Nama

: Thalia Anggrea Noor

NIM

: P07134014018

Semester

:V

PEMERIKSAAN TPHA (Treponema pallidum Hemagglutination Assay)

Hari / Tanggal: Rabu/ 14 September 2016
Tempat: Laboratorium Bakteriologi Jurusan Analis Kesehatan Poltekkes Denpasar
I.

TUJUAN
Untuk mendeteksi antibodi terhadap treponema pallidum dalam serum atau plasma
secara kualitatif dan semi-kuantitatif.

II.
III.

METODE
Metode yang digunakan dalam pemeriksaan TPHA adalah Indirek Hemaglutinasi.
PRINSIP
Berdasarkan reaksi aglutinasi antara reagen TPHA yang mengandung sel darah merah
unggas yang dilapisi dengan komponen Treponema pallidum sebagai antigen dengan
serum atau pasma pasien sebagai antibodi spesifik terhadap treponema pallidum.

IV.

DASAR TEORI
Sifilis adalah infeksi menular seksual yang disebabkan oleh bakteri spirochete
Treponema pallidum subsp. pallidum (T. pallidum). Meskipun sebagian besar kasus
sifilis terjadi di Amerika Latin, Afrika sub-Sahara, dan Asia Tenggara, perkembangan
sifilis telah diamati selama dekade terakhir di AS, Kanada, Australia, China, dan
beberapa negara Eropa. Selain itu, bukti bahwa penularan bawaan dari penyakit ini
merupakan penyebab utama dari lahir letal dan kematian perinatal di daerah
berkembang, dan bahwa pasien dengan sifilis berada pada peningkatan risiko untuk
transmisi dan akuisisi HIV, juga berkontribusi untuk membuat sifilis masalah kesehatan
global yang penting. (Wujian Ke dkk,2015)
Treponema pallidum sangat invasif dan mengalami penyebaran luas melalui sistem
peredaran darah dan merupakan penyakit menular seksual kronis yang menginfeksi 12
juta orang per tahun. Sejumlah penelitian telah menunjukkan bahwa T. pallidum mampu

masuk dengan cepat ke sistem peredaran darah setelah infeksi, dengan penyebaran
selanjutnya ke daerah host yang jauh. Sifat yang sangat invasif patogen selanjutnya
ditekankan oleh manifestasi klinis yang beragam dimana dapat terjadi pada infeksi sifilis
yang tidak diobati, termasuk ruam kulit, meningitis, penyakit mata, dan jantung dan
komplikasi neurologis, dan oleh kenyataan bahwa T. pallidum dapat menyebabkan
kerusakan tulang di sifilis tahap bawaan dan tersier. Selain itu, T. pallidum merupakan
salah satu dari hanya beberapa patogen yang dapat melintasi plasenta dan darah-otak
hambatan. (Simon Houston dkk,2012)
Infeksi T. pallidum biasanya bermanifestasi sebagai chancre menyakitkan pada
tempat infeksi sekitar 3 minggu setelah paparan patogen. Beberapa studi telah
menunjukkan bahwa patogen ini mampu menyerang hambatan jaringan dan
menyebabkan penyebarluasan cepat melalui sistem peredaran darah. Sifat yang sangat
invasif T. pallidum lebih lanjut dapat dilihat dari kemampuannya untuk melintasi
penghalang plasenta menyebabkan sifilis kongenital dan penghalang darah-otak untuk
menyerang systemand saraf pusat dengan manifestasi klinis yang beragam dan luas
terkait dengan sifilis sekunder dan tersier. (Simon Houston dkk,2015)
Pada tahap primer dan sekunder sifilis, gejala, seperti luka menyakitkan, kelelahan,
dan sakit kepala, mungkin terlewatkan atau keliru untuk kondisi lain. Jika terdeteksi
pada tahap primer atau sekunder, sifilis kemudian memasuki periode laten tanpa gejala
yang panjang; Oleh karena itu, banyak orang terus tidak menyadari bahwa mereka
terinfeksi dan bahwa mereka dapat menularkan infeksi melalui hubungan seksual atau
selama kehamilan. Jika tidak diobati, infeksi pada akhirnya berkembang ke tahap tersier
gejala yang lebih serius, yang dapat menyebabkan komplikasi yang signifikan, seperti
keterlibatan otak dan pembuluh darah (misalnya, aneurisma aorta, paresis umum, dan
tabes dorsalis). Namun, sifilis dapat berhasil diobati, terutama jika didiagnosis pada
tahap awal. Diagnosis Oleh karena itu penting sehingga pengobatan yang dapat dimulai
lebih awal untuk meningkatkan hasil dan mencegah penularan.(Martin Enders dkk,2015)
Biasanya dalam waktu 3 bulan dari infeksi, gejala sifilis sekunder muncul.
Manifestasi klinis yang paling umum adalah ruam makulopapular disebarluaskan. Gejala
tambahan mungkin termasuk malaise, penurunan berat badan, nyeri otot, limfadenopati
generalisata, alopecia tambal sulam, meningitis, radang mata, patch lendir (peradangan

lokal dari jaringan mukosa di rongga mulut dan alat kelamin), hepatitis, dan dismotilitas
lambung, mencerminkan T. pallidum invasi dan mengakibatkan infiltrasi sel kekebalan
jaringan tersebut. (Emily L Ho dkk,2011)
Dalam pemeriksaan Treponema pallidum terdapat dua katagori yaitu deteksi langsung
dari treponema dalam spesimen biologi (termasuk tes molekuler) dan tes serologi. tes
serologi untuk sifilis dan treponematoses endemic dibagi menjadi dua yaitu tes
nontreponemal dan treponema, berdasarkan antigen yang diakui selama reaksi.
penggunaan tes nontreponemal (untuk tujuan screening) perlu dikombinasikan dengan
tes treponemal untuk mengkonfirmasi hasil awal. tes nontreponemal menggunakan
campuran antigen lipid untuk mendeteksi antibodi hadir dalam sera pasien dengan
infeksi treponema. Tes nontreponemal paling umum termasuk cepat reagin plasma
(RPR) dan, Veneral Desease Reaserch Laboratory (VDRL) tes yang semakin menurun.
Yang mana kedua tes berupa flokulasi yang hasilnya dibaca dengan bantuan mikroskop
atau dengan mata telanjang. Tes treponemal didasarkan pada reaktivitas antibodi
terhadap asli atau rekombinan T. pallidum subsp. antigen pallidum dan biasanya
digunakan di Amerika Serikat dan di banyak negara lain untuk mengkonfirmasi tes
nontreponemal reaktif. Tes treponemal tradisional termasuk tes imunofluoresensi tidak
langsung seperti tes Treponemal Fluoresecnt T pallidum Antibody-Absorption (FTAABS), tes aglutinasi (misalnya, T. pallidum hemagglutination assay [TPHA] dan T.
pallidum partikel aglutinasi [TPPA]), Western and dot blot assays with native and
recombinant antigens and selain itu juga ada, automated enzyme immunoassays (EIAs),
chemiluminescent immunoassays (CIAs), and multiplex flow immunoassay (MFI)
(Lorenzo Giacani dkk,2014)
V.

ALAT DAN BAHAN

a. Alat
1. Mikropipet ( 25l, 75 l, 200 l, 10 l)
2. Yellow tip atau blue tip
3. Microplate V
4. Timer
b. Bahan
1. Reagen test Cell TPHA
2. Reagent Control Cell TPHA
3. Reagen kontrol Positif (+)

4. Reagen kontrol Negatif (-)

5. Reagen Diluent
c. Sampel
1. Serum atau Plasma
VI.

CARA KERJA
- Uji Kualitatif
1. Disiapkan alat dan bahan
2. Sampel dan reagen diletakkan pada suhu ruang
3. Dihomogenkan reagen yang akan digunakan
4. Buat spesimen diluent, dengan cara :
- Dipipet 190 l diluent, diletakkan pada sumur
- Ditambahkan dengan 10 l spesimen
- Dihomogenkan
5. Tahap Test
- Disiapkan 4 buah sumur, diberi label (test well, control well, kontrol

positif, kontrol negatif)

Dipipet 25 l spesimen diluent, dimasukkan kedalam test well dan control

well
Dipipet 25 l kontrol positif, dimasukkan kedalam sumur yang telah

diberi label (+)

Dipipet 25 l kontrol negatif, dimasukkan kedalam sumur yang telah

diberi label (-)

Ditambahkan 75 l test cell pada test well, kontrol positif dan kontrol

negatif
Ditambahan pada control well 75 l control cell
Diinkubasi campuran tersebut pada suhu 15-30C selama 45-60 menit
Dibaca aglutinasi yang terjadi. Dicatat hasil yang didapatkan

Uji Semi-Kuantitatif
1. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan
2. Dikeluarkan sampel dan reagen yang akan digunakan pada suhu ruang
3. Dihomogenkan reagen yang akan digunakan
4. Buat spesimen diluent, dengan cara:
- Dipipet 190 l diluent, diletakkan pada sumur
- Ditambahkan dengan 10 l spesimen
- Dihomogenkan
5. Tahap Titrasi
- Disiapkan 8 buah sumur, diberi label 1-8
- Dimasukkan 25 l diluet kedalam sumur 2 sampai 8
- Dimasukkan 25 l spesimen diluent kedalam tabung 1 dan 2

Dilakukan pengenceran dengan cara memipet 25 l campuran pada sumur

2 yang sudah dihomogenkan dan dimasukkan ke sumur 3, dihomogenkan,
dari sumur 3 dipipet 25 l dipindahkan ke sumur 4, begitu seterusnya

hingga sumur 8, lalu dibuang 25 l campuran pada sumur 8

6. Tahap Test
- Ditambahkan pada sumur 1 sampai dengan 8 75 l test cell,
VII.

dihomogenkan
Diinkubasi pada suhu 15-30C selama 45-60 menit.
Dibaca aglutinasi yang terbentuk dan tentukan titernya.

INTERPRETASI HASIL
- Uji Kualitatif
Positif
: terjadi hemaglutinasi yang ditandai dengan adanya bulatan
Negatif

berwarna merah di permukaan sumur.

: tidak terjadi hemaglutinasi, yang ditandai dengan terlihatnya titik

berwarna merah ditengah permukaan sumur.

Jika pada uji kualitatif memberiksan hasil yang positif (+) maka harus
dilanjutkan pemeriksaan dengan uji Semi-kuantitatif untuk mengetahui titer
-

antibodi T.pallidum pada spesimen.

Uji Semi-Kuantitatif
Dilihat titer atau pengenceran tertinggi yang masih menunjukkan hasil positif.
SUMUR
TITER

VIII.

1
1:80

2
1:160

3
1:320

4
1:640

5
1:1280

6
1:2560

7
1:5120

8
1:10240

HASIL PENGAMATAN
a. Identitas Sampel
Kode Sampel : TP
Nama
: Mr.X
Jenis Kelamin : Umur
:b. Hasil Pemeriksaan

:Negatif (-) antibodi T.pallidum

Tidak terbentuk hemaglutinasi, namun terbentuk titik
berwarna merah dibagian tengah sumur.

c. Gambar Hasil Pemeriksaan:

- Sampel

Sampel serum probandus

Reagen

Control cell

Tes cell

Control negatif

Diluent

Control positif

Hasil Pengamatan
Campuran
+ test cell

Campuran:
Diluents +
spesimen

Campuran
+ control
cell

Control
positif
Control
negatif

Diketahui hasil pada mikroplate, yaitu :

- Pada test well : Negatif (-) Antibodi T. pallidum
- Pada control well : negatif (-) Antibodi T.pallidum
- Control (+): Positif (+) Antibodi T.pallidum
- Control (-): Negatif (-) Antibodi T.pallidum
IX.

PEMBAHASAN
Sifilis adalah multistage, seksual penyakit menular yang disebabkan oleh obligat
patogen manusia Treponema pallidum subsp. pallidum dan ditandai dengan manifestasi
klinis protean. Berikut proses inokulasi yang terjadi, biasanya di daerah genital,
spirochetes meniru lokal, merangsang respon inflamasi yang menghasilkan khas yaitu
chancre yang menyakitkan pada sifilis primer. Dalam beberapa minggu selama

menyembuhkan chancre akan menunjukkan clearance lokal T. pallidum, dimana

spirochetes telah disebarkan ke berbagai jaringan dan organ. Sifilis sekunder, yang
dihasilkan dari penyebaran hematogen dari organisme, biasanya terjadi enam sampai
delapan minggu setelah infeksi. Tahap ini penyakit yang paling umum melibatkan kulit,
selaput lendir dan kelenjar getah bening namun dapat mempengaruhi hampir setiap
organ termasuk sistem saraf pusat. T. pallidum diduga dibersihkan oleh makrofag
melalui opsonophagocytosis antibodi-mediated. Infeksi yang terkandung tetapi sering
tidak dihilangkan. Spirochetes memiliki kapasitas untuk bertahan selama bertahun-tahun
di situs penyebaran tanpa menyebabkan gejala. Untuk alasan yang tidak jelas, sekitar
sepertiga dari pasien dengan infeksi laten mengembangkan salah satu bentuk yg timbul
penyakit, yang dikenal sebagai sifilis tersier. (Adam C Silver dkk, 2013)
Untuk mengidentifkasi bakteri patogen spirochaeta Treponema pallidum, pada
praktikum

ini

menggunakan

pemeriksaan

TPHA

atau

Treponema

pallidum

Hemagglutination Assay sebagai penguji adanya antibodi yang terdapat dalam spesimen.
Tes TPHA merupakan uji treponemal untuk konfirmasi serologis sifilis, sesuai dengan
algoritma tradisional. Pemahaman sederhana dari hasil serologi tidak mendefinisikan
kondisi fisik pasien. Setiap kombinasi yang mungkin dihasilkan dengan tes ini memiliki
interpretasi yang berbeda dalam kaitannya dengan konteks individu masing-masing
pasien. (Islay Rodriguez dkk,2015)
Meskipun serologi tetap metode diagnostik yang paling umum untuk infeksi
treponema, tak satu pun dari tes serologi yang tersedia mampu membedakan antara agen
penyakit ini. Kemampuan saat ini terbatas untuk metode molekuler yang menargetkan
tanda tangan genetik yang dianggap spesifik untuk setiap subspesies. Kegunaan praktis
dari sebagian besar tes diagnostik lebih rumit oleh kurangnya layanan laboratorium
canggih di daerah di mana treponematoses endemik yang paling umum. (Lorenzo
Giacani dkk,2014)
Dalam pemeriksaan TPHA baik spesimen serum maupun plasma dapat digunakan,
karena tidak akan mempengaruhi hasil dari pemeriksaannya dan spesimen yang
digunakan pada pemeriksaan kali ini berupa serum. Spesimen yang sudah selesai
digunakan dapat disimpan pada suhu 2-8C yang dapat bertahan selama 7 hari (1
minggu) atau -20C yang dapat bertahan dalam jangka waktu yang lebih lama.

Pada pemeriksaan ini, menggunakan 5 jenis reagen Merk Lab 21 HealthCare, United
Kingdom, yang mana setiap reagen memiliki fungsi dan komposisi yang berbeda.
Reagen ini terdiri dari control cell, test cell, control positif (+), control negatif (-), serta
diluent. Berdasarkan komposisinya, diketahui dari kit yang digunakan bahwa test cell
mengandung awetan eritrosit ayam yang dilapisi dengan antigen Treponema pallidum,
control cell mengandung awetan eritrosit ayam yang tidak dilapisi, diluent mengandung
pencair larutan garam yang mengandung penyerap absorbant, kontrol positif (+)
mengandung serum manusia dengan titer 1: 1280, serta kontrol negatif (-) yang
mengandung serum manusia dengan titer <80. Pada bahan kontrol yang berasal dari
serum manusia merupakan serum yang telah diuji ditingkat donor dan menunjukkan
negatif untuk hepatitis B dan C, serta HIV 1 dan 2. Namun, bagaimanapun reagen
kontrol harus diperlakukan seolah-olah mampu menularkan penyakit.
Sebelum melakukan pemeriksaan perlu diperhatikan tanggal kadaluarsa dari kit yang
digunakan, serta mengeluarkan reagen pada suhu ruang. Reagen yang sudah disuhu
ruangkan harus dihomogenkan sebelum digunakan untuk mengoptimalkan fungsi dari
reagen tersebut. Saat mencampurkan reagen dengan sampel maupun sampel yang sudah
diencerkan pastikan untuk menukarkan yellow tip untuk mengurangi kemungkinan
terjadinya kesalahan hasil pemeriksaan akibat terkontaminasinya campuran satu dengan
yang lainnya. Reagen yang telah selesai digunakan harus disimpan pada refrigerator
pada suhu 2-8C dan dipastikan reagen tersimpan pada keadaan tegak lurus serta tidak
dibekukan.
Hasil pemeriksaan TPHA positif ditandai dengan terjadinya hemaglutinasi pada
mikroplate dengan bentuk bulatan seperti pasir berwarna merah pada permukaan sumur,
sedangkan hasil negatif ditandai dengan terdapatnya titik berwarna merah pada bagian
tengah permukaan sumur. Perlu diperhatikan bahwa sumur control serta test tidak boleh
memberikan hasil yang positif, namun bila hemaglutinasi terjadi pada keduanya dalam
pemeriksaan maka perlu dilakukan pembuatan spesimen diluent ulang dengan cara
menginkubasi spesiment diluent sebelumnya selama 30 menit lalu disentrifuge dengan
kecepatan 1500 g selama 3 menit, dan campuran ini yang akan digunakan untuk uji
kualitatif.

Kit ini memiliki sensitifitas 99,5% serta spesifisitas 100% yang menandakan alat ini
memiliki kemampuan untuk mengidentifikasi secara tepat orang yang benar-benar sakit
(sensitifitas) sebesar 99,5%, dan kemampuan untuk mengidentifikasi orang yang benarbenar tidak sakit (spesifisitas) sebesar 100%. Sehingga sangat baik untuk digunakan
sebagai uji screening untuk identifikasi adanya antibodi Treponema pallidum pada
spesimen manusia.
Dari pemeriksaan, diketahui bahwa sampel dengan kode TP negatif antibodi
Treponema pallidum, karena pada uji kualitatif menunjukkan hasil negatif berupa titik
berwarna merah di bagian tengah permukaan sumur pada campuran spesimen diluent
dengan control cell dan test cell. Sedangkan pada campuran test cell dengan kontrol
positif (+) dan kontrol negatif (-) memberikan hasil yang sesuai yakni pada kontrol
positif (+) memberikan hasil yang positif antibodi Treponema pallidum sedangkan pada
kontrol negatif memberikan hasil yang negatif antibodi Treponema pallidum. Reagen
kontrol ini berfungsi untuk melihat apakah reagen yang digunakan masih dalam kondisi
yang baik sehingga akan memberikan hasil yang lebih akurat serta mengurangi
kemungkinan terjadinya kesalahan hasil pemeriksaan. Pemeriksaan tidak dilanjutkan ke
uji semi-kuantitatif dikarenakan hasil negatif pada uji kualitatif.
X.

SIMPULAN
TPHA atau Treponema pallidum Hemagglutination Assay merupakan suatu uji
serologi yang digunakan untuk mengidentifikasi adanya antibosi T.pallidum pada
spesimen manusia. Berdasarkan hasil pemeriksaan TPHA (Treponema pallidum
Hemagglutination Assay) pada sampel serum TP didapatkan hasil negatif antibodi
Treponema pallidum.

XI.

DAFTAR PUSTAKA
Enders,Martin.2015. Performance Evaluation of the Elecsys Syphilis Assay for the
Detection

of

Total

Antibodies

to

Treponema

pallidum.

[online].tersedia:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4278932/.
[diakses:16 September 2016; 18:22]
Giacani,Lorenzo dkk.2014. The Endemic

Treponematoses.[online].tersedia:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3910905/.[diakses:16
September 2016; 18:22]

Houson, Simon dkk.2015. Conservation of the Host-Interacting Proteins Tp0750 and

Pallilysin among Treponemes and Restriction of Proteolytic Capacity
toTreponemapallidum.
[online].tersedia:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4598410/.
[diakses:16September 2016;18:38]
Houston,Simon dkk.2012. Activation and Proteolytic Activity of the Treponema
pallidum

Metalloprotease,

Pallilysin.[online].tersedia:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3406077/.[diakses:16
September 2016; 18:22]
Ho, Emily L dkk.2011.[online]. Syphilis: using modern approaches to understand an
oldDisease.
[online].tersedia:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3225993/.
[diakses:16 September 2016; 18:22]
Ke,Wujian dkk.2015. Treponema pallidum subsp. pallidum TP0136 Protein Is
Heterogeneous among Isolates and Binds Cellular and Plasma Fibronectin via
itsNH2

Terminal

End.[online].tersedia:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4368718/.
[diakses:16september 2016;18:34]
Majs,David.2012. Genetic diversity in Treponema pallidum: implications for
pathogenesis, evolution and molecular diagnostics of syphilis and yaws.
[online].tersedia:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3786143/.
[diakses:16 september 2016;18:30]
Rodriguez,Islay dkk.2015.Considerations on the use and interpretation of Treponema
pallidum hemagglutination test for diagnosis of syphilis.[online].tersedia:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4660574/.[diakses:16
September 2016; 18:22]
Silver,Adam C dkk.2013. MyD88

Deficiency

Markedly

Worsens

Tissue

Inflammation and Bacterial Clearance in Mice Infected with Treponema

pallidum,

the

Agent

ofSyphilis.

[oline].tersedia:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3734110/.
[diakses:16 September 2016; 18:22]