Dokumen - Tips Mikrodilusi
Dokumen - Tips Mikrodilusi
KELOMPOK C2
I Putu Riska Winatha
08613007
Fajar Handayani
09613149
Arum Wahyuningsih
09613152
09613153
09613155
I.
TUJUAN
Mahasiswa dapat menentukan MIC dan MBC suatu antibiotika terhadap
bakteri menggunakan teknik dilusi dan mikrodilusi
II.
LATAR BELAKANG
Mikroorganisme terdapat di berbagai habitat, seperti dalam tanah,
lingkungan akuatik dan atmosfer, selain itu juga terdapat di permukaan
tubuh, di dalam sel pencernaan makanan, mulut, hidung dan bagianbagian tubuh yang lain. Mikroorganisme dapat hidup jika pada kondisi
yang sesuai, yaitu kecukupan mendapat makanan, kelembapan dan suhu.
Mikroorganisme tidak dapat dipisahkan dengan lingkungan abiotik dan
biotik dari suatu ekosistem karena peranannya sebagai pengurai. Mikrobia
dapat menyebabkan banyak bahaya, karena dapat menginfeksi organisme
lain mulai dari infeksi ringan sampai kepada kematian. Patogenesis infeksi
bakteri meliputi permulaan awal dari proses infeksi hingga mekanisme
timbulnya tanda dan gejala penyakit. Ciri- ciri bakteri patogen yaitu
kemampuan untuk menularkan, melekat pada sel inang, menginvasi sel
inang dan jaringan, mampu untuk meracuni serta mampu untuk
menghindari dari sistem kekebalan inang. Beberapa infeksi disebabkan
oleh bakteri yang secara umum dianggap patogen tidak menampakkan
gejala (asimptomatik). Suatu penyakit terjadi jika bakteri atau reaksi
imunologi yang ditimbulkannya menyebabkan suatu bahaya bagi
seseorang. Maka untuk menghambat daya infeksi agar tidak berkelanjutan
lebih tinggi, bahkan kematian, perlu adanya antibakteri atau antibiotik
sebagai obatnya.
III.
DASAR TEORI
Antibiotik adalah senyawa kimia khas yang dihasilkan oleh
organisme hidup, termasuk turunan senyawa dan struktur analognya yang
dibuat secara sintetik, dan dalam kadar rendah mampu menghambat proses
penting dan kehidupan satu spesies atau lebih mikroorganisme
(Siswandono,2000).
Berdasarkan sasaran bakteri, antibiotic dibedakan menjadi :
a. Antibiotik spectrum sempit (narrow spectrum) yaitu antibiotic yang
hanya ektif terhadap mikroba pathogen terbatas. Contohnya :
ampisilin, streptomisin, sefalosporin.
b. Antibiotik spectrum luas (broad spectrum) yaitu antibiotic yang efektif
terhadap berbagai macam pathogen. Contohnya : eritromisin,
gentamisin, isoniazid (Ganiswara, 2005).
Mekanisme aksi antibiotic :
1. Menghambat pembentukan dinding sel.
Contoh : penisilin, ampisilin, metsilin, sefalosporin.
2. mengganggu pembentukan membrane sel.
Contoh : polimiksin B.
3. menghambat sintesis protein.
Contoh : streptomisin, gentamisin, kloramfenikol.
4. Menghambat sintesis asam nukleat.
Contoh : siproploksazin, nifampin.
5. antagonis metabolit
contoh : isoniazid (Jawetz,2001).
Resistensi bakteri adalah suatu sifat tidak terganggunya kehidupan
sel bakteri oleh antimikrobia. Secara umum resistensi di bagi dalam 3
kelompok :
A. Resistensi genetic
Terjadi mutasi spontan pada gen bakteri sehingga terjadi perubahan
pada bakteri yang semula sensitive terhadap suatu antimikrobia
4. Menggunakan
kombinasi
antibiotic
yang
telah
terbukti
keefektifannya.
5. Mengguanakan antibiotic yang lain bila ada tanda-tanda bahwa
suatu organisme akan menjadi resisten terhadap antibiotic yang
digunakan semula.
Penyebab mikroorganisme resisten terhadap antibiotic adalah
1. Pemakaian antibiotic yang tidak tepat.
2. Pengobatan yang tidak tuntas antau penghentian antibiotic sebelum
bakteri benar-benar mati.
3. Pemakaian dosis obat antibiotic dibawah dosis terapi.
4. Bakteri bersifat resisten karena mutasi.
Penentuan kepekaan bacteria pathogen terhadap antimikrobia dapat
dilakukan dengan salah satu dari dua metode pokok yakni dilusi atau
difusi.
1. DILUSI PADAT ATAU CAIR
Pada prinsipnya antibiotik diencerkan hingga beberapa konsentrasi.
Pada delusi cair, masing-masing konsentrasi obat ditambah suspensi
kuman dalam media. Sedangkan pada delusi pada tiap konsentrasi obat
dicampur dengan media agar, lalu ditambah kuman (Lay, 1994).
2. DIFUSI
Media yang dipakai adalah agar Mueller Hilton dan pada difusi ini ada
beberapa cara yaitu :
a. Cara Kirby Baeur
1. Ambil beberapa koloni kuman dari pertumbuhan yang
diinkubasi selama 24 jam pada agar. Suspensikan ke dalam 0,5
ml BHI cair, inkubasi 5-8 jam pada suhu 37C.
disebut
bakterisidal,
sedangkan
bahan
kimia
yang
menghambat
wilayah
jernih
merupakan
petunjuk
kepekaan
IV.
V.
CARA KERJA
A. TeknikDilusiCair
1. HariPertama
2. Harikedua
3. Hari ketiga
VI.
Gambar. 1
Keterangan Gambar 1 :
Tabung A : 400 g/ml
Tabung B : 200 g/ml
Tabung C : 100 g/ml
Tabung D : 50 g/ml
Tabung E : 25 g/ml
(bening/tidak keruh = tidak terjadi pertumbuhan bakteri )
Gambar. 2
Keterangan :
Tabung K (+) = tabung control positive berisi media + bakteri (keruh)
Tabung K (-) = Tabung control negative berisi Aquades (bening)
2. Hasil data
Dilusi Cair
Kadar sampel
Hasil
400 g/ml
(-)
200 g/ml
(-)
100 g/ml
(-)
50 g/ml
(-)
25 g/ml
(-)
Tabung
Absorbansi
Kontrol (+)
0.360
Kontrol (-)
0.103
0.105
0.101
0.104
0.094
0.092
A.
0,3600,105
x 100 =99,22
0,3600, 103
B.
0,3600,101
x 100 =100,78
0,3600, 103
C.
0,3600,104
x 100 =99,61
0,3600, 103
D.
0,3600,094
x 100 =103,50
0,3600, 103
E.
0,3600,092
x 100 =104,28
0,3600, 103
VII.
PEMBAHASAN
Untuk menentukan MIC dan MKC maka dilakukan teknik dilusi.
Metode dilusi dibedakan menjadi 2 macam, yakni dilusi cair dan dilusi
padat, perbedaanya terletak pada media pertumbuhan yang digunakan.
Dilusi cair, menggunakan media tumbuh berupa agar yang cair, sedangkan
dilusi padat menggunakan menggunakan media agar padat. Untuk
menentukan MIC dan MKC pada bakteri E. Colly ini digunakan teknik
dilusi cair. MIC merupakan konsentrasi terendah bahan antimikrobial yang
dapat menghambat pertumbuhan bakteri, untuk MKC merupakan
konsentrasi
terendah
antibiotik
yang
mematikan
bakteri.
Bahan
Metode dilusi juga memiliki kekurangan yaitu metode ini bersifat subjektif
karena parameter yang digunakan adalah kekeruhan.
Hari pertama praktikum melakukan inkubasi bakeri E. colly
dimana dilakukan pengenceran pada 5 tabung reaksi yang berisi antibiotik
ampicilin. Ampicilin merupakan golongan antibiotic Penisilin. Penisilin
adalah antibiotika yang termasuk paling banyak dan paling luas dipakai.
Golongan penisilin bersifat bakterisid dan bekerja dengan mengganggu
sintesis dinding sel. Antibiotika penisilin mempunyai ciri khas secara
kimiawi adanya nukleus asam amino-penisilinat, yang terdiri dari cincin
tiazolidin dan cincin betalaktam. Spektrum bakteri terutama untuk bakteri
Gram positif. Beberapa golongan penisilin ini juga aktif terhadap bakteri
Gram negative. Sehingga antibiotic ini aktif dalam menghambat bakteri
Eschericia colly.
Konsentrasi antibiotik yang digunakan adalah 400 g/ml. Dan
untuk media agar yang digunakan adalah media TSB. Pengenceran hanya
dilakukan dari tabung ketiga yng diambil dari tabung kedua. Untuk tabung
pertama dan kedua diambil langsung dari konsentrasi antibiotik
400g/ml.Pengenceran yang dilakukan adalah 400g/ml, 200g/ml, 100g/ml,
50g/ml, 25g/ml. Dua tabung yang lain digunakan sebagai kontrol, tabung
1 berisi media agar cair dengan aqudes, dan tabung yang lain berisi media
cair dengan bakteri. Dan dinnkubasi selama 24 jam, dengan suhu 37 0c.
Suhu 370c adalah menyesuaikan dengan suhu tubuh pada manusia,
sedangakan waktu 24 jam dalah waktu maksimum pertumbuhan bakteri.
Pada praktikum kali ini setelah dilakukan teknik dilusi pada hari
pertama dan tabung berisi biakan berbagai konsentrasi antibiotik di
inkubasi selama 24 jam, maka tabung dengan jumlah konsentrasi antibiotik
terendah
yang
jernih
menunjukkan
MIC
(Minimum
Inhibitory
Semua tabung dari konsentrasi 400, 200, 100, 50, 25 g/ml tidak
menunjukkan pertumbuhan bakteri, menurut definisi dari MIC adalah
kadar terendah antibiotik yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri,
maka kadar hambat minimum adalah 25 g/ml.
Kekeruhan menunjukkan bakteri masih dalam keadaan baik.
Kekeruhan memiliki standar brown atau Standar Kekeruhan McFarland.
Standar McFarland berada dalam bentuk skala yang bernomor dari 1
sampai 10, yang menjelaskan konsentrasi spesifik dari bakteri per mL. Ini
didesain untuk digunakan dalam mengestimasi konsentrasi bakteri Gram
negatif. Kekeruhan larutan bakteri pada tiap tabung kurang lebih sesuai
dengan nomor skala McFarland yaitu kekeruhan bakteri pada konsentrasi
2,1 x 109/mL. jadi penambahan bakteri pada tiap tabung diperlukan standar
McFarland agar dihasilkan konsentrasi yang sama sehingga saat diinkubasi
dan dibaca hasil presentase kematian bakteri didapatkan hasil yang benar
dalam perhitungan presentase kematian bakteri.
Selanjutnya media dimikropipet sebanyak 50l dalam lubang
mikroplate yang kemudian dianalisis dengan metode ELISA ( Enzym
Linked Immun Sorbent Assay). Metode ELISA ini akan membaca
absorbansi dengan panjang gelombang 570 nm.
Pada praktikum ini hanya bisa diketahui MIC-nya karena untuk
menentukan MKC dibutuhkan kultur ulang dengan pembuatan media TSB
yang baru dan diambil dari kadar terendah dari MIC. Jadi nilai absorbansi
yang dianalisis menggunakan metode ELISA yaitu pembacaan absorbansi
dari MBC.
Dari hasil yang diperoleh dapat dihitung prosentasi kematian sel
bakteri dengan rumus :
(|kontrol|| perlakuan|)
100
(|kontrol||media|)
Dengan absorbansi kontrol sama dengan absorbansi pada kontrol positif,
dan absorbansi media sama dengan absorbansi kontrol negatif. Pengadaan
kontrol negatif yang berisi media + aquades berfungsi untuk mengetahui
media yang digunakan masih baik atau tidak, sedangkan kontrol positif
yang berisi media dan bakteri berfungsi untuk mengetahui apakah bakteri
yang digunakan masih baik atau tidak.
Hasil yang didapat kurang signifikan, seharusnya semakin tinggi
konsentrasi antibiotik semakin rendah serapan dari hasil ELISA karena
semakin sedikit pula bakteri yang masih hidup. Hal ini dapat disebabkan
karena kesalahan saat proses dilusi dimana terjadi kesalahan pengenceran
pada tabung C sehingga konsentrasi antibiotik pada tabung C,D, dan E
tidak lagi diketahui.
Kelebihan dari metode mikrodilusi cair ini adalah dapat
memberikan hasil kuantitatif yang menunjukkan jumlah antimikroba yang
dibutuhkan untuk mematikan bakteri.
VIII. KESIMPULAN
Semakin tinggi konsentrasi antibiotik yang digunakan maka
semakin banyak bakteri yang mati. MIC yang didapatkan pada kadar 25
g/ml.
IX.
DAFTAR PUSTAKA
1. Jawetz, Melnick, & Adelbergs, 2001, Mikrobiologi Kedokteran,
Penerjemah Bagian Mikrobiologi Fakultas Kedokteran UNAIR,
Penerbit Salemba Medika, Jakarta, Hal 223-228, 351-357
2. Mulyaningsih, S, 2004, Mikrobiologi Dasar, FMIPA UII, Yokyakarta
3. Pelczar, Michael J.,& E.C.S. Chan, 1988, Dasar-Dasar Mikrobiologi,
edisi 2,Penerbit UI-Press, Jakarta, Hal 515-522
4. Waluyo, Lud, 2005, Mikrobiologi Umum, UMM-Press, Malang