PENENTUAN KADAR PROTEIN DENGAN METODE BIURET

2016

I. JUDUL PERCOBAAAN

:PENENTUAN KADAR PROTEIN

DENGAN METODE BIURET
II. HARI/ TANGGAL PERCOBAAN:
Mulai

: Kamis, 13 Oktober 2016 pukul 09.00 WIB

Selesai

: Kamis, 13 Oktober 2016 pukul 11.30 WIB

III. TUJUAN

: Menentukan kadar protein yang ada pada

sampel (ikan gurami)dengan menggunakan
cara biuret

IV. DASAR TEORI

:
Protein merupakan suatu zat makanan yang amat penting bagi tubuh,
karena zat ini di samping berfungsi sebagai bahan bakar dalam tubuh juga
berfungsi sebagai zat pembangun dan pengatur (Winarno, 1992). Protein adalah
senyawa organic kompleks yang mengandung asam amino yang terikat satu sama
lain melalui ikatan peptide. Protein mengandung atom karbon, oksigen, nitrogen,
dan sulfur. Kandungan protein dalam bahan pangan bervariasi, baik dalam
jumlah maupun jenisnya. Bahan pangan hewani, leguminose, dan serealia
umumnya mengandung protein yang tinggi (Kusnandar, 2010). Meskipun
kandungan protein dalam jaringan tanaman kurang dari 1% dari berat bahan
segar, namun mempunyai peranan penting yaitu sebagai unsur structural
membrane sel dan sebagai biokatalisator (Tranggono, et al., tanpa tahun)
Protein merupakan suatu polipeptida yang sangat mudah mengalami
perubahan fisis dan aktivitas biologisnya. Hidrolisis protein menghasilkan
asam- asam amino.

PENENTUAN KADAR PROTEIN DENGAN METODE BIURET

2016

Pada dasarnya suatu peptida adalah asil-asam amino, karena gugus

COOH dan NH2 membentuk ikatan peptida. Peptida didapatkan dari hidrolisis
protein yang tidak sempurna. Apabila peptida yang dihasilkan dihidrolisis lebih
lanjut akan dihasilkan asam-asam amino(Poedjadi, 2006).
Sifat peptida ditentukan oleh gugus COOH, NH 2 dan gugus R. Sifat
asam dan basa pada peptida ditentukan oleh gugus COOH dan NH 2 , namun
pada rantai panjang gugus COOH dan NH 2 yang terletak diujung rantai tidak
lagi berpengaruh. Suatu peptida juga mempunyai titik isolistrik seperti pada asam
amino. Reaksi biuret merupakan reaksi warna untuk peptida dan protein.
(Poedjadi, 2006).
Protein merupakan salah satu makromolekul yang penting dalam bahan
pangan. Oleh karena itu, disamping perlu memahami struktur protein dan
peranannya dalam produk pangan, baik sebagai sumber gizi maupun karena sifat
fungsionalnya,

maka

perlu

diketahui

juga

bagaimana

cara

penetapan

(analisisnya). Analisis protein penting untuk keperluan perbaikan gizi ,

mengetahui sifat fungsional dan penentuan sifat biologis protein. Analisis protein
juga perlu dilakukan untuk mengetahui kandungan total protein dari suatu bahan
pangan, jumlah protein tertentu dalam suatu campuran, kandungan protein hasil
dari suatu isolasi dan purifikasi protein, kandungan non-protein nitrogen,
kompisisi asam amino dan nilai gizi protein (Andarwulan, 2011).
Protein dapat mengalami perubahan- perubahan yang disebabkan oleh
beberapa hal sebagai berikut:
1. Dapat terdenaturasi yang disebabkan oleh perlakuan pemanasan. Pada
umumnya protein akan terdenaturasi karena adanya kondisi ekstrim.
2. Dapat terkoagulasi atau membentuk endapan yang disebabkan oleh adanya
perlakuan pengasaman.
3.

Dapat mengalami dekomposisi atau pemecahan oleh enzim- enzim

proteolitik.
4. Dapat bereaksi dengan gula reduksi. Reaksi tersebut akan menimbulkan
terbentuknya warna cokelat.
2

PENENTUAN KADAR PROTEIN DENGAN METODE BIURET

2016

Berdasarkan kelarutannya :
a) Protein fibrosa : tidak larut dalam pelarut biasa namun larut dalam asam
dan basa.
b) Protein globular : larut dalam air, larutan asam, basa, bahkan garam.
Berdasarkan komplekan strukturnya :
a) Protein sederhana : hidrolisisnya menghasilkan asam amino. contoh :
albumin, globular.
b) Protein konjugasi : memilik gugus bukan protein yaitu gugus prostetik.
Contoh : neuro protein, kromoprotein.
Sumber Protein
Bahan makanan hewani merupakan sumber protein yang baik, dalam
jumlah maupun mutu, seperti telur, susu, daging, unggas, ikan, dan kerang.
Sumber protein nabati adalah kacang kedelai dan hasilnya, seperti tempe dan
tahu, serta kacang-kacangan lain. Kacang kedelai merupakan sumber protein
nabati yang mempunyai mutu atau nilai biologi tertinggi. Bahan makanan
nabati yang kaya akan protein adalah kacang-kacangan.
Analisis protein cukup kompleks disebabkan terdapat komponenkomponen pangan lain yang memiliki sifat fisika-kimia yang mirip yang dapat
memengaruhi pengukuran. Sebagai gambaran, nitrogen bukan hanya terdapat
pada protein, tetapi juga pada komponen non-protein, seperti asam amino bebas,
peptida berukuran kecil, asam nukleat, fosfolipid, gula amin, porfirin, dan
beberapa vitamin, alkaloid, asam urat, urea, dan ion amonium. Dengan demikian,
total nitrogen organik dari bahan pangan bukan hanya berasal dari protein, tetapi
juga

ada

sebagian

kecil

dari

komponen-komponen

non-protein

yang

mengandung nitrogen yang ikut terukur. Tergantung pada metode analisis yang
digunakan, komponen pangan lainnya, seperti lipid dan karbohidrat, dapat
memengaruhi hasil analisis pangan (Andarwulan, 2011).
Terdapat banyak metode analisis penetapan protein yang telah
dikembangkan. Prinsip dasar dari penetapan protein ini berbeda-beda. Ada
penetapan protein yang berdasarkan pada pengukuran kadar nitrogen total, ikatan
peptide, asam amino aromatik, kapasitas pengikatan zat warna, sifat absorpsi

PENENTUAN KADAR PROTEIN DENGAN METODE BIURET

2016

sinar ultraviolet oleh protein dan sifat light scattering. Di dalam memilih metode
analisis mana yang akan digunakan, perlu mempertimbangkan jenis contoh yang
akan dianalisis, tujuan analisis, faktor sensitivitas, akurasi, ketelitian, kecepatan
dan biaya analisis. Disamping itu, terdapat prosedur analisis untuk penetapan
sifat fungsional protein, seperti mengukur kemampuan protein dalam mengikat
air, membentuk gel, mengikat lemak sebagai emulsifier, membentuk buih, dan
sebagainya (Andarwulan, 2011).
Kadar protein bahan dan produk pangan dapat ditentukan dengan
berbagai jenis metode analisis. Diantara metode analisis protein yang sering
digunakan adalah metode Kjeldahl, metode Biuret, metode Lowry, metode
pengikatan zat warna dan metode titrasi formol (Andarwulan, 2011).
Penentuan Kadar Protein Metode Biuret
Prinsip kerja penentuan kadar protein dengan metode biuret adalah
menganalisis adanya ikatan peptida dengan cara menambahkan reagen biuret
kedalam sample yang kemudian di ukur absorbansinya menggunakan
spektrofotometer.
Spektorofotometri merupakan teknik analisis yang bertujuan untuk
mengetahu jumlah (konsentrasi) zat dalam suatu bahan berdasarkan spektroskopi
khusus untuk panjang gelombang UV Visible dan Infra Red. Pengertian
spektroskopi sendiri adalah istilah atau nama yang digunakan untuk ilmu (secara
teori) yang mempelajari tentang hubungan antara radiasi/ sinar/ energy (yang
memiliki fungsi panjang gelombang yang biasa disebut dengan frekuensi)
dengan benda(Sudarmajdi, Haryono, & Suhardi, 1996).
Spektrofotometri merupakan suatu metoda analisa yang didasarkan pada
pengukuran serapan sinar monokromatis oleh suatu lajur larutan berwarna pada
panjang gelombamg spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau
kisi difraksi dengan detektor fototube. Metode ini dapat digunakan untuk sampel
yang berupa larutan berwarna atau tidak berwarna, karena pada umumnya suatu
alat spektrofotometri dilengkapi sumber cahaya untuk mengukur spectrum

PENENTUAN KADAR PROTEIN DENGAN METODE BIURET

2016

panjang gelombang pada daerah tertentu(Sudarmajdi, Haryono, & Suhardi,

1996).
Metode Biuret merupakan salah satu cara yang terbaik untuk menentukan
kadar protein suatu larutan. Dalam larutan basa, Cu2+ akan membentuk
kompleks dengan ikatan peptida suatu protein, sehingga menghasilkan warna
ungu yang dapat didentifikasi dengan spektrofotometer pada panjang gelombang
540 nm. Absorbansi ini berbanding langsung dengan kosentrasi protein dan tidak
tergantung jenis protein karena seluruh protein pada dasarnya mempunyai
jumlah ikatan peptida yang sama persatuan berat(Biokimia, 2016).
Metode penentuan kadar protein dengan menggunakan pereaksi biuret
hampir sama dengan penentuan kadar protein dengan metode lowry, sama-sama
menggunakan CuSO4 hanya saja reagennya berbeda. Pada lowry harus
ditambahkan asam fosfomolibdat dan asam fosfotungstat yang akan direduksi
oleh tiroksin dan triptofan yang membentuk warna biru dengan absorbansi 650
nm. Namun lowry mempunyai kelamahan yang sangat fatal. Kelemahannya
terletak pada tiroksin dan triptofan yang menjadi dasar untuk menentukan
kandungan protein pada makanan, namun pada dasarnya triptofan dan tiroksin
bisa tidak sesuai dengan kadungan protein yang ada pada beberapa jenis produk
pangan dan mengacaukan hasil akhir.
Reagen Biuret dibuat dari KOH/NaOH dan tembaga(II) sulfat hidrat,
bersama dengan kalium natrium tartrat. Kalium natrium tartrat ditambahkan
untuk kompleks dan menyetabilkan ion kupri. Reagen berubah dari biru ke
ungu dengan adanya protein, biru ke merah jambu (pink) ketika bergabung
dengan polipeptida rantai-pendek. Reaksi antara protein dan reagen biuret:

PENENTUAN KADAR PROTEIN DENGAN METODE BIURET

2016

Ikan Gurami
Ikan gurami memiliki nama latin (Osphronemus gourami) mempunyai
bentuk gepeng, yang muda bersikap agresif, tetapi sifat ini akan berkurang sejalan
dengan umur gurami. Ikan gurami muda berdahi normal dan rata, semakin dewasa
dahi semakin tebal dan kelihatan menonjol.
Adapun komposisi kimia daging ikan gurami pada berbagai umur panen,n=2:
Komposisi kimia

Daging ikan umur

Daging ikan umur

Daging ikan umur

rata-rata (%)
2,5-3 tahun
1,5-2 tahun
7 bulan-1 tahun
Kadar air
72,96 0,05
74,62 0,08
75,48 0,28
Kadar abu
0,90 0,01
0,95 0,05
1,03 0,08
Kadar protein
20,67 0,28
18,93 0,01
18,71 0,13
Kadar lemak
2,79 0,04
2,43 0,08
2,21 0,42
Tabel 1. Komposisi kimia daging ikan gurami pada berbagai umur panen,n=2
Ikan gurami memiliki kandungan protein, kandungan protein larut air
berkisar 2,74-3,13%,

dapat diketahui bahwa kadar protein larut air tertinggi

terhadap ikan gurami umur 1,5-2 tahun yaitu 3,13% dan yang terendah pada ikan
gurami umur 2,5-3 tahun yaitu 2,74% kandungan protein larut air pada berbagai
umur panen memiliki gurami yang cenderung seragam walaupun terdapat gurami
yang paling tinggi maupun yang rendah. Hal ini disebabkan karena ikan tersebut
memiliki habitat atau lingkungan hidup yang sama dan kondisi fisiologis yang
sama, yaitu di kolam budidaya.
Kandugan protein larut garam ikan gurami pada beberapa umur panen
berkisar 4,57-5,27%. Berdasarkan kadar protein larut garam tertinggi terdapat pada
ikan gurami umur 2,5-3 tahun dengan gurami 5,27% dan yang terendah pad ikan
gurami umur1,5-2 tahun dengan gurami 4,57%, komposisi proteinlarut garam
dengan beberapa umur panen memilki gurami yang cenderung seragam (Tim
Penyusun Modul Penyuluhan Perikanan, 2011).

V.

ALAT DAN BAHAN

Alat-alat
6

PENENTUAN KADAR PROTEIN DENGAN METODE BIURET

a.
b.
c.
d.
e.
f.

Tabung reaksi
Gelas ukur
Pipet tetes
Gelas kimia
Spektrofotometri UV-Vis
Rak tabung reaksi

9 buah
1 buah
secukupnya
2 buah
1 set
1 buah

Bahan-bahan
a.
b.
c.
d.

Sampel protein (ikan gurami)

Larutan standart protein
Reagen biuret
Aquades

VI. ALUR PERCOBAAN

a.Persiapan sampel
1 gr sampel ikan gurami
Dilarutkan dalam 10 mL aquades
Diambil 1 mL
Diencerkan dengan aquades
Disaring dan disentrifuge
Filtral
(sampel)

Residu

b. Pembuatan standart

2016

PENENTUAN KADAR PROTEIN DENGAN METODE BIURET

1 mL
larutan
protein
1mg/ml

1 mL larutan
protein
1mg/ml

1 mL larutan
protein
1mg/ml

2016

1 mL larutan
protein
1mg/ml

1 mL larutan
protein
1mg/ml

Dimasukkan dalam tabung reaksi yang

berbeda
Ditambah 5 mL reagen biuret
Diinkubasi pada suhu 37oC selama 10
menit
Didiamkan pada suhu kamar selama 30
menit hingga terbentuk warna ungu
stabil
Diukur absorbansinya dengan
spektrofotometri UV-Vis pada panjang
gelombang 540 nm
Hasil pengamatan
c. Penetapan absorbansi larutan blanko
1 mL aquades
Dimasukkan dalam tabung reaksi
Ditambah 5 mL reagen biuret
Dikocok
Diunkubasi pada suhu 37oC selama 10 menit
Didiamkan pada suhu kamar selama 3 menit
Diukur absorbansinya pada panjang gelombang
540 nm
Hasil pengamatan

d. Penetaan absorbansi larutan sampel protein

PENENTUAN KADAR PROTEIN DENGAN METODE BIURET

1 mL larutan sampel
Dimasukkan dalam tabung reaksi
Ditambah 5 mL reagen biuret
Dikocok
Diunkubasi pada suhu 37oC selama 10 menit
Didiamkan pada suhu kamar selama 3 menit
Diukur absorbansinya pada panjang gelombang
540 nm
Hasil pengamatan

2016

PENENTUAN KADAR PROTEIN DENGAN METODE BIURET

VII.

HASIL PENGAMATAN

10

2016

PENENTUAN KADAR PROTEIN DENGAN METODE BIURET

VIII.

IX.
X.

2016

ANALISIS PEMBAHASAN
Pada percobaan yang berjudul Penentuan Kadar Protein dengan Metode
Biuret yang bertujuan untuk
KESIMPULAN
JAWABAN PERTANYAAN
Tugas
1. Buatlah kurva standar konsentrasi vs absorbansi. Dengan bantuan kurva
standar tersebut tentukan kadar protein sampel?
2. Apakah peptide akan memberikan reaksi positif terhadap pereaksi biuret?
Jika benar demikian, bagaimana menentukan kadar protein yang tercampur
dengan peptide?
Jawab:

XI.

DAFTAR PUSTAKA

Andarwulan, N. (2011). Analisis Pangan. Jakarta: Dian Rakyat.

Biokimia, T. D. (2016). Penuntun Praktikum Biokimia. Surabaya: UNESA Press.
Kusnandar, F. (2010). Kimia Pangan Komponen Makro. Jakarta: Dian Rakyat.
Poedjadi, A. (2006). Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta: UI-Press.
Sudarmajdi, S., Haryono, B., & Suhardi. (1996). Analisa Bahan Makanan dan
Pertanian. Yogyakarta: Liberty.
Tim Penyusun Modul Penyuluhan Perikanan, . (2011). Pengelolaan Ikan Gurami.
Jakarta: Sekolah Tinggi Perikanan.
Tranggono, Setiaji, B., Suhardi, Sudarmanto, Y., Marsono, Agnes, M., et al. (tanpa
tahun). Biokimia Pangan. Yogyakarta: Pusat Antar Universitas Pangan dan
Gizi Universitas Gajah Mada.
Winarno, F. G. (1992). Kimia Pangan dan Gizi . Jakarta: PT Gramedia Pustaka
Utama.
LAMPIRAN

11

PENENTUAN KADAR PROTEIN DENGAN METODE BIURET

2016

PERHITUNGAN KADAR PROTEIN DALAM IKAN GURAMI

Pengenceran larutan standar dengan labu ukur 10 mL
1. V1M1

2.

3.

4.

5.

10 mg/mL . V1
V1
V1M1
4 mg/mL . V1
V1
V1M1
4 mg/mL . V1
V1
V1M1
3 mg/mL . V1
V1
V1M1
2 mg/mL . V1
V1

= V2M2
= 5 mg/mL . 10 mL
= 5 mL
= V2M2
= 5 mg/mL . 10 mL
= 8 mL
= V2M2
= 3 mg/mL . 10 mL
= 7,5 mL
= V2M2
= 2 mg/mL . 10 mL
= 6,6 mL
= V2M2
= 1 mg/mL . 10 mL
= 5 Ml

Perolehan hasil dari uji spektrofotometri, hubungan antara konsentrasi dengan

absorbansi:
Konsentrasi (mg/mL)

Absorbansi

0,107

0,142

0,159

0,194

0,257

Grafik hubungan konsentrsi (mg/mL) dengan konsentrasi:

12

PENENTUAN KADAR PROTEIN DENGAN METODE BIURET

2016

Dengan :
Sampel

Absorbansi

0,270

0,276

0,264

Maka,
Sampel 1

Sampel 2

Sampel 3

= 0,035x + 0,066

= 0,035x + 0,066

0,270

= 0,035x + 0,066

0,276 = 0,035x + 0,066

0,264

= 0,035x + 0,066

0,035x = 0,204

0,035x= 0,210

0,035x = 0,198

x = 6,000 mg/mL

= 5,828 mg/mL

= 0,035x + 0,066

Rata-rata konsentrasi protein dalam sampel ikan gurami :

Kadar protein dalam ikan gurami:

13

= 5,657 mg/mL

PENENTUAN KADAR PROTEIN DENGAN METODE BIURET

14

2016