MEDIA
Media adalah suatu substrat yang digunakan untuk menumbuhkan dan
mengembangbiakkan mikroorganisme.
Syarat-syarat Media
1. Mengandung komposisi :
Air
Zat hara (sumber karbon, nitrogen, sulfur, fosfor, oksigen, hidrogen &
trace elements)
2. Memiliki pH, temperatur dan tekanan osmotik yang sesuai dengan kebutuhan
mikroorganisme.
3. Steril, agar tidak ditumbuhi oleh mikroorganisme pencemar.
HANDBOOK OF TA HAYATI
Trace elements dibutuhkan dalam jumlah yang sangat kecil yang sukar
ditentukan. Jumlah yang dibutuhkan adalah <0.1%.
Growth factors (faktor pertumbuhan) adalah molekul organik yang
dibutuhkan
dalam
pertumbuhan
dan
tidak
bisa
disintesis
oleh
Pengaruh
pH,
temperatur
dan
tekanan
osmotik
terhadap
pertumbuhan mikroorganisme
Pada saat terjadi metabolisme protein dan asam amino melepaskan ion
ammonium basa
Jenis media
Berdasarkan konsistensi :
Media padat (agar/gelatin)
Dibuat dengan cara menambahkan agen pemadat, misalnya agar, gelatin
atau silica gel ke dalam media cair.
HANDBOOK OF TA HAYATI
mikroorganisme.
Sebaliknya,
gelatin,
diuraikan
oleh
memberikan
kesempatan
terhadap
suatu
jenis/kelompok
HANDBOOK OF TA HAYATI
Media Selektif
Media yang hanya menumbuhkan mikroorganisme yang diinginkan saja
yang dapat tumbuh karena tidak adanya nutrien penting bagi
mikroorganisme yang tidak diinginkan untuk tumbuh dan kehadiran
substansi inhibitor seperti NaCL, asam, kristal violet (toksik), antibiotika
(misal : streptomisin) dsb.
Media Diferensial
Media yang mengandung substansi yang dapat menyebabkan munculnya
karakteristik dari masing-masing mikroorganisme yang ditumbuhkan.
Contoh media selektif dan diferensial : Levine EMB agar untuk analisis koliform
dalam air.
Contoh Media
HANDBOOK OF TA HAYATI
Pembuatan Media
Bila tabung/cawan petri yang digunakan untuk pembuatan media sudah dalam
keadaan bersih dan bebas kontaminasi, maka tidak perlu dilakukan pencucian.
Pencucian dilakukan dengan menggunakan air hangat dan deterjen, bagian
dalamnya disikat. Cuci sebanyak dua kali, pada pencucian kedua, gunakan
aquadest untuk membersihkan sisa-sisa deterjen yang masih tertinggal.
Tempatkan tabung/cawan petri tersebut pada keranjang/rak untuk pengeringan.
Jangan dikeringkan dengan menggunakan handuk.
Sterilisasi.
0,2 g
Kalium fosfat
0,1 g
Ammonium klorida
0,05 g
Magnesium sulfat
0,02 g
Feri klorida
0,0005 g
Aquadest
100 ml
Siapkan 100 ml kaldu glukosa garam mineral dengan kandungan seperti pada
tabel
HANDBOOK OF TA HAYATI
1,0 g
NaCl
1,6 g
Ekstrak daging
0,6 g
Aquadest
200 ml
HANDBOOK OF TA HAYATI
Tutup tabung
Beri label
Tempatkan ke rak
Sterilisasi
PERHATIKAN :
Pemanasan larutan dengan menggunakan api bunsen atau electric hot plate.
HANDBOOK OF TA HAYATI
BAB II
STERILISASI
Pengertian
Suatu proses (dengan metode tertentu) yang memberikan hasil akhir suatu keadaan
dimana tidak dapat ditunjukkan lagi adanya mikroorganisme hidup.
Dekontaminasi
Jumlah kontaminan tinggi hasil akhir meragukan atau akan membutuhkan
waktu proses lebih lama.
Proses dekontaminasi meliputi :
- pembilasan
- penyikatan
- pencucian (dengan desinfektan), baik dengan manual/alat
HANDBOOK OF TA HAYATI
HANDBOOK OF TA HAYATI
10
Bejana autoclave
HANDBOOK OF TA HAYATI
11
60-150
1600C
45-120
1700C
20-60
1800C
20-30
Kelebihan :
Hasil kering.
Dapat digunakan untuk semua bahan termostabil, seperti alat-alat gelas.
Mudah dilaksanakan.
Kekurangan :
Waktu yang dihabiskan cukup lama.
Penetrasi panas terbatas pada lapisan tertentu.
Oven
HANDBOOK OF TA HAYATI
12
3. Sterilisasi Gas
Sebagai alternatif dari sterilisasi termal dilakukan bila bahan yang
disterilkan tidak tahan terhadap suhu tinggi seperti pada proses sterilisasi
uap atau panas kering.
Daya penetrasi dan absorpsi tinggi sehingga sterilisasi dapat dilakukan pada
pembungkus akhir.
Sterilisasi dengan menggunakan gas kimia :
Etilen oksida (EtO2)
Sifat : mudah meledak dan iritatif.
Dalam perdagangan dicampur dengan gas CO2 atau freon dalam kadar 1090%.
Mekanisme kerja : melalui alkilasi gugus biologis esensial dari
mikroorganisme.
Meninggalkan residu toksik.
Mutagenik.
Afinitas tinggi sehingga perlu diangin-anginkan sebelum digunakan, tujuan
untuk menghilangkan EtO2 yaitu selama 8-30 jam pada 450C atau 4-10
hari pada temperatur kamar.
Formaldehida
Mekanisme kerja :
Melalui ikatan dengan gugus imino dan amino dari protein
mikroorganisme.
Keunggulan dibanding etilen oksid :
Lebih murah
Kurang meninggalkan residu
Tidak mudah meledak
Kurang toksik
HANDBOOK OF TA HAYATI
13
HANDBOOK OF TA HAYATI
14
INDIKATOR STERILISASI
Indikator Fisik/Mekanik
Indikator Kimia
Indikator Biologis
INDIKATOR FISIK/MEKANIK
Bagian dari mesin sterilisasi.
Biasanya menunjukkan bahwa alat berfungsi baik.
Contoh : Pada alat high prevacum autoclave yang menunjukkan hub. T dan P
konstan proses sterilisasi sempurna.
INDIKATOR KIMIA
Yaitu indikator dari bahan kimia yang pada temperatur tertentu ( 121OC) akan
berubah warna.
Contoh : autoclave tape, wipack med.
HANDBOOK OF TA HAYATI
15
INDIKATOR BIOLOGIS
Menggunakan bakteri thermophilus dan kertas pH/pH meter.
Kontrol Kualitas
Selain dengan penggunaan indikator, kontrol kualitas sterilisasi juga dapat dilakukan
dengan kalibrasi alat secara periodik dan ditetapkan standar deviasinya.
HANDBOOK OF TA HAYATI
16
BAB III
INOKULASI MIKROORGANISME
INOKULASI=KULTUR=BIAK=TUMBUH
Inokulasi adalah penempatan sesuatu dengan tujuan penumbuhan atau
reproduksi.
Inokulasi mikroorganisme penempatan mikroorganisme dari suatu suspensi
ke media steril agar dapat tumbuh dan berkembangbiak.
Media steril yang dimaksud disini media padat dan cair dalam petri/tabung.
Ketika kita akan mengamati dan mempelajari flora bakteri pada tubuh, tanah,
air, makanan dan lingkungan sekitar kita lainnya, kita akan menemukan
populasi mikroorganisme campuran. Mikroorganisme jarang ditemukan dalam
satu spesies.
Hal yang penting dilakukan agar dapat mempelajari karakteristik kultur,
morfologi dan fisiologi satu spesies mikroorganisme adalah pemisahan
mikroorganisme tersebut dari spesies lainnya. Dengan kata lain, kita harus
membuat suatu biakan murni dari mikroorganisme tersebut.
Pure culture = biakan murni.
BIAKAN MURNI
Bagaimana memperoleh suatu biakan murni teknik aseptik.
Tidak tercemar dari luar biasanya dari udara.
Media yang digunakan harus steril.
Untuk memperoleh biakan murni dapat dilakukan pengenceran dengan
menggunakan bahan cair atau bahan padat.
HANDBOOK OF TA HAYATI
17
TEKNIK ASEPTIK
Teknik aseptik mengacu pada praktek yang dilakukan oleh para ahli
mikrobiologi untuk mematikan seluruh mikroorganisme yang dapat
mencemari media, sel/jaringan hidup dan suatu proses pemindahan
mikroorganisme pada biakan.
Transfer
atau
pemindahan
meliputi
pemindahan
suatu
HANDBOOK OF TA HAYATI
18
Prosedur Umum
Desinfeksi area kerja.
o Area kerja harus didesinfeksi terlebih dahulu untuk mengurangi
kontaminan yang dapat mencemari proses aseptik.
Ose dan jarum harus steril.
o Cara sterilisasi adalah dengan cara fiksasi dengan panas/pemijaran
menggunakan lampu bunsen.
o Pemanasan dapat mematikan mikoorganisme pencemar.
Pemijaran/pemanasan pada tabung.
o Pada mulut tabung terkandung mikroorganisme yang dapat mencemari
biakan. Oleh karena itu, lakukan pemijaran/pemanasan pada mulut
tabung menggunakan lampu bunsen.
Desinfeksi akhir.
o Setelah melakukan suatu proses aseptik, lakukan desinfeksi akhir untuk
mematikan mikroorganisme yang kemungkinan tertinggal.
Teknik Biakan Murni
Teknik Penggoresan Agar (Streak plate method)
Teknik Agar Tuang (Pour plate method)
Teknik Agar Sebar
Teknik Tusukan gelatin
Media Biakan
Media biakan yang digunakan pada inokulasi :
Media pembiakan dasar
Media pembiakan penyubur
Media pembiakan selektif
HANDBOOK OF TA HAYATI
19
HANDBOOK OF TA HAYATI
20
HANDBOOK OF TA HAYATI
21
HANDBOOK OF TA HAYATI
22
HANDBOOK OF TA HAYATI
23
HANDBOOK OF TA HAYATI
24
HANDBOOK OF TA HAYATI
25
Gambar contoh koloni baik pada media cair (broth), agar, maupun gelatin
HANDBOOK OF TA HAYATI
26
TEKNIK SUBKULTUR
Langkah selanjutnya setelah mendapatkan biakan murni adalah
memindahkan mikroorganisme dari cawan petri ke tabing berisi nutrient
broth atau nutrient agar (subkultur). Hasil dari subkultur kemudian
diinkubasi selama 24 jam. Pewarnaan mikroorganisme dilakukan untuk
memeriksa apakah sudah terbentuk biakan yang benar-benar murni atau
belum.
Ketika memindahkan mikroorganisme dari suatu cawan petri yang
mengandung media, sebaiknya menggunakan jarum yang ditusukkan.
Jarum ditusukkan pada bagian tengah koloni untuk mendapatkan koloni
yang benar-benar mengandung satu macam mikroorganisme saja.
HANDBOOK OF TA HAYATI
27
BAB IV
PEWARNAAN BAKTERI
BAKTERI
Hanya dapat dilihat dengan mikroskop mikroskopi.
Satuan untuk ukuran bakteri mikron.
Bakteri rata-rata berukuran lebar 0,5-1 mikron dan panjang hingga 10 mikron.
1 mikron = 10-3 mm.
BENTUK BAKTERI
Bulat/bola :
Monococcus
e.g. Neisseria gonorrhoeae (penyebab kencing nanah).
Diplococcus
e.g. Diplococcus pneumoniae (penyebab penyakit pneumonia).
Sarkina.
Streptococcus.
Staphylococcus.
Batang (Basil)
Basil tunggal
e.g. Salmonella typhi (penyebab penyakit tifus).
Diplobasil
Streptobasil
e.g. Bacillus anthracis (penyebab penyakit antraks).
HANDBOOK OF TA HAYATI
28
Melilit
Spiral; sel tubuh umumnya kaku.
e.g. Spirillum.
Vibrio; seperti koma.
e.g. Vibrio cholerae (penyebab penyakit kolera).
Spirochaeta; dapat memanjang dan memendek karena sifatnya yang sangat lentur.
PEWARNAAN BAKTERI
Tubuh bakteri tidak mengadsorpsi dan membiaskan cahaya sehingga sukar diamati walau sudah
menggunakan mikroskop.
Untuk melihat bakteri dengan jelas tubuhnya diisi dengan zat warna PEWARNAAN
BAKTERI.
Zat warna mengadsorpsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras tubuh bakteri dengan
sekelilingnya ditingkatkan
o Sudah dilakukan sejak pertengahan abad ke-19, oleh Louis Pasteur dan Robert Koch.
o Ada 2 macam zat warna yang sering dipakai:
Muatan negatif banyak ditemukan pada dinding sel, membran sel, dan sitoplasma muatan
positif pada zat warna alkali akan berikatan dengan muatan negatif dalam sel bakteri
akan lebih jelas terlihat.
Zat warna asam digunakan untuk mewarnai bagian sel yang bermuatan positif.
Pewarnaan Positif :
Yang diwarnai adalah bakteri.
Bisa menggunakan zat warna asam dan alkali
Pewarnaan Negatif
Beberapa bakteri sukar diwarnai dengan zat warna alkali lakukan pewarnaan negatif.
Latar belakang di sekeliling bakteri diwarnai untuk meningkatkan kontras dengan bakteri yang tidak
berwarna.
HANDBOOK OF TA HAYATI
29
Cara bakteri dicampur dengan nigrosin gesekkan di object glass zat warna akan mewarnai
lingkungan sekitar bakteri, bukan bakteri dengan mikroskop, bakteri akan terlihat tidak
berwarna dengan latar belakang hitam.
Pada metode ini preparat tidak dipanaskan, tetapi dikeringkan di udara.
Ciri pewarnaan negatif :
Menggunakan zat warna asam (bermuatan negatif).
Penggunaan zat warna asam menyebabkan zat warna tidak akan mewarnai permukaan sel yang
mempunyai muatan negatif.
Pewarnaan ini bukan merupakan pewarnaan sel bakteri karena sel bakteri tetap tidak berwarna
setelah penambahan zat warna.
Larutan zat warna yang digunakan larutan encer (<1%).
Larutan encer yang dibiarkan berkontak agak lama dengan bakteri bekerja lebih baik dari larutan
pekat dengan waktu yang singkat.
Setelah dilakukan pewarnaan, dalam tubuh bakteri akan terjadi proses pertukaran ion-ion zat
warna dengan ion-ion yang terdapat pada bagian tubuh/sel bakteri.
MORDANT Zat yang dapat bergabung dengan komponen zat warna tertentu, sehingga terbentuk
senyawa yang tidak dapat larut dan melekat pada tubuh bakteri.
Contoh : ammonium oksalat, fenol, asam tanat, garam aluminium, besi, timah, seng,
tembaga, krom dll.
Cara penggunaan :
o Sebelum penambahan zat warna
o Dimasukkan ke dalam campuran zat warna
o Diberikan antara pemakaian dua larutan zat warna
CARA PEWARNAAN
Pewarnaan Sederhana
Mudah dan cepat
Untuk membedakan bakteri dari benda-benda mati lain yang bukan bakteri dan
untuk melihat bentuk, ukuran dan penataan bakteri.
Zat warna hanya terdiri satu macam yang dilarutkan dalam suatu pelarut.
HANDBOOK OF TA HAYATI
30
Misal : kristal violet, methylen blue, safranin (zat warna alkali), nigrosin, merah
kongo (zat warna asam).
Pewarnaan Khusus
Untuk melihat salah satu struktur sel.
Pewarnaan Kapsel
Pewarnaan Spora
Pewarnaan Flagela
Pewarnaan Badan Inklusi
Pewarnaan Diferensial
Digunakan lebih dari satu zat warna.
Adakalanya menggunakan pelarut yang sama (satu larutan mengandung dua atau
lebih zat warna).
Adakalanya menggunakan pelarut yang berbeda.
Contoh : pewarnaan Gram, pewarnaan Tahan Asam (Ziehl-Neelsen).
HANDBOOK OF TA HAYATI
31
PEWARNAAN KHUSUS
Pewarnaan Kapsel
Kapsel lapisan yang melekat di luar dinding sel yang terdiri dari polisakarida atau
polipeptida.
Fungsi kapsel melindungi bakteri terhadap sel fagosit.
Bacillus anthracis, Streptococcus pneumoniae, S.mutans.
Lapisan kapsel tebal, sukar diwarnai Jadi digunakan pewarnaan negatif.
Pada pewarnaan negatif latar belakang diwarnai zat warna asam, sedangkan
bakteri diwarnai dengan zat warna alkali. Kapsel tidak menyerap warna sehingga
terlihat sebagai lapisan tembus-terang dengan latar belakang yang berwarna.
Pewarnaan Spora
Spora pada bakteri struktur tahan panas dan bahan kimia.
Spora dibentuk oleh bakteri pada saat keadaan/ lingkungan tidak menguntungkan.
Bacillus, Clostridium.
Lapisan luar spora penahan yang baik terhadap bahan kimia, sehingga spora sukar
diwarnai.
Spora bakteri diwarnai dengan cara dipanaskan.
Pemanasan menyebabkan lapisan luar spora mengembang, sehingga zat warna dapat
masuk.
Pewarnaan Flagela
Flagela tipis dan panjang sukar dilihat di bawah mikroskop cahaya.
Flagela pada bakteri sebagai alat gerak.
Pewarnaan menggunakan mordant untuk membengkakkan flagela.
Pewarnaan Badan Inklusi
Beberapa bakteri mensintesis badan inklusi atau granula yang disimpan dalam
sitoplasma.
HANDBOOK OF TA HAYATI
32
Granula cadangan bahan makanan dan merupakan sumber karbon dan energi
yang siap pakai.
Dalam sel bakteri badan inklusi berupa granula metakromatik, asam poli-betahidroksibutirat, pati dan glikogen.
PEWARNAAN DIFERENSIAL
Pewarnaan Gram
Dilakukan pertama kali oleh Christian Gram.
Paling banyak digunakan di laboratorium.
Untuk memisahkan bakteri menjadi kelompok Gram-positif dan Gram-negatif.
Bakteri Gram-positif berwarna ungu disebabkan kompleks zat warna kristal violetiodium tetap bertahan walaupun sudah diberi larutan pemucat.
Bakteri Gram-negatif berwarna merah karena kompleks tersebut larut sewaktu
pemberian larutan pemucat dan menjadi warna merah.
Memberikan hasil baik bila digunakan biakan segar berusia 24-48 jam.
Biakan segar dinding sel belum mengalami kerusakan.
Biakan tua dinding sel sudah mulai mengalami kerusakan zat warna dapat
keluar saat diberikan larutan.
Gram-positif
Gram-negatif
Kristal violet
Ungu
Ungu
Larutan mordant
Ungu
Ungu
Ungu
Tidak
(lugol)
Larutan pemucat
(aseton, alkohol)
Safranin
HANDBOOK OF TA HAYATI
berwarna
Ungu
Merah
33
Bakteri Gram-positif
Bakteri Gram-negatif
oleh 1% KOH
1% KOH
pembentuk spora
spora
asam
HANDBOOK OF TA HAYATI
34
Pewarnaan Ziehl-Neelsen
Untuk memisahkan bakteri menjadi kelompok tahan asam dan tidak tahan asam.
TABEL PEWARNAAN DIFERENSIAL (pewarnaan Ziehl-Neelsen)
Tahan Asam
Karbol fuksin
Merah
Merah
Larutan pemucat
Merah
Tidak berwarna/pucat
Merah
Biru
( mengandung asam
dan alkohol)
Biru metilen
HANDBOOK OF TA HAYATI
35
BAB V
UJI IDENTIFIKASI BAKTERI
Endo Agar
Agar Darah
Litmus Milk
ENDO AGAR
Mengandung : laktosa, Na-sulfit
Sifat pertumbuhan koloni :
Bakteri yang tidak memfermentasikan laktosa terlihat sebagai koloni yang tembus
terang, tidak berwarna dan dikelilingi oleh media yang berwarna merah muda.
Bakteri yang memfermentasikan laktosa terlihat sebagai koloni yang berwarna
merah metalik dan dikelilingi oleh media yang berwarna kemerahan.
HANDBOOK OF TA HAYATI
36
Koloni
Bakteri
Laktose negatif
(Salmonella, Shigella)
Merah metalik
Merah muda
Enterobacter,
Klebsiella,
Citrobacter
HANDBOOK OF TA HAYATI
37
Koloni
Bakteri
Serupa media
Salmonella, Shigella
E. coli
zona keruh
Merah muda
Enterobacter, Klebsiella
Enterococcus,
tembus
Staphylococcus
HANDBOOK OF TA HAYATI
38
Koloni
Bakteri
E. coli
Laktose-negatif
zona bening
Biru hijau dan tidak terang tembus
Staphylococcus
Enterococcus
AGAR DARAH
Untuk menumbuhkan bakteri yang sulit untuk dibiakkan dan untuk membedakan kelompok
bakteri yang melisis atau tidak melisiskan butir darah merah.
Mengandung 5% darah domba.
Lisis butir darah merah terlihat sebagai wilayah jernih di sekitar koloni.
Jenis-jenis hemolisis :
o Beta-hemolisis : lisis sempurna, wilayah benar-benar jernih.
o Alpha-hemolisis : proses lisis tidak sempurna, media berwarna kehijauan.
HANDBOOK OF TA HAYATI
39
o Gamma-hemolisis : bakteri tidak mampu melisiskan butir darah merah dan tidak
menyebabkan perubahan nyata pada media.
o Proses hemolisis disebabkan oleh enzim yang dilepaskan bakteri.
LITMUS MILK
Mengandung skim milk dan indikator litmus.
Reaksi yang terjadi :
o Asam : Media berubah warna menjadi merah muda.
o Basa : Media berubah warna menjadi biru atau ungu.
o Reduksi : Media berubah warna menjadi putih.
o Koagulasi : Media akan terlihat padat karena koagulasi protein pada keadaan asam.
o Peptonisasi : Media berubah warna menjadi biru.
o Pembentukan Gas : Terjadi penguraian laktosa menjadi asam dan gas.
40
dan uji biokimia. Mikroorganisme yang akan diisolasi berasal dari biakan murni.
Setelah biakan murni diperoleh, serangkaian uji dilakukan untuk memperoleh sifat
biokimiawi mikroorganisme.
Acuan yang digunakan dalam identifikasi bakteri pada saat ini adalah
Bergeys Manual of Systematic Bacteriology. Identifikasi Bergeys mendasarkan pada
morfologi, sifat faal dan sifat biokimiawi bakteri. Adapun tahapan dalam isolasi dan
identifikasi bakteri dari suatu suspensi sebagai berikut :
1. Pembiakan ; untuk mengetahui sifat biakan. Suspensi bakteri digoreskan pada
agar lempengan, agar miring atau media cair. Koloni yang terbentuk harus
diperhatikan untuk mengetahui sifat pertumbuhan bakteri pada biakan.
2. Pewarnaan
Pewarnaan Gram dibuat untuk mengetahui sifat Gram serta morfologi bakteri.
Jika diperoleh suatu bakteri berbentuk batang Gram-positif, harus ditentukan
ada dan tidak adanya endospora serta letaknya. Bakteri berbentuk batang
Gram-negatif jarang menghasilkan spora. Jika bakteri yang ditemukan
berbentuk batang, Gram-positif dan tidak membentuk spora, maka perlu
dilakukan pewarnaan Ziehl-Neelsen. Apabila diperlukan, pewarnaan khusus
dapat dilakukan.
3. Uji Biokimia
Setelah diperoleh koloni yang terpisah pada biakan, dapat dilakukan uji
biokimia. Uji biokimia memerlukan berbagai media, maka perlu dibuat biakan
harian (working culture) dari koloni terpisah tersebut.
HANDBOOK OF TA HAYATI
41
Penggunaan zat hara pada media (zat pati, lemak, protein, asam nukleat, asam
amino, sakarida) tergantung aktivitas metabolisme bakteri. Hasil sampingan dari
metabolisme tersebut dapat digunakan untuk identifikasi bakteri.
1. Uji Fermentasi Karbohidrat
Hasil akhir fermentasi karbohidrat ditentukan oleh sifat bakteri, media
biakan yang digunakan, serta faktor lingkungan antara lain suhu dan pH.
Media fermentasi harus mengandung senyawa yang dapat dioksidasikan
dan difermentasikan oleh bakteri. Pembentukan asam hasil fermentasi dapat
diketahui dengan cara pemberian indikator ke dalam media.
Media : Kaldu karbohidrat (glukosa, laktosa, manitol, maltosa dan sukrosa).
Media digunakan untuk uji pembentukan asam dan gas hasil fermentasi.
Pembentukan gas dapat ditentukan dengan menggunakan tabung Smith
atau Durham.
Tabung Smith digunakan bila jumlah dan macam gas yang dihasilkan harus
ditentukan.
Tabung Durham digunakan bila jumlah dan macam gas yang dihasilkan
tidak perlu diketahui. Bila terbentuk gas, gas masuk ke dalam tabung
Durham dan mendesak cairan dalam tabung ini; gas ini terlihat sebagai
gelembung udara yang terperangkap dalam tabung Durham.
Asam hasil fermentasi menyebabkan penurunan pH. Indikator yang
digunakan : merah fenol dan bromcresol purple. Pembentukan asam
ditandai oleh perubahan warna menjadi kuning.
HANDBOOK OF TA HAYATI
42
HANDBOOK OF TA HAYATI
43
menggunakan
glukosa
sebagai
sumber
energi
dengan
HANDBOOK OF TA HAYATI
44
Katalase
Gelembung O2
HANDBOOK OF TA HAYATI
45
o Uji reduksi nitrat menggunakan kaldu nutrien yang mengandung KNO3 dan
tabung Durham. Perhatikan apakah terbentuk gas pada tabung serta nitrit
pada media biakan.
o Gas yang terperangkap dalam tabung Durham merupakan campuran gas N2
dan CO2.
o Gas N2 berasal dari penguraian sempurna nitrat, sedangkan CO2 berasal dari
siklus Krebs.
o Penambahan asam sulfamat dalam media biakan yang mengandung nitrit
akan menyebabkan pembentukan gelembung gas (N2) sebagai hasil reduksi
(NO2-) menjadi N2.
5. Uji Indol
Gugus indol merupakan bagian dari asam amino triptofan. Dalam media
biakan, indol menumpuk sebagai produk buangan, sedangkan bagian lain
dari molekul triptofan digunakan untuk memenuhi kebutuhan zat hara
bakteri.
Penumpukan indol dalam media biakan dapat diketahui dengan
penambahan reagens (Kovacs, Gore, Ehrlich dan Ehrlich-Bohme) yang
mengandung para-dimetil-aminobenzaldehida. Reagens akan bereaksi
dengan indol dan menghasilkan senyawa yang tidak larut dalam air dan
berwarna merah pada permukaan media biakan.
Media yang digunakan bersifat semipadat, oleh karena itu dapat digunakan
juga untuk melihat pergerakan bakteri. Jika bakteri bergerak akan terlihat
pertumbuhan di sekitar tusukan dan juga pada permukaan media.
HANDBOOK OF TA HAYATI
46
6. Uji IMViC
Uji untuk membedakan Enterobacter aerogenes dan E. coli.
Uji IMViC terdiri dari Uji Indol-Metil Merah-Voges Proskauer-Citrat.
Vi
E. coli
A. aerogenes
HANDBOOK OF TA HAYATI
47
warna
ungu
ini
menunjukkan
bahwa
lisin
mengalami
dekarboksilasi.
Uji dekarboksilasi lisin merupakan salah satu uji yang digunakan dalam
pencirian bakteri, terutama yang menempati saluran pencernaan.
9. Uji Deaminase Fenilalanin
Deaminase mengkatalisasi pemindahan gugus amino (NH2) dari asam amino
dan molekul lainnya yang mengandung NH.
Asam organik yang dihasilkan dapat digunakan bakteri untuk biosintesis.
Proses deaminasi menetralisasi amin yang menghambat pertumbuhan.
Uji deaminasi fenilalanin dapat digunakan dalam identifikasi bakteri saluran
pencernaan.
HANDBOOK OF TA HAYATI
48
HANDBOOK OF TA HAYATI
49
BAB VI
UJI MIKROORGANISME KUANTITATIF
Uji Kuantitatif Bakteri
Untuk menentukan jumlah bakteri dapat digunakan beberapa cara, antara lain :
Jumlah bakteri secara keseluruhan (total cell count); dihitung semua bakteri
baik yang hidup maupun yang mati.
Jumlah bakteri yang hidup (viable count); dihitung bakteri yang hidup saja.
HANDBOOK OF TA HAYATI
50
HANDBOOK OF TA HAYATI
51
HANDBOOK OF TA HAYATI
52
HANDBOOK OF TA HAYATI
53
54
Standard
Plate
10-2
10-3
10-4
Ket
Count
234
28
2.3 x 104
28 dan 1 <30
700
125
10
1.3 x 105
700>300;10<30
TBUD
TBUD
197
2.0 x 106
TBUD >300
HANDBOOK OF TA HAYATI
55
Standard
Ket
Plate
10-2
10-3
16
10-4
Count
<3.0 x 103 Hit.
(1.6 x 103)
pengenceran
pada 10-2
3. Jika semua pengenceran yang dibuat menghasilkan lebih dari 300 koloni pada
cawan petri, hanya jumlah koloni pada pengenceran tertinggi yang dihitung,
misal dengan cara menghitung jumlahnya pada bagian cawan petri,
kemudian hasilnya dikalikan empat. Hasilnya dilaporkan sebagai lebih dari 300
dikalikan dengan besarnya pengenceran, tetapi jumlah yang sebenarnya harus
dicantumkan dalam tanda kurung.
Jumlah koloni per pengenceran
Standard
Ket
Plate
10-2
TBUD
10-3
TBUD
10-4
355
Count
> 3.0 x 106 Hit.
(3.6 x 106)
pengenceran
pada 10-4
TBUD
325
20
pengenceran
pada 10-3
HANDBOOK OF TA HAYATI
56
4. Jika cawan dari dua tingkat pengenceran menghasilkan koloni dengan jumlah
antara 30 dan 300, dan perbandingan antara hasil tertinggi dan terendah dari
kedua pengenceran tersebut adalah lebih kecil atau sama dengan 2, tentukan
rata-rata dari kedua nilai tersebut dengan memperhitungkan pengencerannya.
Jika perbandingan antara hasil tertinggi dan terendah lebih besar dari 2, yang
dilaporkan hanya hasil terkecil.
Jumlah koloni per pengenceran
Standard
Plate
10-2
293
10-3
41
10-4
Ket
Count
3.5 x 104
Hit.
rata-
ratanya
karena
41000/29300
= 1.4 (<2)
140
32
1.4 x 104
Hit.
pengenceran
pada
10-2
karena
32000/14000
= 2.3 (>2)
HANDBOOK OF TA HAYATI
57
5. Jika digunakan dua cawan petri (duplo) per pengenceran, data yang diambil
harus dari kedua cawan tersebut, tidak boleh diambil salah satu, meskipun
salah satu dari cawan duplo tersebut tidak memenuhi syarat diantara 30 dan
300.
Jumlah koloni per pengenceran
Standard
Plate
10-2
10-3
10-4
175
16
208
17
Ket
Count
1.9 x 104
Rata-rata dari
pengenceran
10-2
138
42
162
43
1.5 x 104
Rata-rata dari
pengenceran
10-2
karena
perbandingan
antara
pengenceran
10-3 dan 10-2
adalah
2.8
(>2)
290
36
280
32
3.1 x 104
Rata-rata dari
pengenceran
10-2 dan 10-3
HANDBOOK OF TA HAYATI
58
karena
perbandingan
antara kedua
pengenceran
adalah
1.2
(<2)
291
25
305
27
3.0 x 104
Rata-rata dari
pengenceran
10-2
meskipun
305>300
(angka yang
lain <30)
HANDBOOK OF TA HAYATI
59
Uji kualitatif koliform terbagi atas uji penduga, uji penguat, uji lengkap. Uji
penduga merupakan uji kuantitatif koliform menggunakan metode MPN.
2. Metode MPN (Most Probable Number)
Dikenal dengan metode Jumlah Perkiraan Terdekat.
Dalam metode MPN digunakan media cair di dalam tabung reaksi, dimana
perhitungan dilakukan berdasarkan jumlah tabung yang positif, yaitu yang
ditumbuhi oleh bakteri tertentu setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu.
Pengamatan tabung yang positif dilihat dari timbulnya kekeruhan, atau
terbentuknya gas dalam tabung Durham untuk bakteri pembentuk gas.
Pada umumnya untuk setiap pengenceran digunakan tiga atau lima seri tabung.
Metode MPN biasanya dilakukan untuk menghitung jumlah bakteri dalam
sampel yang berbentuk cair, meskipun dapat pula digunakan untuk sampel
berbentuk padat dengan terlebih dahulu membuat suspensi 1 : 10 dari sampel
tersebut.
Pengenceran harus lebih tinggi dibandingkan metode hitungan cawan.
Cara kerja :
1. Buat seri pengenceran (minimal 3).
2. Inokulasikan tiap pengenceran pada 3 atau 5 seri tabung media MPN, yaitu
Lactosa Broth kemudian dilanjutkan dengan media Brilliant Green Lactose
Bile Broth.
3. Inkubasi dan diamati hasilnya.
4. Uji positif jika keruh atau terbentuk gas.
5. Gas dapat terlihat dari adanya rongga kosong pada tabung Durham.
HANDBOOK OF TA HAYATI
60
= 1.50 x 1/10-3
= 1.5 x 103
Uji Penduga
1. Buat seri media laktosa cair (Lactosa Broth) dengan suatu takaran air
tertentu (10 ml, 1 ml, 0.1 ml).
2. Inkubasi 24 jam, 370C.
3. Amati terjadinya gas.
Uji Penguat
1. Dari tabung yang memberi hasil positif timbul gas, ditanam ke dalam
media agar Endo atau EMB (Eosin Metilen Blue) atau BGLBB (Brilliant
Green Lactose Bile Broth).
2. Inkubasi pada suhu 370C selama 18-24 jam.
3. Amati terdapar E.coli bila :
o Pada Endo Agar warna merah mengkilap logam
o Pada EMB warna biru tua mengkilap logam
o Pada BGLBB gas positif
HANDBOOK OF TA HAYATI
61
Uji Lengkap
1. Dari koloni yang timbul (positif/meragukan) ditanam ke dalam media
laktosa dan agar miring.
2. Inkubasi pada suhu 370C selama 24-48 jam.
3. Amati pada :
o Laktosa timbul gas.
o Koloni khas pada agar miring.
o Pewarnaan Gram-negatif bentuk batang dan tidak berspora.
4. Untuk menentukan antara E.coli dengan golongan bentuk E.coli lainnya,
maka dari pemeriksaan uji lengkap diteruskan uji IMViC.
HANDBOOK OF TA HAYATI
62
Syarat jumlah bakteri dalam suatu sediaan <106 CFU (Colony Forming Unit)
per ml untuk bakteri.
Syarat jumlah kapang/khamir dalam suatu sediaan <104 CFU/ml untuk
kapang/khamir.
HANDBOOK OF TA HAYATI
63
BAB VII
DESINFEKTAN
HANDBOOK OF TA HAYATI
64
65
HANDBOOK OF TA HAYATI
66
b. Bahan pengoksidasi :
Halogen; misal klorin (sebagai desinfektan air), iodin (sebagai
desinfektan kulit).
Hidrogen peroksida (H2O2); merupakan desinfektan yang banyak
digunakan untuk desinfeksi yang tidak hidup, seperti peralatan bedah
dan lensa kontak.
c. Pewarna; beberapa jenis pewarna tidak hanya mewarnai bakteri, tetapi juga
menghambat pertumbuhannya pada enceran sangat tinggi. Misal :
Pewarna trifenilmetan (pewarna anilin), derivatnya : hijau berlian, hijau
malakit, violet kristal. Ketiga derivatnya bersifat selektif terhadap Grampositif.
Pewarna akridin (disebut juga flavin), misal : proflavina, akriflavina.
Keduanya bersifat sebagai antiseptik luka.
Berbeda dengan pewarna anilin, pewarna akridin tidak terpengaruh daya
antimikrobanya dengan kehadiran serum atau nanah.
d. Bahan pengalkil; inhibisi yang dihasilkan bahan pengalkil adalah
irreversible sehingga terjadi modifikasi enzim dan inhibisi kegiatan enzim.
Misal :
1. Aldehida ;
HANDBOOK OF TA HAYATI
67
2. Etilen oksida; merupakan bahan dalam bentuk gas, untuk sterilisasi materi
yang rusak karena panas, misalnya peralatan elektronik, kedokteran, biologik
dan obat. Selain bereaksi dengan protein juga bereaksi dengan ADN dan ARN.
Untuk membandingkan kekuatan desinfektan dalam menghambat pertumbuhan
bakteri dapat digunakan cakram kertas.
Pada cakram kertas dibasahi dengan desinfektan, kemudian diletakkan pada
lempengan agar yang telah diinokulasi.
Lempengan agar kemudian dierami selama 48 jam. Jika desinfektan menghambat
pertumbuhan bakteri, maka akan terlihat daerah jernih sekeliling cakram kertas.
Luas daerah terang ini menjadi ukuran kekuatan daya kerja desinfektan.
HANDBOOK OF TA HAYATI
68
BAB VIII
ANTIBIOTIKA
Antibiotika adalah :
Senyawa kimia yang dihasilkan oleh mikroorganisme atau senyawa sejenis
yang seluruhnya atau sebagian diproduksi secara sintesis kimia yang dalam
konsentrasi rendah dapat menghambat pertumbuhan mikroorganisme lainnya.
Persyaratan antibiotika :
1. Dapat merusak atau menghambat mikroorganisme patogen tanpa
merusak tuan rumah.
2. Mikroorganisme yang peka terhadapnya tidak menjadi resisten.
3. Tidak menimbulkan alergi dan efek samping yang tidak diinginkan jika
digunakan secara berkesinambungan dengan dosis tinggi.
4. Harus tetap aktif dalam plasma, cairan tubuh atau eksudat.
5. Larut dalam air dan stabil serta tingkat membunuh atau menghambat
pertumbuhan mikroorganisme cepat tercapai dan dapat dipertahankan
untuk waktu yang diperpanjang.
Mekanisme kerja antibiotika :
1. Inhibitor dinding sel
2. Inhibitor membran sel
3. Inhibitor fungsi ADN
4. Inhibitor terhadap sintesis protein
HANDBOOK OF TA HAYATI
69
HANDBOOK OF TA HAYATI
70
HANDBOOK OF TA HAYATI
71
a. Polimiksina
1. Terdiri atas polimiksina A,B,C,D dan E.
2. Polimiksina B yang banyak digunakan sebagai obat.
3. Antibiotika ini mengikat permukaan luar dari membran sel serta
mengubah struktur dan kandungan osmosis dari sel.
4. Dihasilkan oleh Bacillus polymixa.
5. Efektif terhadap Gram-positif dan Gram-negatif.
b. Antibiotika poliena
Merupakan antibiotika antifungal, yaitu :
1. Nistatin; dihasilkan oleh Streptomyces noursei; tidak digunakan dalam
bentuk
injeksi
karena
toksik.
Digunakan
di
kulit
untuk
HANDBOOK OF TA HAYATI
72
Tiap bahan yang dapat mengganggu struktur dan fungsi ADN, maka mampu
menimbulkan efek yang mendalam dalam semua fase pertumbuhan dan
mikroorganisme yang bersangkutan.
Novobiosina
Efektif terhadap Gram-positif, dihasilkan oleh Streptomyces niveus, yang
memiliki daya kerja menghambat replikasi DNA.
HANDBOOK OF TA HAYATI
73
HANDBOOK OF TA HAYATI
74
3. Nitrofuran
Misal : Nitrofurantoin, efektif terhadap infeksi saluran genitourinaria pada
penderita yang tidak tahan terhadap sulfonamida.
4. Kloramfenikol
Dihasilkan oleh Streptomyces venezuelae, bersifat bakteriostatik terhadap
Gram-positif dan Gram-negatif, riketsia dan klamidia.
Menghambat pertumbuhan bakteri dengan mengganggu sintesis protein.
5. Eritromisin
Bersifat bakteriostatik dan dalam kadar tinggi sebagai bakterisida.
Dihasilkan oleh Streptomyces erytherus.
Efektif untuk infeksi pneumonia, atau diberikan pada penderita yang alergi
terhadap penicillin dan yang menderita infeksi akibat streptococcus dan
pneumococcus.
6. Linkomisin dan klindamisin
Dihasilkan oleh Streptomyces linkolensis.
Klindamisin adalah derivat khloro dari linkomisin yang dibuat secara
semisintesis. Spektrum kerjanya sama dengan eritromisin walaupun secara
kimia tidak ada hubungannya. Efektif terhadap streptococcus, pneumococcus
dan staphylococcus.
HANDBOOK OF TA HAYATI
75
7. Griseofulvin
Dihasilkan oleh Penicillium griseofulvum, merupakan fungistatik dan
mengganggu proses tubulin menjadi mikrotubula griseofulvin mengikat
protein di dalam perakitan tubulina. Jadi proses sel yang terkandung pada
fungsi mikrotubula seperti pergerakan kromosom selama mitosis akan
terhambat oleh griseofulvin.
HANDBOOK OF TA HAYATI
76
BAB IX
UJI SENSITIVITAS
1. Desinfektan
Daya kerja antimikroba (desinfektan) bahan kimia seringkali disetarakan dengan
fenol.
Kemampuan bahan kimia dibandingkan dengan fenol disebut koefisien fenol.
Koefisien fenol adalah angka yang menunjukkan ratio/perbandingan dari
pengenceran tertinggi desinfektan yang diuji dengan pengenceran tertinggi dari
fenol yang dapat membunuh mikroorganisme penguji dalam 10 menit, tetapi tidak
bisa membunuh dalam 5 menit.
Bahan kimia yang memiliki koefisien fenol lebih dari 1, mempunyai daya kerja
antimikroba yang lebih baik dibandingkan dengan fenol.
Macam-macam desinfektan antara lain Lysol, Creolin, Denol, Dettol, SOS dll.
Bila larutan desinfektan uji dengan pengenceran 1 : 250 dapat membunuh populasi
S. aureus, sedangkan hasil yang sama ditunjukkan oleh fenol pada pengenceran 1 :
60, maka koefisien fenol sebagai desinfektan uji adalah 250/60 atau 4.2. Hasil ini
menunjukkan bahwa desinfektan uji 4.2 kali lebih efektif dibandingkan fenol
dalam membunuh S. aureus secara in vitro.
HANDBOOK OF TA HAYATI
77
Rumus :
Koefisien fenol (KF) = (a/b + c/d)/2
Ket :
a Faktor pengenceran tertinggi larutan uji desinfektan masa kontak 5.
b Faktor pengenceran tertinggi larutan baku fenol masa kontak 5.
c Faktor pengenceran tertinggi larutan uji desinfektan masa kontak 10.
d Faktor pengenceran tertinggi larutan baku fenol masa kontak 10.
Contoh :
Pengenceran
Desinfektan Waktu
1/50 1/60 1/70 1/80 1/90 1/100 1/110 1/120 1/130 1/140
Fenol
Lysol
-(b)
10
-(d)
-(a)
10
-(c)
HANDBOOK OF TA HAYATI
78
Kf = (a/b + c/d)/2
= (130/120 + 140/130)/2
= 1.080
Ket :
Kf > 1 : bahan antimikroba/desinfektan efektif
Kf < 1 : bahan antimikroba/desinfektan kurang efektif
Cara kerja :
1. Baku fenol 5%
Buat pengenceran menggunakan aquadest steril (tiap tabung hanya diperlukan
5 ml fenol).
Pengenceran dibuat dengan 2 bagian waktu, yaitu 5 dan 10 tiap bagian
waktu terdiri dari 10 tabung pengenceran.
2. Inokulasi bakteri uji untuk fenol 5%.
Masukkan 0.5 ml biakan bakteri pada masing-masing tabung pengenceran
dimulai dari tabung pengenceran 5.
Ketika pertama kali memasukkan bakteri uji pada tabung pengenceran yang
pertama, waktu dicatat sebagai 0 (nol) menit. Interval waktu antar tabung
adalah 30 detik.
Perlakuan sama terhadap pengenceran 10.
HANDBOOK OF TA HAYATI
79
2. Antibiotika
Cara yang umum digunakan untuk mengetahui kekuatan antibiotika adalah uji
kepekaan (sensitivitas) antibiotika terhadap mikroorganisme patogen penyebab
penyakit. Adapun cara dibawah ini tidak terbatas pada antibiotika saja, tetapi juga
agen antimikroba lainnya.
A. Metode Minimum Inhibitory Concentration (MIC)
Bahan antimikroba bersifat menghambat bila digunakan dalam konsentrasi
kecil, dan mematikan mikroorganisme bila digunakan dalam konsentrasi
tinggi.
Oleh karena itu, perlu diketahui Minimum Inhibitory Concentration (MIC) dan
Minimum Killing Concentration) bahan antimikroba tersebut terhadap
mikroorganisme.
Dalam uji ini diperlukan suspensi baku dari mikroorganisme patogen yang
ditumbuhkan dalam kaldu.
HANDBOOK OF TA HAYATI
80
yang mampu
mematikan
atau
menghambat
pertumbuhan
mikroorganisme patogen.
MIC merupakan petunjuk konsentrasi antibiotika yang mampu menghambat
mikroorganisme dan juga memberikan petunjuk mengenai dosis yang
diperlukan dalam pengobatan penyakit.
Dengan mengetahui MIC dan sifat cairan tubuh seperti darah dan urin, dapat
ditentukan jenis antibiotik yang ampuh untuk pengobatan, besarnya dosis yang
diperlukan.
Umumnya, batas keamanan penggunaan antiibiotika untuk pengobatan
penyakit adalah sepuluh kali dosis MIC.
MIC dapat ditentukan dengan menggunakan cairan tubuh tanpa harus
mengisolasi ataupun mengidentifkasi mikroorganisme penyebab penyakit.
HANDBOOK OF TA HAYATI
81
B. Metode Antibiogram-Kirby-Bauer
Uji ini diperkenalkan oleh William Kirby dan Alfred Bauer pada tahun 1966.
Pada uji ini, lempengan agar ditaburi dengan mikroorganisme penguji.
Cakram kertas (disc) yang berisi berbagai antibiotika diletakkan diatas
lempengan agar tersebut.
Penghambatan pertumbuhan mikroorganisme oleh antibiotika terlihat sebagai
wilayah jernih sekitar pertumbuhan mikroorganisme (zona hambat).
Luasnya wilayah jernih merupakan petunjuk kepekaan mikroorganisme
terhadap antibiotika dan juga berkaitan dengan kecepatan berdifusi antibiotika
dalam media.
Faktor-faktor yang mempengaruhi ukuran diameter zona hambat :
o Kekeruhan suspensi bakteri :
Kurang keruh diameter zona hambatan lebih lebar.
Lebih keruh diameter zona hambatan lebih sempit.
o Kekeruhan suspensi bakteri harus distandardisasi terlebih dahulu.
HANDBOOK OF TA HAYATI
82
HANDBOOK OF TA HAYATI
83
Tebal agar-agar
Ketebalan agar-agar sekitar 4 mm.
< 4 mm difusi obat lebih cepat.
> 4 mm difusi obat lebih lambat.
Jarak antar disc obat
Jarak yang dianjurkan minimum 15 mm, untuk menghindari terjadinya zona
hambatan yang tumpang tindih. Cawan petri dengan diameter 9-10 cm,
maksimum dapat memuat 7 disc obat. Penempelan disc obat dapat
menggunakan pinset.
Potensi disc obat
Tiap jenis disc obat memiliki diameter yang sama, tetapi potensinya berbeda.
Komposisi media
Berpengaruh terhadap pertumbuhan bakteri, difusi obat, aktivitas obat dsb.
84
HANDBOOK OF TA HAYATI
85
HANDBOOK OF TA HAYATI
86
Kontrol Kualitas
o Adalah usaha yang dilakukan untuk menetralisasi faktor-faktor yang
berpengaruh terhadap diameter zona hambat.
o Memeriksa mutu media dan disc obat dengan menggunakan bakteri standar:
S. aureus ATCC 25923, E. coli ATCC 25922 dan P. aeruginosa ATCC
27853.
HANDBOOK OF TA HAYATI
87
BAB X
UJI PRODUK FARMASI
1. Uji Pirogen
Pirogen adalah reaksi demam pada tingkat yang dapat diterima oleh pasien pada
pemberian sediaan injeksi.
Tujuan Uji Pirogen :
Membatasi resiko reaksi demam.
Pengujian meliputi : pengukuran kenaikan suhu kelinci setelah penyuntikan
larutan uji secara intravena dan ditujukan untuk sediaan yang dapat ditoleransi
dengan uji kelinci dengan dosis penyuntikan tidak lebih dari 10 ml per kg bobot
badan dalam jangka waktu tidak lebih dari 10 menit.
Alat dan Pengencer
Alat :
1. Alat suntik
2. Jarum
3. Alat kaca bebas pirogen
Pengencer : Sesuai monografi
Misal : apabila digunakan injeksi Natrium Klorida sebagai pengencer, gunakan
injeksi yang mengandung larutan Natrium Klorida P 0.9 %.
HANDBOOK OF TA HAYATI
88
Rekaman suhu
Termometer yang telah dikalibrasi untuk menjamin ketelitian skala 0.10C dan
telah diuji bahwa pembacaan suhu maksimum tercapai 5 menit.
Cara :
Masukkan alat pengukur suhu ke dalam anus kelinci dengan kedalaman tidak
kurang dari 7.5 cm.
Hewan Uji
1. Kelinci dewasa yang sehat
2. Tempatkan satu ekor dalam satu kandang dengan suhu 20-230C dan bebas dari
gangguan yang menimbulkan kegelisahan.
3. Untuk kelinci yang belum pernah digunakan untuk uji pirogen adaptasikan
tidak lebih dari 7 hari dengan uji pendahuluan.
4. Kelinci tidak boleh digunakan untuk uji pirogen lebih dari sekali dalam waktu
48 jam atau sebelum 2 minggu setelah digunakan untuk uji pirogen bila
menunjukkan kenaikan suhu maksimum 0.600C atau lebih, atau digunakan
untuk sediaan yang mengandung pirogen.
Prosedur :
Pengujian dalam ruang terpisah dengan kondisi lingkungan yang sama dengan
ruang pemeliharaan, bebas dari keributan yang menyebabkan kegelisahan.
Kelinci tidak diberi makan selama waktu pengujian.
Minum dibolehkan setiap saat, tetapi dibatasi pada saat pengujian.
HANDBOOK OF TA HAYATI
89
Tidak lebih 30 menit sebelum penyuntikan larutan uji, tentukan suhu. Suhu
awal setiap kelinci tidak boleh lebih dari 39.80C.
Beda suhu setiap kelinci tidak boleh lebih dari 10.
Kecuali dinyatakan lain, suntikan 10 ml/kg BB melalui vena tepi telinga 3 ekor
kelinci dan penyuntikan dilakukan dalam waktu 10 menit.
Semua larutan harus bebas dari kontaminasi, dengan cara menghangatkan pada
suhu 370 2 sebelum penyuntikan.
Penafsiran Hasil :
1. Setiap penurunan suhu dianggap nol, sediaan memenuhi syarat apabila tak
seekor kelinci pun menunjukkan kenaikan suhu 0.50 atau lebih.
2. Jika ada kelinci yang menunjukkan kenaikan 0.50 atau lebih lanjutkan
pengujian menggunakan 5 ekor kelinci. Jika tidak lebih dari 3 ekor dari 8
kelinci masing-masing menunjukkan suhu 0.50 atau lebih dan jumlah
kenaikan suhu maksimum 8 ekor kelinci tidak lebih dari 3.30, sediaan
dinyatakan memenuhi syarat bebas pirogen.
2. Uji Sterilitas
Media yang digunakan untuk uji sterilitas :
Media tioglikolat cair
Media tioglikolat alternatif
Soybean-casein digest medium
HANDBOOK OF TA HAYATI
90
Prosedur umum
Prosedur pengujian terdiri atas :
a. Inokulasi langsung ke dalam media uji
CAIRAN
1. Pindahkan cairan dari wadah uji (ampul atau vial) menggunakan pipet atau
jarum suntik steril.
2. Secara aseptik inokulasikan sejumlah tertentu bahan dari tiap wadah uji ke
dalam tabung media.
3. Campur cairan dengan media.
4. Inkubasi selama 14 hari.
5. Amati pertumbuhan pada media secara visual sesering mungkin sekurangnya
pada hari ke-3, ke-4 dan ke-5 atau ke-7 dan ke-8 pada hari terakhir masa uji.
ZAT PADAT
1. Ambil sejumlah tertentu produk dalam bentuk padat kering (atau yang terlebih
dahulu dibuat larutan atau suspensi dalam cairan pengencer steril) dengan tidak
kurang dari 300 mg tiap wadah atau seluruh isi wadah jika tiap isi kurang dari
300 mg.
2. Inokulasikan ke dalam masing-masing tidak kurang dari 40 ml media
tioglikolat cair dan soybean-casein digest medium.
3. Langkah selanjutnya sama seperti langkah pada CAIRAN.
HANDBOOK OF TA HAYATI
91
HANDBOOK OF TA HAYATI
92
93
15
-
15
+
+
Baku
Pengenceran
1 : 80
1 : 90
1 : 100
15
+/-
Bila dari dua pengenceran pertama dari baku fenol yang diuji tidak ada satupun
tabung pengenceran yang memberikan hasil positif dalam masa kontak 5 dan
HANDBOOK OF TA HAYATI
94
memberikan hasil pertumbuhan negatif dalam masa kontak 10, maka diperkirakan
bahwa pengenceran yang diharapkan berada diantara pengenceran kedua (1 : 90) dan
pengenceran ketiga (1 : 100). Lihat tabel di bawah.
5
+
1 : 80
1 : 90
1 : 100
Lama kontak
10
+
15
-
5
+
Lama kontak
10
+
15
-
Jadi angka perkiraan untuk baku fenol antara 90-100, untuk desinfektan antara 350400.
Hitung koefisien fenol (KF).
HANDBOOK OF TA HAYATI
95
BAB XI
FUNGI
Terbagi atas dua golongan yaitu kapang dan khamir.
Kapang
Membentuk filamen panjang yang disebut hifa dan merupakan ciri utama
fungi.
Kumpulan hifa disebut miselium.
Hifa memiliki dua struktur yaitu bersepta dan tidak bersepta.
Septa menyekat sel sehingga filamen yang panjang terlihat sebagai rangkaian
sel.
Hifa yang tidak bersepta disebut hifa konositik.
Dinding sel fungi mengandung khitin yang merupakan komponen utama
dinding sel. Hifa mengabsorbsi zat hara dari sekelilingnya dan memanjang
dengan cara membelah diri.
Hifa dapat membentuk struktur reproduksi yang disebut spora.
Metode untuk melihat struktur fungi dengan jelas adalah dengan slide culture.
Identifikasi kapang berdasarkan ciri morfologi hifa, warna (pigmen) hifa,
jenis hifa (ada septa/tidak), ukuran, bentuk, warna serta penataan spora.
HANDBOOK OF TA HAYATI
96
Ciri
Hifa konositik.
Spora seksual : zygospora.
Spora aseksual : sporangiospora
dalam sporangium.
Contoh : Rhizopus dan Mucor.
Ascomycetes
Hifa bersepta.
Spora seksual : askuspora dalam
askus.
Spora aksesual : konidium.
Contoh
Neurospora,
Saccharomyces.
Deuteromycetes
HANDBOOK OF TA HAYATI
97
Slide Culture
Cara :
1. Letakkan kertas saring pada dasar cawan petri.
2. Letakkan batang gelas steril berbentuk U diatas kertas saring.
3. Kertas saring dibasahi dengan air, sehingga suasana dalam cawan petri menjadi
lembab.
4. Letakkan object glass diatas batang gelas berbentuk U.
5. Potong agar Saboraud berbentuk persegi dan letakkan diatas object glass.
6. Sisi dari agar ini diinokulasi dengan kapang.
7. Letakkan kaca penutup diatas potongan agar, kemudian tutup cawan petri.
HANDBOOK OF TA HAYATI
98
Khamir (Ragi)
Merupakan fungi yang tidak berfilamen dan bereproduksi melalui pertunasan
atau pembelahan sel.
Pertunasan dapat terjadi melalui satu ujung (pertunasan polar) atau melalui
beberapa tunas di sekeliling sel (pertunasan multilateral).
Jenis pertunasan, bentuk dan jumlah askuspora merupakan ciri yang
banyak digunakan dalam identifikasi khamir.
Khamir digunakan dalam pembuatan roti dan anggur, namun ada khamir yang
bersifat patogen, contoh : Candida dan Cryptococcus.
HANDBOOK OF TA HAYATI
99
Ciri
Cryptococcus, Hanya ada pertunasan
Rhodotorula
Candida
Trichosporon
Tunas,
pseudomiselium
dan
arthrospora
Geotrichum
Saccharomyces
Torulopsis
Kecil, berbentuk oval, seringkali menyebabkan pencemaran dalam industri
minuman.
Cryptococcus
Besar, berbentuk bulat, mempunyai kapsel dan sering ditemukan pada buah,
C. neoformans bersifat patogen terhadap manusia.
Rhodotorula
Khamir berwarna merah atau merah muda. Bila biakan dibiarkan tumbuh
pada lempengan agar maltosa terlihat pertumbuhan koloni bayangan pada
bagian tutup cawan petri.
HANDBOOK OF TA HAYATI
100
Candida
Candida penting dalam bidang kesehatan, terutama C. albicans. Semua
candida membentuk koloni kekuningan dan licin pada agar, terkecuali C.
krusei yang berpenampilan seperti serpihan kaca. C. utilis sering digunakan
pada industri makanan sehingga sering disebut khamir pangan.
Trichosporon
T. cutaneum sering ditemukan pada permukaan kulit. Bila ditumbuhkan
pada agar maltosa akan terlihat sebagai koloni yang menyebar dan basah.
Geotrichum
Pencemar dalam industri makanan dan acar.
Saccharomyces
S. cereviseae digunakan dalam industri minuman dan roti.
HANDBOOK OF TA HAYATI
101
HANDBOOK OF TA HAYATI
102
Bila askuspora tidak ditemukan, biakkan khamir pada agar V-8 atau sepotong
wortel. Khamir seringkali membentuk askuspora pada media biakan yang kaya
seperti agar V-8.
Bandingkan dengan tabel di bawah ini.
HANDBOOK OF TA HAYATI
103
Daftar Pustaka
HANDBOOK OF TA HAYATI
104