Diagnosis virus patogen tanaman (tugas klintan 3)

DIAGNOSIS VIRUS PATOGEN TANAMAN

Oleh: SADATIN GHURRI

Diagnosis OPTK golongan virus merupakan langkah penting untuk menentukan virus penyebab penyakit yang terbawa media pembawa. Diagnosis menggambarkan tentang rangkaian kegiatan deteksi dan identifikasi patogen penyebab penyakit, sehingga dapat ditentukan spesies virus penyebab penyakit yang terbawa oleh media pembawa tersebut. akan memudahkan Petugas Karantina melakukan tindakan pengujian di laboratorium. Metode diagnosis virus penyebab penyakit tanaman ada beberapa antara lain pengujian melalui pengamatan badan inklusi virus, pengujian menggunakan tanaman indikator, pengujian secara serologi/ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay), dan secara molekuler. Sensitifitas masing-masing metode tergantung pada jenis virus dan jumlah titer virus pada tanaman terinfeksi. Untuk virus-virus golongan Tobamovirus dapat diamati badan inklusinya dengan mudah namun tidak demikian halnya dengan virus golongan lain. 1. Prosedur Preparasi Sampel Media Pembawa Media Pembawa sebagai sasaran pengujian antara lain biji, umbi, stek, daun, batang, akar, plantlet, dan polen. Prosedur preparasi sampel merupakan proses penyiapan sampel media pembawa sebelum dilakukan pengujian di Laboratorium. Prosedur preparasi sampel dilakukan hanya untuk media pembawa yang perlu ditumbuhkan (biji dan umbi), sedangkan untuk media pembawa selain biji dan umbi dapat langsung dilakukan pengujian. Penumbuhan biji dan umbi ditujukan untuk meningkatkan konsentrasi virus serta meminimalkan konsentrasi senyawa inhibitor pada media pembawa yang akan mengganggu proses pengujian. 1.1 Prosedur Preparasi Sampel Bentuk Biji Instruksi Kerja : - Siapkan sampel kerja (sesuai Petunjuk Teknis Pengambilan Sampel Bentuk Biji, (Pusat Karantina Tumbuhan tahun 2007), - Tanam biji di dalam nampan yang telah dialas 3-5 lembar kertas towel/ kertas sejenis yang lembab, Tutup nampan dengan plastik penutup bening (cling wrap), - Simpan nampan yang telah berisi biji selama 3-5 hari pada tempat cukup cahaya dan bersuhu ruang (nampan juga dapat disimpan di Growth Chamber bersuhu 27C dengan pengaturan lampu selama 12 jam terang dan 12 jam gelap). Catatan: Perkecambahan dapat dipercepat dengan cara merendam biji sampel kerja pada air mengalir selama kurang lebih 3-12 jam. Cara ini dilakukan sebelum biji ditanam pada nampan. 1.2 Prosedur Preparasi Sampel Bentuk Umbi Instruksi Kerja : Siapkan sampel kerja, - Umbi yang belum bertunas, antara lain kentang, caladium, disimpan di tempat yang kering dan

cukup cahaya selama 5 hari, hingga tumbuh tunas 0,5 1 cm, - Umbi bertunas antara lain lilium, umbi lapis, pengujian dapat langsung dilakukan dengan mengambil mata tunas. 2. Metode Diagnosis secara Biologi 2.1. Pemeriksaan gejala penyakit pada tanaman atau bagian tanaman Pemeriksaan berdasarkan gejala penyakit pada tanaman atau bagian tanaman (termasuk benih) dapat membantu diagnosis awal penyebab penyakit tanaman oleh virus. Tanaman atau bagian tanaman dengan gejala spesifik dapat di deteksi berdasarkan metode ini. Pemeriksaan dapat dilakukan terhadap keberadaan badan inklusi partikel virus, terjadinya nekrosis pada jaringan floem, atau deposisi enzim kalose (Hunter D. 2001). Alat dan Bahan: - Kaca pembesar/ loup/ Mikroskop cahaya - Kamera untuk dokumentasi - Alat pemotong (pisau/ gunting/ silet), - Bahan pewarna : trypan blue, phloroguicinol, - Gelas obyek dan gelas penutup. Instruksi Kerja untuk Pengamatan Badan Inklusi : - Tanaman atau bagian tanaman yang akan diperiksa dilihat dengan menggunakan kaca pembesar, agar gejala penyakit yang ada pada tanaman atau bagian tanaman dapat terlihat dengan lebih jelas, - Lakukan pemotongan jaringan tanaman menggunakan pisau/ silet steril dan letakkan di atas gelas obyek, Tetesi jaringan dengan trypan blue, tutup dengan kaca penutup, - Amati badan inklusi virus akan tampak berwarna biru tua menggunakan mikroskop cahaya . - Dokumentasikan tanaman atau bagian tanaman yang menunjukkan gejala infeksi virus tanaman, sehingga dapat dijadikan bukti ilmiah untuk dilakukan identifikasi lebih lanjut menggunakan metode yang lebih valid.

Catatan : Badan inklusi yang berada pada jaringan terinfeksi virus kadang-kadang dapat digunakan sebagai pengenalan awal virus ke dalam suatu grup. Beberapa virus dapat diamati badan inklusinya antara lain Bean Yellow Mosaic Virus, Turnip Mosaic Virus, Cauliflower Mosaic Virus, Dahlia Mosaic Virus, Red Clover Vein Mosaic virus, Tobacco Etch Virus, Tobacco Mosaic Virus, dan Watermelon Mosaic Virus (Hunter D. 2001) Instruksi Kerja untuk Pengamatan Nekrosis pada Jaringan Floem : - Irislah bagian jaringan floem pada batang terinfeksi virus menggunakan pisau/ silet steril lalu letakkan pada gelas obyek, Warnai jaringan dengan Phloroglucinol, - Amati dibawah mikroskop. Jaringan nekrosis akan tampak berwarna lebih gelap dibanding jaringan yang tidak mengalami nekrosis. Catatan :

Infeksi tanaman kentang oleh Potato Leaf Roll Virus akan menginduksi terjadinya nekrosis pada jaringan floem pada umbi dan batang kentang. Nekrosis yang terjadi dapat diamati di bawah mikroskop setelah dilakukan pewarnaan dengan phlorogucinol (Hunter D. 2001). Instruksi Kerja untuk Uji Igel Lange (pengamatan deposisi kalose ) : - Irislah bagian jaringan umbi atau floem pada batang, yang terinfeksi virus menggunakan pisau/ silet steril lalu letakkan pada gelas obyek, - Warnai jaringan dengan resorcin blue, - Amati dibawah mikroskop. Kalose yang terdeposit pada jaringan floem akan mengalami perubahan menjadi biru, Catatan : Metode uji ini umum digunakan untuk deteksi Potato Leaf Roll Virus pada batang atau umbi kentang (Hunter D. 2001).

2.2 Penggunaan tanaman indikator Ada beberapa jenis tanaman yang sangat rentan terhadap virus tertentu dan menunjukkan gejala yang khas sehingga dapat dimanfaatkan sebagai metode untuk mendeteksi dan mengidentifikasi virus tertentu (Walkey 1991). Untuk dapat menerapkan metode deteksi ini, terlebih dahulu harus diketahui sifat dari virus yang akan diuji, diantaranya cara penularan dan jenis gejala yang ditimbulkan pada tanaman yang dijadikan tanaman indikator Alat dan Bahan: Tanaman indikator dipilih berdasarkan Virus yang akan diuji Mortar dan pistil - Buffer Fosfat pH 7 mengandung 1% B-mercapthoethanol (yang ditambahkan sesaat sebelum digunakan) Aquadest Alat pemotong (pisau atau gunting) steril Kain kasa Sentrifuge Tabung sentrifuge Sarung tangan karet - Karborundum 600 mesh Instruksi Kerja: 1. Buat sap dari tanaman atau bagian tanaman yang terinfeksi virus dengan cara menggerus jaringan terinfeksi dengan 0.01 M buffer fosfat dingin pH 7 dengan perbandingan 1:10 b/v (berat/volume). Lakukan persiapan sap dalam kondisi dingin , 2. Saring sap tanaman dengan menggunakan kain kasa, bila diperlukan, 3. Karborundum ditaburkan pada bagian tanaman indikator yang akan diinokulasi, 4. Oleskan sap menggunakan jari tangan bersarung karet pada bagian tanaman indikator yang telah ditaburi dengan karborundum, 5. Setelah inokulasi, bagian tanaman yang diinokulasi dibilas dengan menggunakan aquadest, 6. Simpan/ inkubasi tanaman di Rumah Kaca/Growth Chamber. Selama masa inkubasi, kelembaban lingkungan tanaman dijaga, agar mendukung perkembangan infeksi virus yang

diinokulasikan. 7. Gejala akan tampak setelah 3 7 hari setelah inokulasi. (Berg (1962), Hollings (1957), Yarwood (1953) dalam Noordam 1973) Catatan Lakukan inokulasi ke tanaman indikator pada pagi atau sore hari. :

3 Metode Diagnosis Secara Serologi Prinsip kerja serologi didasarkan pada reaksi spesifik antara antigen dan antibodi (antiserum) sehingga terbentuk reaksi conjugate antibody-enzyme (Hunter D. 2001).

3.1. Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Metode pengujian ini mulai berkembang sejak tahun 1971. ELISA merupakan suatu metode pengujian serologi yang melekatkan kompleks ikatan antara antibodi dengan antigen di dalam sumuran plate ELISA yang terbuat dari bahan plastik (Dijkstra et al. 1998). Jika terjadi reaksi kompatibel antara antibodi dengan antigen akan ditunjukkan dengan adanya perubahan warna yang terjadi. Keunggulan metode ini (Dijkstra et al. 1998): 1. Dapat mendeteksi virus padakonsentrasi rendah (1-10 ng/ml) 2. Penggunaan antibodi dalam jumlah sedikit 3. Hasil pengujian pada sap tanaman sama baiknya dengan pengujian pada suspensi virus yang dimurnikan 4. Pengujian dapat diaplikasi pada sampel pengujian dalam jumlah besar 5. Pengujian dapat distandarkan dengan menggunakan kit bahan pengujian 6. Memungkinkan untuk mendapatkan hasil secara kuantitatif (nilai absorbansi) disamping hasil kualitatif (perubahan warna) Dalam perkembangannya, metode ini mengalami modifikasi dalam prosedur pelaksanaan pengujian, diantaranya adalah pengujian standar (direct) DAS ELISA dan indirect ELISA. Perbedaan kedua metode ini adalah pada tempat enzim terikat. Bila konjugasi enzim dilakukan pada imunoglobulin antivirus maka metode itu termasuk DAS ELISA, tetapi bila konjugasi enzim dilakukan pada imunoglobulin dari serum darah hewan maka metode tersebut diklasifikasikan sebagai Indirect ELISA. TAS ELISA (Modifikasi Indirect ELISA) Alat dan Bahan: Sampel tanaman - Kit antisera tersedia komersial (antisera, konjugate, kontrol positif, kontrol negatif), - Bahan-bahan buffer ELISA (Washing Buffer, ekstrak buffer, Coating buffer, Substrat Buffer) Non fat dried milk Plate ELISA ELISA reader ELISA washer Multichanel mikropipet dan mikrotip

Botol sprayer pNPP Pistil Plastik penggerus Timbangan analitik Refrigerator bersuhu Inkubator bersuhu 37C Instruksi Kerja: 1. Isi lubang mikroplate dengan 100 l antibodi virus target yang telah dilarutkan dalam coating buffer dengan perbandingan sesuai petunjuk kit antisera. Inkubasikan pada kotak lembab pada suhu 37 oC selama 2 jam atau pada suhu 4 C selama 1 malam. 2. Isi lubang mikroplate dengan sampel tanaman yang telah digerus menggunakan coating buffer dengan perbandingan 1 : 10 (berat/volume) sebanyak 100 l. Siapkan pula kontrol positif dan kontrol negatif. Inkubasikan pada kotak lembab pada suhu 37 oC selama 2 jam atau pada suhu 4 C selama 1 malam. 3. Kosongkan mikroplate kemudian cuci dengan PBST 4-8 kali. Kemudian keringkan mikroplate dengan cara dibalik dan ditepuk-tepukan pada permukaan yang telah dialasi kertas towel. 4. Isi mikroplate dengan larutan 5 % nonfat dried milk dalam PBST. Inkubasikan pada kotak lembab pada suhu 37 oC selama 1 jam. 5. Cuci mikroplate seperti pada tahap 2. 6. Larutkan antisera 1 dengan menggunakan conjugate buffer dengan perbandingan sesuai kit antisera. 7. Isi lubang mikroplate dengan larutan no.5 sebanyak 100 l. Inkubasikan pada kotak lembab pada suhu 37 oC selama 2 jam. 8. Cuci mikroplate seperti pada tahap 2. 9. Larutkan antisera 2 (conjugate universal) dengan menggunakan conjugate buffer dengan perbandingan sesuai kit antisera. 10. Isi lubang mikroplate dengan larutan no.8 sebanyak 100 l. Inkubasikan pada kotak lembab pada suhu 37 oC selama 1 jam. 11. Cuci mikroplate seperti pada tahap 2. 12. Siapkan larutan pNPP dalam substrat buffer kira- kira 15 menit sebelum waktu inkubasi berakhir dengan perbandingan 1 :1 (mg/ml). Jangan sentuh pNPP dengan tangan atau terpapar cahaya yang kuat. Isi mikroplate dengan 100 l larutan pNPP. Inkubasi mikroplate pada suhu ruang dalam kotak lembab selama 30 -60 menit. Untuk menghentikan reaksi tambahkan 50 l NaOH 3M. 13. Pengamatan secara visual terhadap perubahan warna yang terjadi pada larutan. Bila terjadi perubahan warna, ada indikasi bahwa sampel yang diuji positif 14. Pembacaan hasil juga dilakukan dengan menggunakan ELISA reader dengan panjang gelombang 405 nm. Hasil dikatakan positif apabila nilai sampel lebih dari 2 kali ratarata nilai kontrol negatif kit antisera. 4 Metode Diagnosis Secara Molekuler Identifikasi patogen penyebab penyakit dilakukan dalam rengka menentukan spesies virus penyebab penyakit yang terbawa oleh media pembawa. Pengelolaan sampel kerja (Media Pembawa) dalam identifikasi virus penyebab menggunakan metode molekuler akan memudahkan Petugas Karantina melakukan tindakan pengujian di laboratorium.

2.4.1 Polymerase chain reaction (PCR) Polymerase chain reaction (PCR) merupakan sebuah metode yang digunakan untuk memperbanyak suatu fragmen DNA yang spesifik secara invitro. Posisi fragmen DNA yang spesifik tersebut ditentukan oleh sepasang primer yang akan menjadi cetakan awal untuk proses perbanyakan fragmen DNA selanjutnya dengan bantuan enzim polimerase dan deoxyribonucleotide triposphate (dNTPs) yang dikondisikan pada suhu tertentu. Fragmen DNA, yang pada awalnya terdapat dalam konsentrasi yang sangat rendah akan diperbanyak menjadi cetakan fragmen DNA baru yang cukup untuk dapat divisualisasi pada gel agarosa . Secara prinsip, PCR merupakan proses yang diulang-ulang antara 2030 kali. Setiap siklus terdiri dari tiga tahap. Berikut adalah tiga tahap bekerjanya PCR dalam satu siklus: 1. Tahap peleburan (melting) atau denaturasi. Pada tahap ini (berlangsung pada suhu tinggi, 94 96C) ikatan hidrogen DNA terputus (denaturasi) dan DNA menjadi berberkas tunggal. Biasanya pada tahap awal PCR tahap ini dilakukan agak lama (sampai 5 menit) untuk memastikan semua berkas DNA terpisah. Pemisahan ini menyebabkan DNA tidak stabil dan siap menjadi templat ("patokan") bagi primer. Durasi tahap ini 12 menit. 2. Tahap penempelan atau annealing. Primer menempel pada bagian DNA templat yang komplementer urutan basanya. Ini dilakukan pada suhu antara 4560C. Penempelan ini bersifat spesifik. Suhu yang tidak tepat menyebabkan tidak terjadinya penempelan atau primer menempel di sembarang tempat. Durasi tahap ini 12 menit. 3. Tahap pemanjangan atau elongasi. Suhu untuk proses ini tergantung dari jenis DNApolimerase yang dipakai. Dengan Taq-polimerase, proses ini biasanyadilakukan pada suhu 76C. Durasi tahap ini biasanya 1 menit. Pada denaturasi awal (1) Dna akan dipisah menjadi untai tunggal. Kemudian primer melekat pada posisi target dari masing-masing untai DNA (2) pada saat annealing. Setelah itu taq polimerase melakukan ekstensi DNA dari ujung 3 primer pada tahap ekstensi. Lepas tahap 3, siklus diulang kembali mulai tahap 1. Tahap 4 pada gambar menunjukkan perkembangan yang terjadi pada siklus-siklus selanjutnya. Akibat denaturasi dan renaturasi, beberapa berkas baru (berwarna hijau) menjadi templat bagi primer lain. Akhirnya terdapat berkas DNA yang panjangnya dibatasi oleh primer yang dipakai dalam jumlah yang melimpah karena penambahan terjadi secara eksponensial.
http://sadatin091089.blogspot.com/2011/04/diagnosis-virus-patogen-tanaman-tugas.html

A. Latar belakang Serologi adalah ilmu yang mempelajari prosedur-prosedur diagnostik dan eksperimental yang berhubungan dengan imunologi dan menyangkut reaksi-reaksi serum.Tes-tes serologi ini digunakan untuk; Identifikasi mikroorganisme-mikroorganisme, dan menunjukan antibodi didalam serum dari hospes pada penyakit-penyakit tertentu dimana penyebab penyakit tidak dapat diisolasi, penemuan spesifik antibodi adalah penting sekali untuk membantu diagnosa. Salah satu teknik serologi yang bersifat lebih sensitif dibandingkan dua metode serologi yang diuraikan terlebih dahulu. Enzyme linked immunisorbent assay, disingkat ELISA telah banyak mengalami peubahan sejak pertama kali teknik ini dipublikasikan ciri utama teknik ini adalah dipakai indikator enzim untuk reaksi imunilogi. ELISA telah berkembang sampai pada tingkatan yang sangat sulit untuk membuat generasi tentang kemampuan kinerja berbagai konfigrasi.

Konfigurasi yang paling umum mengunakan substrat padat. ELISA singkatan dari enzim-linked Immunosorbent assay. Ini adalah tes immunochemical cepat yang melibatkan sebuah enzim (protein yang mengkatalisis suatu reaksi biokimia). Juga melibatkan antibodi atau antigen (kekebalan molekul). Tes ELISA digunakan untuk mendeteksi zat yang memiliki sifat antigenik, terutama protein (sebagai lawan dari molekul kecil dan ion seperti glukosa dan kalium. Beberapa di antaranya adalah hormon, bakteri antigen dan antibodi. B. Tujuan Memperkenalkan teknik serologi dengan meode ELISA. Melakukan pengamatan reaksi warna pada sumuran hasil teknik serologi, untuk mendeteksi virus penyebab patogen pada tanaman kacang panjang dan tembakau. BAHAN DAN METODE A. Alat dan Bahan Alat dan bahan yang diperlukan antara lain; plat mikrotiter, pipet mikrotiter, antiserum, NAOH (3N), NAN3 (0.02%) ditambahkan pada setiap buffer bila perlu pengawetan, p-nitrophenyl phosphate, substrate untul alkalin fostatase, enzim konjugat, bahan-bahan pembuat bufer, ELISA reader B. Metode Adapun metode yang dilakukan dalam teknik ELISA ini antara lain, pertama-tama menyiapkan bufer ekstraksi (milk extrack buffer), yaitu dengan mencampurkan 1.25 g Tween-20 dan 1 g susu kering nonfat kadalam 250 ml PBST pH 7.4 (8.2 gNaCl, 2.9 g Na2HPO4, 12H2O, 0,2 g KH2PO4, 0,2 g KCl dalam 1000 ml H20 dan 5% Tween20). Setelah itu daun tanaman digerus dalam bufer ekstraksi tersebut (1/10 b/v), dan kemudian disaring dengan kain kasa. Cairan perasan tanaman yang dihasilkan diambil sebanyak 100 ul kemudian dimasukkan kedalam sumuran plat mikrometer. Plat mikrometer ditutup dengan kertas basah/lembab dan disimpan dalam kotak plastik yang telah diberi alas kertas basah selama semalam pada suhu 4C atau selama 2 jam pada suhu kamar. Selanjutnya plat mikrotiter dicuci 4-8 kali dengan PBST. Enzim konjugat yang sudah diencerkan dimasukkan ke dalam sumuran plat mikrotiter sebanyak 100 ul, kemudian diinkubasi pada suhu kamar selama 2 jam. Plat mikrotiter dicuci lagi sebanyak 4-8 kali dengan PBST. Sebanyak 100 ul bufer PNP (0,1 g Magnesium chlorida, 0,2 g Sodium azidae, 97 ml Diethanolamina) dimasukkan kedalam sumuran plat mikrotiter dan diinkubasi selama 30-60 menit. Setelah waktu inkubasi tersebut akan terjadi perubahan warna pada cairan di dalam sumuran plat mikrotiter, yaitu warna kuning, yang menandakan reaksi positif. Reaksi segera dihentikan dengan penambahan sodium hidroksida (3M), selanjutnya dilakukan pencatatan hasil dan analisis kuantitatif dengan spektrofotometer 405 nm. HASIL DAN PEMBAHASAN A. PEMBAHASAN Perkembangan lain dari teknik ELISA yaitu ditemukannya teknik micro-ELISA asai. Prosedur micro-ELISA dapat mengatasi permasalahan keterbatasan sample yang sering ditemukan dalam analisa kuantitatif di laboratorium (Wiese et al., 2001) Perkembangan teknik ELISA sangat bermanfaat dalam ilmu kedokteran secara umum. Selain dapat mengidentifikasi penyakitpenyakit dan sistem imun, teknik ELISA juga dapat menganalisa penyakit karena gangguan

fungsi hormonal tubuh. Teknik ELISA juga dapat digunakan untuk mengidentifikasi virus penyebab pathogen tumbuhan Kelemahan yang ada pada prosedur asai dengan menggunakan ELISA yaitu lamanya waktu inkubasi dapat dipecahkan dengan teknik ini. Teknik ini dalaporkanlebih sensitive, akurat, cepat, dan lebih ramah lingkungan. Time-resolved immunofluorometric assay sebenarnya hasil perkembangan dari teknik ELISA. Teknik ini menggunkan pewarnaan fluorescents yang telah sukses untuk menganalisis hormon insulin (Lovendahl and Purup, 2002). Perkembangan lain dari teknik ELISA yaitu ditemukannya teknik micro-ELISA asai. Prosedur micro-ELISA dapat mengatasi permasalahan keterbatasan sample yang sering ditemukan dalam analisa kuantitatif di laboratorium (Wiese et al., 2001). Teknik ini menggunakan microarray platform yang dikembangkan berdasarkan metode sandwich ELISA. Enzim-linked immunosorbant assay, juga disebut ELISA, adalah sebuah biokimia teknik yang digunakan terutama di imunologi untuk mendeteksi keberadaan antibodi atau antigen dalam sampel.. Tes ELISA telah digunakan sebagai diagnostik alat dalam bidang kedokteran dan patologi tanaman, serta pengawasan mutu pemeriksaan di berbagai industri. Dalam istilah yang sederhana, dalam jumlah yang tidak diketahui ELISA antigen yang ditempel ke permukaan, dan kemudian dicuci antibodi spesifik di atas permukaan sehingga dapat mengikat antigen. Antibodi ini dihubungkan dengan enzim, dan di langkah terakhir ditambahkan suatu zat enzim yang dapat appropriate mengkonversi ke beberapa sinyal terdeteksi. Jadi dalam kasus fluoresensi ELISA, ketika cahaya dari panjang gelombang yang tepat adalah menyinari sampel, setiap antigen / antibodi kompleks akan fluoresce sehingga jumlah antigen dalam sampel dapat disimpulkan melalui besarnya fluoresensi. ELISA merupakan metode uji serologi yang umum digunakan untuk menentukan pengujian terhadap patologi tanaman. Cairan perasan tanaman tembakau dan kacang panjang yang sakit terinfeksi virus merupakan bahan utama yang digunakan untuk mendeteksi virus. Metode ini menggunakan susu kering nonfat, Tween 20 dan PBST sebagai buffer ekstraksi. Sementara keperluan deteksi virus dianbil dari ekstak tanaman tembakau dan kacang panjang yang sakit yang dimasukkan kedalam sumuran plat mikrotiter yang telah diberi enzim konjugat. Setelah waktu inkubasi akan terjadi perubahan warna pada cairan di dalam sumuran plat mikrotiter, yaitu warna kuning yang menandakan reaksi positif Hasil uji serologis pada tanaman tembakau dan kacang panjang yang sakit Keterangan : A1 dan A2 = buffer, berwarna bening menunjukkan reaksi negatif B1 dan B2 = kontrol negatif (tembakau sehat), berwarna bening C1 dan C2 = virus TMV murni, kontrol positif berwarana kuning (++++) D1 dan D2 = G glubosa, berwarna bening menunjukkan reaksi negatif. E1 dan E2 = tembakau sakit, berwrna kuning pudar (+) menunjukkan reaksi positif F1 dan F2 = kacang panjang 1 (mozaik sakit) berwarna bening G1 dan G2 = kacang panjang 2 (mozaik sakit) berwarna bening H1 dan H2 = Cenopodium amaranti color (klorosis), berwarna kuning (+++) ELISA sebagai salah satu metode uji serologis mempunyai satu kelebihan yaitu mampu mendeteksi beberapa jenis antibodi dari 1 sampel serum (tergantung dari kit ELISA yang digunakan). ELISA juga memiliki tingkat spesifikasi (yaitu kemampuan mendeteksi tanaman

yang tidak terinfeksi atau tanaman yang tidak terinfeksi dinyatakan negatif) yang tinggi. Peralatan yang digunakan dalam uji serologis melalui ELISA Microreader plate mirotiter Pipet multi channel Micro Aerosol Filter Pipet Tips Pipet mikro tube mikro Elisa plte reader Spectophotometer KESIMPULAN Teknik ELISA merupakan salah satu metode serologi yang lebih intensif. Teknik ini digunakan untuk berbagi keperluan, salah satunya adalah untuk mendeteksi virus yang menginfeksi tanaman tembakau dan kacang panjang dan mendeteksi berbagai macam antibodi yang terkandung dalam sampel serta mengetahui reaksi warna pada sample. DAFTAR PUSTAKA Bos, L. 1990. Pengantar Virologi Tumbuhan. Yogyakarta: Gadjah Mada University Press http://www.google.co.id/#hl=id&source=hp&q=ELISA&btnG=Telusuri+d diakses tanggal 13 Desember 2009 http://www.clinchem.org/cgi/content/full/51/12/2415 diakses tanggal 13 Desenber 2009 http://info.medion.co.id diakses tanggal 13 Desember 2009
http://leli.tianr08.student.ipb.ac.id/2010/06/20/laporan-teknik-elisa/

Diagnosa dan Deteksi Penyakit Tungro Pada Tanaman Padi

Diagnosis Penyakit Tungro Tanaman padi yang terinfeksi dua jenis virus tungro akan menunjukkan gejala yang komplek. Apabila hanya terinfeksi oleh RTBV maka gejala yang ditimbulkan lebih ringan, sedangkan apabila hanya terinfeksi oleh RTSV maka tanaman tidak menunjukkan gejala. Secara visual, gejala penyakit tungro sering dikacaukan dengan penyakit yang disebabkan oleh virus yang lain atau akibat kekurangan unsur hara. Diagnosis yang benar akan menentukan ketepatan rekomendasi pengendalian dan bermanfaat dalam kegiatan survei penyakit tungro. Terdapat beberapa metode diagnosis penyakit tungro, baik secara konvensional maupun modern. Metode diagnosis secara konvensional seperti teknik biologi sudah jarang dilakukan karena selain kurang akurat juga memerlukan waktu yang relatif lama. Metode diagnosis yang berkembang saat ini adalah teknik serologi dan hibridisasi asam nukleat. Metode diagnosis secara molekuler berdasarkan hibridisasi asam nukleat menggunakan PCR membuktikan bahwa bahan genetik yang diekspresi dan produk ekspresi gen dapat diisolasi. PCR merupakan salah satu teknik diagnosis secara molekuler dengan prinsip penggandaan DNA secara in vitro. Proses PCR berjalan berdasarkan cara replikasiDNA dengan bantuan enzim DNA polimerase dan perubahan sifat fisik DNA terhadap suhu yang terjadi secara simultan dari primer yang komplementer dengan DNA target. Diagnosis secara molekuler mempunyai spesifisitas tinggi terhadap patogen (genus, spesies, strain, patogen baru), akurat, efektif, dan efisien.

Penggunaan teknik PCR dengan spesifik primer untuk virus tungro akan mempercepat proses diagnosis penyakit tungro dan menghasilkan data yang akurat. Deteksi Virus Tungro Ketersediaan sumber inokulum merupakan faktor penyebab terjadinya serangan tungro. Eradikasi sumber inokulum pada tahap pascapanen sampai pratanam diperlukan untuk menekan sumber inkulum primer sekecil mungkin dan menghindari infeksi awal virus tungro. Selain berkembang pada ratun tanaman padi yang sebelumnya tertular tungro, virus tungro juga dapat berkembang pada beberapa gulma. Eradikasi gulma di areal pertanaman dan sekitarnya akan mengeliminasi perkembangan virus tungro dan menghilangkan tempat bertahan hidup vektor setelah tidak tersedia pertanaman padi. Tingkat infeksi awal penyakit tungro ditentukan oleh populasi wereng hijau infektif yang migrasi ke pertanaman, sedangkan perkembangan selanjutnya ditentukan oleh tingkat infeksi awal dan kepadatan wereng hijau generasi pertama. Umumnya, gejala tungro belum muncul pada tahap persemaian, namun mulai terlihat pada 21-30 hari setelah tanam. Oleh karena itu, deteksi dini virus tungro pada ratun tanaman padi, gulma di sekitar lahan, persemaian, dan wereng hijau yang ada di wilayah tersebut harus dilakukan sebagai usaha antisispasi perkembangan virus tungro di pertanaman. Deteksi virus tungro pada persemaian dan wereng hijau menggunakan teknik PCR dengan primer spesifik untuk virus tungro, terutama RTBV,menunjukkan sensitivitas yang lebih tinggi dibandingkan dengan deteksi menggunakan teknik enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
http://www.agrilands.net/read/full/agriwacana/2011/01/09/diagnosa-dan-deteksi-penyakit-tungropada-tanaman-padi.html

Diagnosis Virus Tanaman

METODE IDENTIFIKASI/DIAGNOSIS VIRUS TANAMAN Diagnosis OPTK golongan virus merupakan langkah penting untuk menentukan virus penyebab penyakit yang terbawa media pembawa. Diagnosis menggambarkan tentang rangkaian kegiatan deteksi dan identifikasi patogen penyebab penyakit, sehingga dapat ditentukan spesies virus penyebab penyakit yang terbawa oleh media pembawa tersebut. Alur pekerjaan diagnosis dari awal hingga mendapatkan patogen penyebab. akan memudahkan kita untuk melakukan tindakan pengujian di laboratorium
http://diagnosisvirustanaman.blogspot.com/2011/04/diagnosis-virus-tanaman.html

Alur Kerja Penanganan Pengujian Media Pembawa

I.

METODE DIAGNOSIS SECARA BIOLOGI

1. Pemeriksaan gejala penyakit pada tanaman atau bagian tanaman Pemeriksaan berdasarkan gejala penyakit pada tanaman atau bagian tanaman (termasuk benih) dapat membantu diagnosis awal penyebab penyakit tanaman oleh virus. Tanaman atau bagian tanaman dengan gejala spesifik dapat di deteksi berdasarkan metode ini. Pemeriksaan dapat dilakukan terhadap keberadaan badan inklusi partikel virus, terjadinya nekrosis pada jaringan floem, atau deposisi enzim kalose (Hunter D. 2001). Alat dan Bahan: Kaca pembesar/ loup/ Mikroskop cahaya Kamera untuk dokumentasi Alat pemotong (pisau/ gunting/ silet), Bahan pewarna : trypan blue, phloroguicinol, Gelas obyek dan gelas penutup. Cara Kerja untuk Pengamatan Badan Inklusi : Tanaman atau bagian tanaman yang akan diperiksa dilihat dengan menggunakan kaca pembesar, agar gejala penyakit yang ada pada tanaman atau bagian tanaman dapat terlihat dengan lebih jelas, Lakukan pemotongan jaringan tanaman menggunakan pisau/ silet steril dan letakkan di atas gelas obyek, Tetesi jaringan dengan trypan blue, tutup dengan kaca penutup, Amati badan inklusi virus akan tampak berwarna biru tua menggunakan mikroskop cahaya . Dokumentasikan tanaman atau bagian tanaman yang menunjukkan gejala infeksi virus tanaman, sehingga dapat dijadikan bukti ilmiah untuk dilakukan identifikasi lebih lanjut menggunakan metode yang lebih valid. Catatan : Badan inklusi yang berada pada jaringan terinfeksi virus kadang-kadang dapat digunakan sebagai pengenalan awal virus ke dalam suatu grup. Beberapa virus dapat diamati badan inklusinya (Gambar 4), antara lain Bean Yellow Mosaic Virus, Turnip Mosaic Virus,

Cauliflower Mosaic Virus, Dahlia Mosaic Virus, Red Clover Vein Mosaic virus, Tobacco Etch Virus, Tobacco Mosaic Virus, dan Watermelon Mosaic Virus (Hunter D. 2001) Instruksi Kerja untuk Pengamatan Nekrosis pada Jaringan Floem : Irislah bagian jaringan floem pada batang terinfeksi virus menggunakan pisau/ silet steril lalu letakkan pada gelas obyek, Warnai jaringan dengan Phloroglucinol, Amati dibawah mikroskop. Jaringan nekrosis akan tampak berwarna lebih gelap dibanding jaringan yang tidak mengalami nekrosis. Catatan : Infeksi tanaman kentang oleh Potato Leaf Roll Virus akan menginduksi terjadinya nekrosis pada jaringan floem pada umbi dan batang kentang. Nekrosis yang terjadi dapat diamati di bawah mikroskop setelah dilakukan pewarnaan dengan phlorogucinol (Hunter D. 2001). Instruksi Kerja untuk Uji Igel Lange (pengamatan deposisi kalose ) : Irislah bagian jaringan umbi atau floem pada batang, yang terinfeksi virus menggunakan pisau/ silet steril lalu letakkan pada gelas obyek, Warnai jaringan dengan resorcin blue, Amati dibawah mikroskop. Kalose yang terdeposit pada jaringan floem akan mengalami perubahan menjadi biru, Catatan : Metode uji ini umum digunakan untuk deteksi Potato Leaf Roll Virus pada batang atau umbi kentang (Hunter D. 2001). 2. Penggunaan tanaman indikator Ada beberapa jenis tanaman yang sangat rentan terhadap virus tertentu dan menunjukkan gejala yang khas sehingga dapat dimanfaatkan sebagai metode untuk mendeteksi dan mengidentifikasi virus tertentu (Walkey 1991). Untuk dapat menerapkan metode deteksi ini, terlebih dahulu harus diketahui sifat dari virus yang akan diuji, diantaranya cara penularan dan jenis gejala yang ditimbulkan pada tanaman yang dijadikan tanaman indikator Alat dan Bahan: Tanaman indikator dipilih berdasarkan Virus yang akan diuji Mortar dan pistil

Buffer Fosfat pH 7 mengandung 1% B-mercapthoethanol (yang ditambahkan sesaat sebelum digunakan)

Aquadest Alat pemotong (pisau atau gunting) steril Kain kasa Sentrifuge Tabung sentrifuge Sarung tangan karet Karborundum 600 mesh Cara Kerja:

Buat sap dari tanaman atau bagian tanaman yang terinfeksi virus dengan cara menggerus jaringan terinfeksi dengan 0.01 M buffer fosfat dingin pH 7 dengan perbandingan 1:10 b/v (berat/volume). Lakukan persiapan sap dalam kondisi dingin ,

Saring sap tanaman dengan menggunakan kain kasa, bila diperlukan, Karborundum ditaburkan pada bagian tanaman indikator yang akan diinokulasi, Oleskan sap menggunakan jari tangan bersarung karet pada bagian tanaman indicator yang telah ditaburi dengan karborundum,

Setelah inokulasi, bagian tanaman yang diinokulasi dibilas dengan menggunakan aquadest, Simpan/ inkubasi tanaman di Rumah Kaca/Growth Chamber. Selama masa inkubasi, kelembaban lingkungan tanaman dijaga, agar mendukung perkembangan infeksi virus yang diinokulasikan.

Gejala akan tampak setelah 3 7 hari setelah inokulasi. (Berg (1962), Hollings (1957), Yarwood (1953) dalam Noordam 1973) Catatan : Lakukan inokulasi ke tanaman indikator pada pagi atau sore hari.

II.

METODE DIAGNOSIS SECARA SEROLOGI

Prinsip kerja serologi didasarkan pada reaksi spesifik antara antigen dan antibody (antiserum) sehingga terbentuk reaksi conjugate antibody-enzyme (Hunter D. 2001).

Beberapa posisi pengikatan antibodi pada sumuran ELISA 1. Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Metode pengujian ini mulai berkembang sejak tahun 1971. ELISA merupakan suatu metode pengujian serologi yang melekatkan kompleks ikatan antara antibodi dengan antigen di dalam sumuran plate ELISA yang terbuat dari bahan plastik (Dijkstra et al. 1998). Jika terjadi reaksi kompatibel antara antibodi dengan antigen akan ditunjukkan dengan adanya perubahan warna yang terjadi. Keunggulan metode ini (Dijkstra et al. 1998): 1. Dapat mendeteksi virus padakonsentrasi rendah (1-10 ng/ml) 2. Penggunaan antibodi dalam jumlah sedikit
http://diagnosisvirustanaman.blogspot.com/2011/04/diagnosis-virus-tanaman.html