BAB I

PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Vanilin (4-hidroksi-3-metoksibenzaldehida) merupakan kristal berwarna
putih atau putih kekuningan yang banyak digunakan sebagai pewangi
makanan. Vanilin dihasilkan dari buah panili (Vanilla fragrans). Tanaman
panili dapat tumbuh dengan baik di kawasan tropis. Vanilin merupakan
senyawa aldehida aromatik dengan rumus molekul C 8H8O3. Dilihat dari
struktur kimianya, vanilin merupakan senyawa fenol tersubstitusi gugus
metoksi pada posisi orto dan gugus aldehida pada posisi para, sehingga
vanilin dapat dikelompokkan sebagai senyawa antioksidan

dan juga

mempunyai aktivitas antibakteri (Fitzgerald et al. 2004) Apabila vanilin

dikenai reaksi reduksi akan diperoleh senyawa vanilil alkohol menurut
persamaan reaksi berikut (Budimarwanti 2009):

Vanilil alkohol juga merupakan senyawa fenolik, sehingga memiliki

potensi sebagai antioksidan. Senyawa Vanilin biasa digunakan sebagai zat
pengaroma pada makanan dan sediaan farmasi. Beberapa riset menunjukkan
bahwa turunan vanillin memiliki beberapa aktivitas, antara lain aktivitas
antimikroba (Kumar et al. 2012; Harini et al 2012) dan antioksidan (Oliveira
et al. 2014). Aktivitas antimikroba turunan vanillin meliputi gram positif dan
negatif (Rakchoy et al. 2009), dalam penelitian ini bakteri uji yang digunakan
adalah Staphylococcus aureus dan Escherichia coli.
Dwi Winarto dan C. Budirmanwati tahun 2013 telah berhasil mensintesis
turunan vanillin yaitu vanilil sinamat dari vanilil alkohol. Reaksi esterifikasi
dipengaruhi beberapa faktor, salah satunya halangan atom sterik. Senyawa
1

vanillin

direduksi

terlebih

dahulu

menjadi

vanilil

alkohol

untuk

meminimalisasi gangguan halangan sterik pada reaksi esterifikasi. Reaksi

esterifikasi merupakan reaksi yang penting. Karena produk senyawa ester
banyak digunakan untuk aplikasi farmasi, industri makanan/minuman dan
industri parfum. Ester dapat disintesis dengan cara mereaksikan asam
senyawa asam karboksilat dengan alkohol yang dikenal dengan reaksi
esterifikasi. Pada dasarnya reaksi esterifikasi memiliki energi aktivitasi yang
tinggi

dan

membutuhkan

waktu

yang

lama

untuk

mencapai

kesetimbangannya. Proses esterifikasi dapat berlangsung dengan ataupun

tanpa katalis (Fessenden, 1986).
Asam salisilat merupakan senyawa yang asam karboksilat memiliki
beberapa aktivitas diantaranya antiinflamasi, fungsitatik, bakteriostatik,
analgetik, dan efek tabir surya (Sri K. et al. 2012)
Penelitian tentang pengembangan senyawa antibakteri telah banyak
dikembangkan baik terhadap bahan dari senyawa alam ataupun senyawa
sintetik. Pada penelitian ini akan dilakukan sintesis senyawa ester vanilil
salisilat dengan mereaksikan vanilil alkohol dengan asam salisilat, dimana
vanilil alkohol diperoleh dari reduksi senyawa vanillin, dengan persamaan
reaksi sebagai berikut:

Senyawa ester vanilil salisilat yang diperoleh diharapkan memiliki aktivitas

antibakteri yang lebih baik dibandingkan senyawa vanillin.

BAB II
PERUMUSAN MASALAH
Penelitian ini bertujuan melakukan modifikasi struktur vanillin dengan
asam salisilat dan mengukur aktivitas antibakterinya terhadap Escherichia
coli ATCC 25922 dan Staphylococcus aureus ATCC 25923..
Dari latar belakang di atas maka dirumuskan masalah Bagaimaha
struktur senyawa yang diperoleh dari hasil modifikasi vanillin dengan asam
salisilat dan apakah vanilil salisilat memiliki efek antibakteri terhadap
Escherichia coli ATCC 25922 dan Staphylococcus aureus ATCC 25923?

BAB III
TINJAUAN PUSTAKA
A. Vanillin
Vanilin mengandung tidak kurang dari 97,0 % dan tidak lebih dari 103,0 %
C8H8O3, dihitung terhadap zat yang telah dikeringkan. Pemerian zat berupa
hablur halus berbentuk jarum ; putih hingga agak kuning; rasa dan bau khas.
Kelarutan zat sukar larut dam air, larut dalam air panas : mudah larut
dalam etanol (95 %) P, dalam eter P dan dalam larutan alkali hidroksida : dan
larutan dalam gliserin (Depkes RI 1995). Struktur Vanilin sebagai berikut:

Vanilin (4-hidroksi-3-metoksibenzaldehida) merupakan kristal berwarna

putih atau putih kekuningan yang banyak digunakan sebagai pewangi
makanan. Vanilin dihasilkan dari buah panili (Vanilla fragrans). Tanaman
panili dapat tumbuh dengan baik di kawasan tropis (Sastrapradja. S, 1978).
Vanilin merupakan senyawa aldehida aromatik dengan rumus molekul
C8H8O3. Dilihat dari struktur kimianya, vanilin merupakan senyawa fenol
tersubstitusi gugus metoksi pada posisi orto dan gugus aldehida pada posisi
para, sehingga vanilin dapat dikelompokkan sebagai senyawa antioksidan
(Sarifudin, 2002).
B. Asam Salisilat
Asam salisilat telah digunakan sebagai bahan terapi topikal sejak lebih dari
2000 tahun yang lalu.1 Dalam bidang dermatologi, asam salisilat telah lama
dikenal dengan khasiat utama sebagai bahan keratolitik. Hingga saat ini asam
salisilat masih digunakan dalam terapi veruka, kalus, psoriasis, dermatitis
4

seboroik pada kulit kepala, dan iktiosis. Penggunaannya semakin berkembang

sebagai bahan peeling dalam terapi penuaan kulit, melasma, hiperpigmentasi
pascainflamasi, dan akne.4,5 Di Amerika Serikat, berbagai sediaan
mengandung preparat asam salisilat dalam konsentrasi 1-40%.6 Penggunaan
asam salisilat topikal relatif aman. Efek samping lokal yang sering dijumpai
pada penggunaan asam salisilat adalah dermatitis kontak (Sri Katon S. et al.
2012). Struktur Asam Salisilat sebagai berikut:

Asam Salisilat mengandung tidak kurang dari

99,5% dan tidak lebih dari 101,0% C7H6O3 dihitung
terhadap zat yang telah dikeringkan. Pemerian asam salisilat berupa hablur
putih, biasanya berbentuk jarum halus atau serbuk hablur halus putih, rasa
agak manis, tajam dan stabil di udara. Kelarutan asam salisilat adalah sukar
larut dalam air dan dalam benzene, mudah larut dalam etanol, dan dalam eter,
larut dalam air mendidih, agak sukar larut dalam kloroform. Sifat Kimia
Asam

salisilat,

dikenal

juga

dengan

2-hydroxy-benzoic

acid

atau

orthohydrobenzoic acid, memiliki struktur kimia C7H6O3. Asam salisilat

memiliki pKa 2,97 dan jarak lebur 158 dan 161 (Depkes RI 1995)
Asam salisilat dapat diekstraksi dari pohon willow bark, daun wintergreen,
spearmint, dan sweet birch. 9,10 Saat ini asam salisilat telah dapat diproduksi
secara sintetik. Bentuk makroskopik asam salisilat berupa bubuk kristal putih
dengan rasa manis, tidak berbau, dan stabil pada udara bebas. Bubuk asam
salisilat sukar larut dalam air dan lebih mudah larut dalam lemak. Sifat
lipofilik asam salisilat membuat efek klinisnya terbatas pada lapisan
epidermis. Manfaat dan Mekanisme Kerja Asam Salisilat Topikal Efek
Keratolitik dan Desmolitik Asam salisilat telah digunakan secara luas dalam
5

terapi topikal sebagai bahan keratolitik. Zat ini merupakan bahan keratolitik
tertua yang digunakan sejak 1874. Berbagai penelitian menyimpulkan bahwa
asam salisilat memberikan banyak efek antara lain efek analgetik,
antipruritus, analgesic, antiinflamasi, bakteriostatik, fungsitatik, efek tabir
surya, dan lain-lain (Sri Katon S. et al. 2012)
C. Reduksi
Menurut Fessenden dan Fessenden (1986) suatu aldehida atau keton dapat
direduksi menjadi suatu alcohol, suatu hidrokarbon atau suatu amina. Produk
reduksi tergantung pada bahan pereduksi dan struktur senyawa karbonilnya.
Ada 3 pereaksi pereduksi yaitu: hidrogenasi, hidrida logam dan aminasi
reduktif. Proses reduksi dengan hidrogenasi agak merepotkan karena
memerlukan tanki gas dan bejana bertekanan. Suatu prosedur alternative
melibatkan

penggunaan

hidrida

logam.

Dua

zat

pereduksi

yang

bermanfaatadalah litium alumunium hidrida (LAH) dan natrium borohidrida

(NaBH4), keduanya mereduksi aldehida dan keton menjadi alcohol.
Natrium borohidrida merupakan zat pereduski yang lebih lembut daripada
LAH. Reaksinya dapat dilakukan dalam air atau alcohol berair sebagai pelarut.
Untuk mereduksi suatu aldehida atau keton dipilih NaBH 4 karena lebih mudah
penanganannya dan tidak reaktif terhadap air. NaBH4 mereduksi aldehida dan
keton dengan cepat tetapi sangat lambat mereduksi ester.
D. Esterifikasi
Menurut Fessenden dan Fessenden (1986) ester merupakan senyawa
organik yang sangat berguna, strukturnya dapat diubah menjadi bentuk
senyawa lain. Suatu ester dapat dibentuk dengan reaksi langsung antara suatu
asam karboksilat dengan suatu alkohol yang disebut dengan reaksi esterifikasi.
Ester asam karboksilat ialah suatu senyawa yang mengandung gugus COOR
dengan R dapat berbentuk alkil, aril maupun lakton atau ester siklik . Reaksi
esterifikasi secara umum dapat digambarkan sebagai berikut :
O
R

H+
OH

asam
karboksilat

R'

OH

suatu alkohol

OR'

suatu ester

H2O

Gambar 5.

Persamaan reaksi esterifikasi secara umum (Fessenden

dan Fessenden, 1986).

Laju reaksi esterifikasi suatu asam karboksilat tergantung pada:
a. Halangan atom sterik
Menurut Fessenden dan Fessenden (1986) halangan sterik dari alkohol dan
asam karboksilat merupakan faktor yang paling berpengaruh terhadap laju
reaksi esterifikasi. Urutan kereaktifan alkohol terhadap laju pembentukan
ester adalah sebagai berikut :
R2
R1

R1

OH

H
C

H2
C

R1

OH

H 3C

OH

OH

R2

R3

Bertambahnya kereaktifan
Urutan kereaktifan asam karboksilat terhadap laju reaksi esterifikasi
adalah sebagai berikut :
R2
R1

R1

H
C

R1

H2
C

H3 C

C
OH

OH

OH

HC
OH

R2

R3

Bertambahnya kereaktifan
b. Katalis
Nukleofil lemah seperti alkohol memiliki laju yang sangat lambat
dalam menyerang atom karbonil

RCOOH yang kurang reaktif. Sifat

kereaktifan karbonil ini dapat ditingkatkan dengan cara protonasi,

contohnya dengan menggunakan katalis asam. Katalis asam akan
meningkatkan kemudahan lepasnya gugus pergi, yaitu pelepasan H 2O dari
gugus asam karboksilat (Sykes, 1989).
7

OH

E. Karakterisasi Hasil Sintesis

1. Kromatografi Lapis Tipis
Kromatografi adalah teknik pemisahan berdasarkan perbedaan
interaksi komponen-komponen dalam sampel terhadap fasa diam dan fasa
gerak. Fasa diam kromatografi dibuat dalam bentuk lapisan tipis. Lapisan
tipis ini berupa bahan kolom (fasa diam) yang dilapisi secara tipis dan
merata pada permukaan lembaran kaca, kertas, plastik atau logam
alumunium. Fasa diam yang biasa digunakan dalam KLT adalah silika dan
alumunia, fasa diam lain yang yang digunakan adalah selulos, resin,
penukar ion dan gel. Sedangkan fasa gerak yang digunakan tergantung
pada sifat kepolaran sampel yang akan dipisahkan. Kadang-kadang
digunakan campuran dua atau lebih pelarut untuk mendapatkan pemisahan
yang lebih baik. Cara ini banyak digunakan karena adanya beberapa
keuntungan yaitu peralatan yang digunakan sedikit, pengerjaannya
sederhana, waktu analisis cepat, pemisahannya cukup baik.
Secara dasar proses pemisahan pada KLT disebabkan adanya
keseimbangan yang berurutan dari komponen yang dipisahkan dalam dua
fasa yaitu fasa diam dan fasa gerak. Teknik pengerjaan KLT sebagai
berikut, fasa diam (pengadsorb) dilapisi pada suatu lembaran kaca atau
media yang lain sebagai pendukungnya. Zat yang akan dipisahkanditotol
pada lempengan fasa diam tersebut. Lempengan ini diletakkan tegak (agak
miring) di dalam wadah dengan sedikit pelarut (fasa gerak) (Sunardi,
2006).
Pelarut naik melalui lapisan adsorben karena gaya kapiler dan
campuran dalam sampel bergerak dengan kecepatan yang berbeda
tergantung kekuatan interaksinya dengan adsorben. Bila komponen
campuran memiliki sifat kepolaran yang mirip dengan adsorben maka
pada akhir kromatografi akan tertahan pada plat dan sebaliknya jika sifat
kepolarannya lebih mendekati fase gerak, komponen campuran akan
terikat oleh fase gerak sehingga memiliki nilai retardation factor (Rf) yang
8

besar. Retardation factor adalah nilai perbandingan jarak yang ditempuh

oleh komponen campuran terhadap jarak yang ditempuh oleh eluen dalam
waktu yang sama (Padmawinata 1991).
Rf

Jarak yang ditempuh spot

Jarak yang ditempuh pelarut

Harga Rf dipengaruhi oleh beberapa faktor, yaitu: jenis fasa diam,

ketebalan lapisan, kadar campuran yang dipisahkan, jenis pelarut yang
digunakan dan jumlah zat yang ditotolkan (Sunardi 2006). Kromatografi
lapis tipis biasanya digunakan untuk menentukan jumlah komponen dalam
sampel, memonitor jalannya reaksi, menentukkan efektifitas pemurnian,
menentukan kondisi yang sesuai untuk kromatografi kolom dan
memonitor kromatografi kolom.
Deteksi kromatogram merupakan tahap akhir yang penting dalam
kromatografi. Kromatogram yang diperoleh dapat secara langsung
ditentukan secara kualitatif dan kuantitatif menggunakan densitometer,
yaitu TLC Scanner. Pengukuran densitometer dapat dilakukan berdasarkan
cara absorpsi, refleksi dan transmisi. Sinar dari sumber cahaya dibentuk
menjadi sinar monokromatis ini difokuskan dan diarahkan ke plat
kromatografi. Sinar dikonversi dalam bentuk puncak-puncak (Chernalia
2008)
2. Spektroskopi Infra Merah (FT-IR)
Spektroskopi infra merah merupakan teknik spektrokopi yang
digunakan untuk mengidentifikasi gugus-gugus fungsional yang terdapat
pada suatu senyawa organik. Pada dasarnya inti-inti atom yang terikat
oleh ikatan kovalen dapat mengalami getaran (vibrasi) atau osilasi. Bila
suatu molekul menyerap radiasi infra merah, energi diserap akan
menyebabkan kenaikan dalam amplitudo getaran atom-atom di dalamnya.
Atom dalam molekul bervibrasi secara konstan baik berupa uluran
(streching) maupun tekukan (bending). Dengan demikian molekul berat
akan dalam keadan vibrasi tereksitasi sehingga energy yang terserap ini
akan dilepas kembali dalam bentuk panas bila molekul itu kembali ke
9

keadaan dasar. Banyak energy yang diserap oleh suatu ikatan bergantung
pada perubahan dalam momen ikatan seperti vibrasi atom-atom yang
saling berikatan. Oleh sebab itu, tipe ikatan yang berbeda akan menyerap
radiasi infra merah pada panjang gelombang yang berbeda pula, sehingga
spektroskopi infra merah dapat digunakan untuk uji kualitatif yaitu untuk
mengidentifikasi berbagai gugus fungsi yang terdapat dalam senyawa
yang diujikan (Williams et al. 1980).
Spektrum infra merah meliputi panjang gelombang antara 2,5 16
nm setara dengan bilangan gelombang, v = 4000 625 cm -1. Daerah
antara 1300 1000 cm-1 sering disebut daerah sidik jari dimana sejumlah
serapan pada daerah ini merupakan karakteristik dari tiap-tiap senyawa,
tetapi pada daerah ini sulit untuk menentukkan gugus fungsi di dalam
suatu senyawa karena terjadi uluran dan tekukan suatu atom dalam
molekulnya. Daerah yang tepat untuk menentukkan gugus fungsi yang
spesifik dari tiap senyawa adalah daerah gugus fungsional yang terdapat
pada bilangan gelombang 4000 hingga 1300 cm-1.
3. Spektroskopi LC-MS
Liquid cromatograpy Mass spectroscopy adalah dua alat yang di
gabungkan menjadi satu, yang berfungsi untuk memisahkan beberapa
senyawa atau campuran senyawa berdasarkan kepolarannya, dimana
setelah campuran senyawa tersebut terpisah, maka senyawa yang murni
akan teridentifikasi berat molekulnya. Data yang didapatkan adalah berat
molekul ditambah beberapa muatan dan berat molekul pelarut (Bowers,
1989).
4. Spektroskopi UV-VIS
Spektrofotometri Sinar Tampak (UV-Vis) adalah pengukuran
energi cahaya oleh suatu sistem kimia pada panjang gelombang tertentu
(Day, 2002).Sinar ultraviolet (UV) mempunyai panjang gelombang antara
200-400 nm, dan sinar tampak (visible) mempunyai panjang gelombang
10

400-750 nm.Konsentrasi dari analit di dalam larutan bisa ditentukan

dengan mengukur absorban pada panjang gelombang tertentu dengan
menggunakan hukum Lambert-Beer (Williams, 1980).
F. Tinjauan Umum Bakteri
1. Bakteri (Dwijoseputro 2003)
Bakteri adalah sel prokariotik yang berukuran kecil terdiri dari satu sel,
memiliki DNA maupun RNA, hanya dapat dilihat dengan mikroskop dan
berkembang biak dengan membelah diri atau aseksual. Pada umumnya ada
tiga bentuk sel bakteri, yaitu kokus, basilus, dan spiral.
Berdasarkan pewarnaan Gram maka bakteri dibedakan menjadi dua,
yaitu bakteri Gram (+) dan bakteri Gram (-). Pada pewarnaan bakteri Gram
(+), sel berwarna ungu dengan pengecatan kristal violet dan larutan iodium,
alkohol dan safranin, contohnya Bacilllus subtilis, Staphylococcus aureus.
Sedangkan bakteri Gram (-) pada pewarnaan bakteri, sel berwarna ungu
dengan kristal violet dan larutan iodium. Sel bakteri akan berubah warna
pada saat menggunakan alkohol karena lipid akan terekstraksi dari dinding
sel sehingga pori-pori mengembang dan komplek kristal violet akan keluar.
Pada saat sel bakteri dicat dengan safranin maka sel akan menjadi
merah, contohnya : Escherichia coli, Salmonella thyposa, Shigella.
a. Bakteri Uji (Chatib 1993; Alcama E. 1983)
Escherichia coli adalah bakteri oportunis yang banyak ditemukan di
dalam usus besar manusia sebagai flora normal. Bakteri ini berbentuk
batang pendek (kokobasil), Gram negatif berukuran 0,4 0,7 m 1,4
m, tidak berspora dan bergerak aktif. Bakteri ini dapat menyebabkan
penyakit diare dan infeksi kemih. Pengobatan ini efektif dengan
antibiotik golongan aminoglikosida, tetrasiklin dan kloramfenikol.
Klasifikasi bakteri ini sebagai berikut :
Divisi
: Scizomycetales
Subdivisi
: Bacteria
Ordo
: Eubakteria
Famili
: Escherichieae
Genus
: Escherichia
Spesies
: Escherichia coli
Staphylococcus aureus adalah bakteri Gram (+) ditunjukkan dengan
pewarnaan Gram yang menghasilkan warna ungu. Bakteri berbentuk
11

bulat bergerombol seperti anggur dengan diameter antara 0.5-1,5 m.

Bakteri ini tidak bergerak, tidak berspora dengan suhu optimum
pertumbuhan 35oC dan pH optimum adalah 7,4.
Susunan koloni biasanya tidak teratur ditemukan pada sediaan yang
terbuat dari pembenihan padat, sedangkan pada pembenihan kaldu
biasanya ditemukan tersendiri atau tersusun sebagai rantai pendek. Pada
pembenihan padat koloni berbentuk bulat halus, diameter 1-22 mm,
cembung, buram, mengkilat, konsistensinya lunak berwarna kuning
keemasan dengan intensitas warna yang bervariasi.
Staphylococcus aureus merupakan flora normal pada kulit manusia.
Bakteri ini juga ditemukan pada pakaian, sprei dan benda lain
dilingkungan manusia. S. aureus patogenik dan bersifat invasive
menghasilkan koagulans dan cenderung untuk menghasilkan pigmen
kuning dan menjadi hemolitik. S. aureus menyebabkan infeksi lokal
jerawat, infeksi folikel rambut atau abses.
Bakteri Staphylococcus aureus diklasifikasikan sebagai berikut :
Kingdom : Plantae
Divisi
: Schizophyta
Kelas
: Bacteria
Ordo
: Eubacteriales
Famili
: Micrococcaceae
Genus
: Staphylococcus
Spesies
: Staphylococcus aureus
2. Antibakteri (Ganiswara 1995)
Antibakteri adalah zat yang dapat membunuh ataupun menghambat
pertumbuhan bakteri, khususnya bakteri yang merugikan manusia.
Berdasarkan khasiatnya terhadap bakteri, antibakteri dibedakan menjadi dua
golongan yaitu zat yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri
(bakteriostatik) dan zat yang dapat mematikan bakteri (bakterisida).
Berdasarkan luas aktivitas terhadap banyak atau sedikit bakteri,
antibakteri dibedakan menjadi dua golongan, yaitu zat dengan aktivitas
sempit (narrow spectrum) dan zat dengan aktivitas luas (broad spectrum).
Zat dengan aktivitas sempit terutama aktif terhadap beberapa jenis bakteri
saja yaitu Gram positif, Gram negatif atau terhadap jamur saja. Zat dengan
aktivitas luas.
12

a)
b)
c)
d)

Mekanisme kerja antibakteri, yaitu :

Antibakteri yang menghambat metabolisme sel bakteri
Antibakteri yang menghambat sintesis dinding sel bakteri
Antibakteri yang mengganggu keutuhan membran sel bakteri
Antibakteri yang menghambat sintesis protein sel bakteri

e) Antibakteri yang menghambat sintesis asam nukleat sel bakteri

3. Pengujian Antibakteri (Katzung 1997)
Uji antibakteri ada beberapa macam, yaitu :
a. Metode difusi
Pada metode ini zat antibakteri berdifusi pada lempeng agar yang
telah diinokulasi dengan bakteri. Dasar pengamatannya adalah terbentuk
zona hambat di sekeliling cakram atau silinder yang berisi antibakteri.
Metode ini dipengaruhi faktor fisik dan kimia, selain antara obat dan
organisme.
1) Cara parit (ditch)
Pada medium agar yang telah diinokulasi dengan bakteri dibuat
parit kemudian diisi dengan zat antibakteri dan diinkubasi pada suhu
dan jangka waktu sesuai dengan jenis bakteri uji. Pengamatan
dilakukan atas ada atau tidaknya hambatan di sekeliling parit.
2) Cara silinder
Pada medium agar yang telah diinokulasi dengan bakteri dibuat
lubang, diletakkan silinder kemudian diisi dengan zat antibakteri,
setelah itu diinkubasi pada suhu dan jangka waktu yang sesuai dengan
jenis bakteri uji. Pengamatan dilakukan atas dasar ada atau tidaknya
hambatan disekeliling silinder.
3) Cara cakram
Kertas cakram yang mengandung zat antibakteri diletakkan di
atas lempeng, setelah diinkubasi pada suhu dan jangka waktu yang
sesuai dengan bakteri uji. Pengamatan dilakukan atas ada atau
tidaknya hambatan di sekeliling cakram.
b. Metode difusi
Metode ini menggunakan antibakteri yang turun secara bertahap,
baik dengan media cair atau padat, kemudian media diinokulasi bakteri
uji dan dieramkan. Dasar pengamatannya adalah dengan melihat tumbuh
atau tidaknya bakteri.
1) Cara pengenceran tabung ( Metode Kirby-Bauer)
13

Pada metode ini zat yang akan diuji kepekaan antibakterinya

diencerkan secara serial dengan pengenceran kelipatan dua dalam
medium cair, kemudian diinokulasikan dengan bakteri uji, inkubasi
pada suhu 37oC selama 18-21 jam (untuk bakteri) dan pada suhu
kamar 1-2 minggu (untuk jamur). Aktivitas antibakteri ditentukan
sebagai konsentrasi terendah yang masih dapat menghambat
pertumbuhan bakteri.
2) Cara penapisan lempeng
Pada metode ini zat yang akan diuji antibakterinya diencerkan
secara serial dengan pengenceran kelipatan dua dalam medium agar
pada suhu 40-50oC, kemudian dituang dalam cawan Petri. Setelah
lempeng agar membeku ditanam inokulum bakteri dan diinkubasi
pada suhu dan jangka waktu yang sesuai dengan pertumbuhan bakteri
uji. Kadar hambat minimum zat antibakteri yang diuji, ditentukan
sebagai konsentrasi terendah yang masih dapat menghambat
pertumbuhan bakteri.
c. Turbidimetri
Pada metode ini pengamatan aktivitas didasarkan atas kekeruhan yang
terjadi pada medium pembenihan. Pertumbuhan bakteri juga dapat
ditentukan dari perubahan yang terjadi sebelum dan sesudah inkubasi,
yang dilakukan dengan mengukur serapannya secara spektrometer.
Adanya pertumbuhan bakteri ditandai dengan peningkatan jumlah sel
bakteri, yang mengakibatkan meningkatnya kekeruhan. Kekeruhan yang
terjadi umumnya berbanding lurus dengan serapan.

14

BAB III
TUJUAN PENELITIAN
Adapun penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan senyawa baru dari
turunan vanillin dan mengetahui profil antibakteri senyawa vanilil salisilat.

15

BAB IV
METODE PENELITIAN
A. Alat dan Bahan
Labu leher dua, hot plate dan stirrer, kondensor, termometer, spatula,
corong pisah, Ring Stand, Cawan Petri, pipet ukur, Erlenmeyer, Beaker
Glass, tabung reaksi, gelas ukur, perangkat ekstraksi, autoklaf, Inkubator,
oven, rotary evaporator, timbangan analitik, jarum ose, pinset, jangka sorong,
mikropipet (brand), laminar air flow, labu ukur. alumunium foil, kapas, spatel,
silinder, dan lain-lain.
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi: Bakteri
Escherichia coli ATCC 25922 dan Staphylococcus aureus ATCC 25923
diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas
Indonesia. Medium yang digunakan medium TSA (Tryptone Soya Agar) dan
medium TSB (Tryptone Soya Broth). Bahan kimia meliputi Vanilin, Asam
Salisilat, Etanol, Aseton, H2SO4 pekat, NaHCO3 10%, Na2SO4 anhidrat,
NaBH4, CH2Cl2, etil asetat, n-heksana dan aquades.
B. Prosedur kerja
1. Reduksi Vanilin dengan Natrium Borohidrida.
Ke dalam labu leher tiga kapasitas 250 mL yang dilengkapi dengan
termometer, pendingin balik dan pengaduk magnet serta penangas air
dimasukkan 1,5 gram (0,04 mol) NaBH4 dan 3 gram (0,0197 mol) vanilin
dalam pelarut etanol. Campuran diaduk selama 40 menit pada suhu kamar.
Campuran kemudian diasamkan dengan HCl 2,5 M sampai pH 4,5,
kemudian diekstraksi dengan CH2Cl2, ditambah dengan Na2SO4 anhidrous,
disaring dan dievaporasi. Analisis senyawa hasil dilakukan dengan FT-IR.
2. Esterifikasi
Reaksi esterifikasi dilakukan dengan cara memasukan 1,232 gram
vanilin alkohol (0,008 mol), 0,2763 gram asam salisilat (0,002 mol), 20 ml
pelarut aseton dan 1 tetes katalis asam sulfat pekat ke dalam labu bulat
yang dilengkapi dengan kondensor, chiller dan hot plate stirrer pada suhu
56-60 C selama 24 jam.
3. Pemurnian hasil reaksi
Setelah hasil reaksi, filtrat kemudian ditambahkan dengan larutan
NaHCO3 10% sampai tidak terbentuk lagi CO2. Filtrat kemudian
16

dimasukkan dalam corong pisah yang telah berisi kloroform lalu dikocok.
Campuran dicuci sebanyak 3 kali. Hal ini bertujuan agar ester yang
terbentuk dipisah dari pengotor yang bersifat polar. Kemudian fasa organic
dipisahkan dari fasa airnya, ditambahkan dengan Na 2SO4, lalu disaring.
Setelah disaring kemudian pelarutnya diuapkan.
4. Uji Hasil Reaksi Esterifikasi
Senyawa ester yang dihasilkan diuji dengan KLT menggunakan
pelarut pengembang etil asetat dan n-heksana. Setelah produk ester
dilakukan pemurnian dianalisis dengan instrumentasi FT-IR, LC-MS,
Spektofotometer UV-Vis dan penentuan titik leleh. Rendemen hasil
sintesis dapat diperoleh dengan teoretis:
Rendemen

Bobot hasil sintesis

100%
Bobot teoretis

5. Bakteri Uji
Staphylococcus aureus merupakan bakteri gram positif berbentuk kokus
yang merupakan bakteri patogen bagi manusi. Staphylococcus aureus dapat
menyebabkan infeksi pada kulit dan jaringan lunak secara invasif seperti
pneumonia, osteomielitis, meningitis dan endocarditis (Bartlett & Hulten
2010). Staphylococcus aureus merupakan bakteri yang telah banyak resisten
terhadap beberapa antibiotik antara lain golongan penisilin, metisilin, kuinolon
dan vankomisin (Lowy 2003).

6. Uji Aktivitas Antibakteri

Uji aktivitas antibakteri dengan menggunakan metode difusi agar yang dinilai
melalui diameter zona hambatnya (Davis & Stout 1971). Berikut adalah
prosedur pengujian aktivitas antibakteri:

17

a) Pembuatan Medium TSA (Tryptone Soya Agar) dan Medium TSB

(Tryptone Soya Broth)
Bubuk TSA dan TSB dimasukkan ke dalam Erlenmeyer masing-masing
sebanyak 10 gram dan 7,5 gram, lalu masing-masing dilarutkan dengan
menambahkan 250 ml aquades. Kemudian dipanaskan hingga mendidih di
atas hot plate sambil dihomogenkan dengan menggunakan magnetic stirer.
Setelah itu medium di sterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121C
dengan tekanan 15 lbs selama 15 menit.
b) Peremajaan Bakteri
Biakan bakteri E. coli dan S. aureus sebanyak satu ose diinokulasikan ke
dalam medium agar miring TSA secara terpisah dan aseptis dengan
meletakkan jarum ose yang mengandung biakan pada dasar kemiringan
agar dan ditarik dengan gerakan zig-zag. Bakteri E. coli dan S. aureus
sebanyak dua ose diinokulasikan kedalam medium TSB yang terpisah.
Selanjutnya masing-masing diinkubasi pada suhu 37C selama 24 jam.
Peremajaan dilakukan setiap minggu.
c) Pengujian Aktivitas Antibakteri
Uji aktivitas antibakteri dilakukan terhadap dua jenis bakteri yaitu bakteri
E. coli dan S. aureus. Pengujian antibakteri dilakukan dengan metode
difusi agar. Cara kerja metode difusi agar adalah bakteri uji yang telah
diremajakan diinokulasikan kedalam TSA sebanyak 200 l lalu diratakan
ke dalam medium yang berisi bakteri lalu dimasukkan kertas cakram 6
mm dan ditetesi dengan larutan vanillil salisilat dengan konsentrasi 100%
sebanyak 20 l (5 g). Setelah itu di simpan selama 24 jam pada suhu
37oC di ukur diameter hambatan yang terbentuk menggunakan jangka
sorong.
d) Penetapan Nilai Konsentrasi Hambat Minimum (KHM)
Setelah diketahui bahwa vanillin salisilat memiliki aktivitas antibakteri
selanjutnya dilakukan penetapan konsentrasi hambat minimum dari
vanillin salisilat tersebut. Tujuannya untuk mengetahui kadar terendah dari
vanillin salisilat yang masih memberikan aktivitas antibakteri terhadap
18

bakteri uji. Metode penetapan yang dilakukan adalah dengan metode agar
padat. Sampel vanillin salisilat dibuat dengan berbagai konsentrasi mulai
dari yang besar hingga yang kecil.
e) Diameter zona hambat
Diameter zona hambat yang terbentuk karena adanya daya antibakteri
vanillin salisilat yang diukur dari sisi sebelah kiri sampai sisi sebelah
kanan dengan menggunakan jangka sorong.

19

BAB VI
JADWAL PELAKSANAAN
Penelitian ini akan dilakukan di Laboratorium Kimia Terpadu dan
Laboratorium Mikrobiologi FFS Universitas Muhammadiyah Prof. DR. HAMKA
Waktu penelitian mulai dilakukan pada bulan November 2015 sampai dengan Mei
2016.
Tabel III. Jadwal penelitian
Pengumpulan

Kegiatan
dan
penyediaan

Tanggal
bahan November

Keterangan
PBF
Toko Kimia

penelitian
2015
Reduksi Vanilin menjadi Vanilil Alkohol dan 15 Desember UHAMKA
Uji Identifikasi FT-IR
2015
Sintesis Vanilil Salisilat, Pemurnian dan 1 Januari 2016 UHAMKA
Farmalab
Identifikasi senyawa
Pembuatan medium, pembiakan bakteri Uji, 1 Maret 2016 UHAMKA
pembuatan suspensi, uji KHM
Pengamatan Hasil Uji KHM
Analisa data hasil penelitian
Penulisan Laporan Penelitan

15 Maret 2016 UHAMKA

1 April 2016
UHAMKA
1 Mei 2016

20

DAFTAR PUSTAKA
Alcama, E. 1983. Fundamental of Microbiology. Addison Wesley Publishing
Company. London. Hal 534 536
Augustine, R.L. 1996. Heterogeneus Catalysis For The Synthtic Chemistry. New
York: Marcel Dokker Inc.
Atkins, P.W.1997. Kimia Fisika jilid2.Jakarta: Penerbit Erlangga.
Badarinath, a. V. et al., 2010. A review on In-vitro antioxidant methods:
Comparisions, correlations and considerations. International Journal of
PharmTech Research, 2(2), pp.12761285.
Bartlett, A.H. & Hulten, K.G., 2010. Staphylococcus aureus pathogenesis:
secretion systems, adhesins, and invasins. The Pediatric infectious disease
journal, 29(9), pp.860861.
Budimarwanti, C. 2009. Sintesis Senyawa 4-Hidroksi -5-Dimetilaminometil-3Metoksibenzil Alkohol dengan Bahan Dasar Vanilin Melalui Reaksi
Mannich. Jurusan Pendidikan Kimia FMIPA. Univeristas Negeri Yogyakarta.
Davis, W.W. & Stout, T.R., 1971. Disc plate method of microbiological antibiotic
assay. Applied microbiology, 22(4), pp.659665.
Chatib, U. 1993. Buku Ajar Mikrobiologi Kedokteran. Edisi Revisi. Binarupa
Aksara. Jakarta. Hal 103 111
Chuenchit Boonchird and T. W. Flegel.In Vitro antifungal activity of eugenol and
vanillin against Candida albicans and Cryptococcus neoformans.
Departement of Microbiology, faculty of science, Mahidol University, Rama
VI Road, Bangkok, Thailand.
Dwijoseputro, P. 2003. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan. Jakarta. Hal 22 24
DepKes RI, 1995, Farmakope Indonesia Edisi IV. Departemen Kesehatan
Republik Indonesia
Dwi W., C. Budimarwanti. 2013. Sintesis Vanili sinamat dari Vanilil Aklohol dan
Asam Sinamat Melalui Reaksi Esterifikasi Fischer.Skripsi: Universitas
Negeri Yogyakarta
Fessenden dan fessenden. 1986. Kimia organik. jilid 2. Jakarta: penerbit Erlangga.
Fitzgerald D.J. , Stratford M., Gasson M.J. , Ueckert J. , Bos A. and Narbad A.
2004. Mode of antimicrobial action of vanillin against Escherichia coli,
Lactobacillus plantarum and Listeria innocua. Journal of Applied
Microbiology 97: 104113
Ganiswara, S. G. 1995. Farmakologi dan Terapi. Edisi IV. Bagian Farmakologi
Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia, Jakarta. Hal. 571 573
Hocking, M.B. 1997. J. Chem. Educ. 74, 1055-1059. The Merck Index. An
Encyclopedin Of Chemicals, drugs, and biological40th ed. Merck & Co., Inc.
Whitehouse station, NY,USA. Hal 1112.
Jawetz, E., Melnick, J.L dan Adelberg. 1995. Mikrobiologi Kedokteran Ed 20.
Penerjemah : Nani Widorini. Buku Kedokteran EGC, Jakarta. Hal. 233-235
Jones, Chem. 1958. The Merck Index. An Encyclopedin Of Chemicals, drugs, and
biological40th ed. Merck & Co., Inc. Whitehouse station, NY,USA. Hal 834.

21

Katzung, B. G. 1997. Farmakologi Dasar dan Klinik. Ed. 8. Penerjemah :

Staf Dosen Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Sriwijaya.
Salemba Medika, Jakarta. Hal. 722 724
Kumar, R., Sharma, P.K. & Mishra, P.S., 2012. A review on the vanillin
derivatives showing various biological activities. International Journal of
PharmTech Research, 4(1), pp.266279.
Lowy, F.D., 2003. Antimicrobial resistance: the example of Staphylococcus
aureus. Journal of Clinical Investigation, 111(9), pp.12651273.
Oliveira, C.B.S. et al., 2014. Comparative study on the antioxidant and antiToxoplasma activities of vanillin and its resorcinarene derivative. Molecules,
19(5), pp.58985912.
Oneil, M. 2006. The Merck Index. An Encyclopedin Of Chemicals, drugs, and
biological40th ed. Merck & Co., Inc. Whitehouse station, NY,USA. Hal 563.
Pelczar, MZ dan Chan. E.C.S, 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Terjemahan
Ratna Sari Hadioetomo dkk. UI Press. Jakarta. Hal 189 199
Ravendra Kumar, P.K. Sharma, Prem Shanker Mishra, A Review on the Vanillin
derivates showing various Biological activities. Depertement of
Pharmaceutical Technology, Meerut Institute of Engineering & Technology,
NH-58, Baghpat crossing, Delhi-Haridwar Highway, Meerut 250005, U.P.,
India.
Rakchoy, S., Suppakul, P. & Jinkarn, T., 2009. Antimicrobial effects of vanillin
coated solution for coating paperboard intended for packaging bakery
products. As. J. Food Ag-Ind., 2(04), pp.189196.
Sri Katon S, Hanny Nilasari, dan Evita Halim. 2012. Penggunaan Asam Salisilat
dalam Dermatologi J. Indon. Med. Assoc. 62(07). Fakultas Kedokteran .
Universitas Indonesia
Sunardi. 2006. Diktat Kuliah Cara-Cara Pemisahan. Depok: Departemen Kimia
FMIPA UI.
Sykes, P. 1989. Penuntun Mekanisme Reaksi Kimia Organik. Gramedia. Jakarta.
Tai, A. et al., 2011. Evaluation of antioxidant activity of vanillin by using multiple
antioxidant assays. Biochimica et Biophysica Acta, 1810(2), pp.170177.
Williams, D.H. & Fleming, I. 1980.Spectroscopic methods in organic chemistry:
London: Mcgraw-Hill.
Yogesh Kumar Vaghasiya a, Rathish Naira, Mayur Sonib, Shipra Balujab, and
Sumitra Chandaa, Synthesis, structural determination and antibacterial
activity
of
compounds
derived
from
vanillin
and
4aminoantipyrine.Departement of Bioscienses and Departement of Chemistry,
Saurashtra University, Rajkot 360005, India.

22