumber karbon yaitu glukosa, maltosa, sukrosa, amilum, manitol, sorbitol,
dan myoinositol. Suhu minimum untuk pertumbuhan berkisar dari 10 C sampai
20 C sedangkan suhu optimum antara 3040 C. Suhu maksimum berbeda-beda
tiap isolatnya. Ba-22 dan Ba-33 mampu tumbuh pada suhu 80 C. Semua isolat
mampu tumbuh pada medium yang mengandung 7% NaCl. pH optimum untuk
pertumbuhan adalah 6,57,5 sedangkan pH minimum 4,5 dan pH maksimum
untuk pertumbuhan adalah 10.
Sifat Patogenisitas terhadap Tanaman
Hasil pengujian reaksi hipersensitifitas menunjukkan bahwa semua isolat yang
diuji tidak mampu menimbulkan bercak nekrosis pada daun tembakau. Ini berarti
bahwa isolat-isolat tersebut bukan merupakan patogen tumbuhan.
Pengujian lebih lanjut menguatkan hasil tersebut ketika keenam isolat
diinokulasikan ke tanaman tembakau lewat akar. Tanaman tembakau var. klemoko
yang diinokulasi dengan enam isolat Bacillus spp. tidak menunjukkan

26

gejala apa pun, tidak dijumpai malaformasi atau perubahan morfologis, seperti
halnya pada kontrol negatif yang diinokulasi dengan air. Pada kontrol positif yang
diinokulasi dengan R. solanacearum, tanaman menunjukkan gejala kelayuan
setelah satu minggu.
Aktivitas Antibiosis terhadap Patogen Antagonisme terhadap Ralstonia
solanacearum
Tiga isolat Bacillus spp. yaitu Ba-4, Ba-22, dan Ba-24 mampu menghambat ketiga
isolat R. solanacearum yang diujikan sedangkan dua isolat lainnya yaitu Ba-30
dan Ba-33 hanya mampu menghambat satu isolat saja. Dari enam isolat yang diuji
ternyata hanya satu isolat yaitu Ba-41 yang tidak mampu menghambat
pertumbuhan R. solanacearum secara in vitro. Sebaliknya isolat Bacillus Ba-41 ini
dihambat pertumbuhannya oleh dua isolat R. solanacearum (
Antagonisme terhadap Meloidogyne incognita
Semua isolat Bacillus spp. mampu mendegradasi telur nematoda M. incognita dan
mengurangi persentase telur yang menetas menjadi larva (Tabel 6). Dua isolat,
yaitu Ba-4 dan Ba-22 hanya mampu mendegradasi telur dalam jumlah yang
sangat sedikit namun sisa telur yang tidak terdegradasi ternyata tidak mampu
menetas menjadi telur.
Antagonisme antar bakteri antagonis
Hasil pengujian menunjukkan bahwa terdapat variasi penghambatan antarbakteri
antagonis yang akan digunakan dalam program pengendalian hayati penyakit
lincat. Hampir separuh isolat Bacillus spp. yang diuji mampu menekan
pertumbuhan agensia hayati lainnya (Tabel 6). Isolat Ba-41 yang memberikan
penekanan terbaik terhadap penyakit lincat di lapangan ternyata tidak
menghambat pertumbuhan bakteri antagonis lainnya. Meskipun demikian
ternyata isolat Ba-41 peka terhadap antagonisme isolat bakteri antagonis yang
lain.
PEMBAHASAN
Beberapa sifat yang berhasil diidentifikasi menunjukkan bahwa isolat bakteri
yang diteliti masuk ke dalam genus Bacillus. Sifat ini bersama dengan bentuknya
yang batang dan mampu membentuk endopsora, membedakan Bacillus sp. dengan
genus Clostridium dan Sporosarcina. terlihat bahwa isolat-isolat Bacillus spp.
yang diuji mempunyai sifat yang beragam. Isolat Ba-4, Ba-24, Ba-30, Ba-33, dan
Ba-41 mempunyai kemiripan sebagian sifat dengan B. cereus sedangkan Ba-22
dengan B. licheniformis. Karakterisasi lebih lanjut dengan metode modern seperti
secara molekuler perlu dilakukan untuk memastikan spesies dari isolat-isolat
bakteri tersebut. Isolat Bacillus spp. yang diteliti bukan merupakan
pa togen tumbuhan yang di tunjukkan dengan ketidakmampuannya menyebabkan
gejala nekrosis pada daun tembakau (reaksi hipersensitifitas negatif) dan tidak
ditemukannya malaformasi pada tanaman yang diinokulasi melalui akar. Sampai
saat ini telah dilaporkan ada tiga spesies dari genus Bacillus yang merupakan
patogen pada tumbuhan yaitu B. megaterium, B. megaterium pv cerealis, dan B.

27

pumilus (Anonim, 2007 ). Isolat Ba-41 tidak mampu menekan pertumbuhan R.

solanacearum secara in vitro namun dapat mendegradasi masa telur nematoda.
Bakteri dari genus ini dilaporkan memproduksi enzim gelatinase yang dapat
menguraikan senyawa gelatin yang menjadi komponen utama selubung masa telur
nematoda (Gordon et al., 1973). Isolat Bacillus spp. yang diteliti mampu
menghidrolisis gelatin secara in vitro, kemampuan ini mungkin yang
menyebabkan terdegradasinya telur nematoda yang dilapisi dengan bahan gelatin.
Berdasarkan hasil uji antagonisme antarcalon bakteri agensia hayati diketahui
bahwa ternyata Bacillus spp. Ada yang dihambat dan ada yang tidak dihambat
pertumbuhannya oleh bakteri lain. Sebaliknya tidak semua isolat Bacillus spp.
yang diteliti dapat menghambat pertumbuhan bakteri lainnya pula. Dengan
demikian dalam penggabungan dengan isolat lain harus dipilih isolat-isolat yang
tidak saling menghambat. Isolat Streptomyces mampu menghambat isolat lain
dengan zona hambatan yang paling besar, hal ini mungkin karena sebagian besar
anggota Streptomyces merupakan penghasil antibiotik yang potensial (Turner,
1973).
Dari hasil penelitian tersebut di atas dapat disimpulkan bahwa semua isolat
Bacillus spp. yang diuji bukan merupakan patogen tumbuhan sehingga bisa
digunakan sebagai calon agensia pengendalian hayati patogen tumbuhan.
Meskipun masih diperlukan penelitian lebih lanjut secara molekuler untuk
memastikannya. Ada kemiripan sifat antara isolat Ba-4, Ba-24, Ba-30, Ba-33, dan
Ba-41 dengan B. cereus. Sedangkan isolat Ba-22 memiliki kemiripan sifat dengan
B. licheniformis.

28