A.

JUDUL PERCOBAAN : Penentuan Kadar Protein dengan Metode

Biuret pasa Ikan Mujair
B. TANGGAL PERCOBAAN : Rabu, 26 September 2018. Pukul 13.00-
14.55
C. TUJUAN PERCOBAAN : Menentukan kadar protein yang ada
padasampel dengan menggunakan cara Biuret
D. DASAR TEORI
Protein
Protein adalah makromolekul yang tersusun dari bahan dasar asam
amino. Protein terdapat dalam sistem hidup semua organisme baik yang
berada pada tingkat rendah maupun tingkat tinggi.protei berasal dari kata
„protos‟ atau proteos yang berarti pertama atau utama. Protein merupakan
komponen penting atau komponen utama sel hewan maupun sel manusia.
Oleh karena itu, sel merupakan pembentuk tubuh, maka protein yang
terdapat dalam makanan berfungsi sebagai zat utama dalam pembentukan
dan pertumbuhan tubuh (Poedjiadi, 2006).

Protein adalah senyawa organik kompleks berbobot molekul tinggi

yang merupakan polimer dari monomer-monomer asam amino yang
dihubungkan satu sama lain dengan ikatan peptida. Sebagai salah satu
sumber gizi, protein berperan sebagai sumber asam amino bagi organisme
yang tidak mampu membentuk asam amino tersebut (heterotrof)
(Fessenden. 1986).
 Protein adalah suatu zat dalam susunan kimianya mengandung
unsure-unsur oksigen, karbon, hydrogen, nitrogen dan kadang-kadang
mengandung unsure-unsur lain seperti sulfur dan fosfor (Girindra, A.
1986).
Protein merupakan suatu polipeptida dengan BM yang sangat
bervariasi dari 5000 sampai lebih dari satu juta karena molekul protein
yang besar, protein sangat mudah mengalami perubahan fisis dan aktivitas
biologisnya. Banyak agensia yang menyebabkan perubahan sifat alamiah
dari protein seperti panas, asam, basa, solven organik, garam, logam berat,
radiasi sinar radioaktif (Sudarmadji, 1996).
Protein berfungsi sebagai katalisator, sebagai pengangkut dan
penyimpan molekul lain seperti oksigen, mendukung secara mekanis
system kekebalan (imunitas) tubuh, menghasilkan pergerakan tubuh,
sebagai transmitor gerakan syaraf dan mengendalikan pertumbuhan dan
perkembangan. Analisa elementer protein menghasilkan unsur-unsur C, H,
N dan O dan sering juga S (Maharani,2010).
Ditinjau dari strukturnya, protein dapat dibagi menjadi 2 golongan
yaitu :
1. Protein Sederhana
Protein sederhana yang hanya terdiri atas molekul-molekul asam
amino.
2. Protein Gabungan
Protein yang terdiri atas protein dan gugus bukan protein. Gugus ini
disebut gugus prostetik dan terdiri dari karbohidrat, lipid, atau asam
nukleat.

Ditinjau berdasarkan bentuk molekul dibagi menjadi 2 golongan yaitu :

1. Protein Fiber
Protein fiber terdiri atas beberapa rantai polipeptida yang memanjang
dan dihubungkan satu sama lain oleh ikatan silang hingga membentuk
serat. Protein fiber bersifat tidak larut didalam air.

2
2. Protein Globular
Umumnya protein yang mempunyai rantai-rantai popipeptida
berlipat rapat-rapat menjadi bentuk globular atau bulat padat
berbentuk bulat atau elips. Protein ini biasanya larut dalam airyang
segera berdifusi, hampir semua mempunyai fungsi gerak dan dinamik.
Hampir semua enzim merupakan protein globular (Lehninger, 1982).

Sifat-Sifat Protein :
1. Sukar larut dalam air karena ukuran molekulnya yang sangat besar
2. Dapat mengalami koagulasi oleh pemanasan dan penambahan asam
atau basa.
3. Bersifat atmosfer karena membentuk ion zwitter. Pada titik
isoelektrik, protein mengalami koaguasi sehingga dapat terpisah
dengan pelarutnya.
4. Dapat mengalami kerusakan (terdenaturasi) akibat pemanasan. Pada
denaturasi, protein mengalami kerusakan mulai dari struktur tersier
hingga primer.

Ada 20 jenis asam amino yang terdapat dalam molekul protein.

Asam-asam amino ini terikat satu sama lain dengan ikatan peptida. Ikatan
yang terjadi antara dua dua asam amino tersebut dinamakan ikatan peptida.
Jadi, pada satu molekul dipeptida terdapat satu ikatan peptida. Suatu
senyawa yang terdiri atas tiga buah asam amino yang berikatan disebut
tripeptida. Pada satu molekul tripeptida ini terdapat dua buah ikatan
peptida. Ikatan peptida yaitu :

Melalui suatu proses tertetu, sejumlah besar molekul asam amino

dapat membentuksuatu senyawa yang memiliki banyak ikatan peptida.
Molekul senyawa ini merupakan suatu molekul besar atau makromolekul
yang terdiri atas banyak molekul asam amino dan karenanya disebut

3
polipeptida. Protein adalah salah satu makromolekul yang terdiri atas
sejumlah besar asam amin (Poedjiadi, 2006).

Struktur protein tidak stabil karena mudah mengalami denaturasi

yaitu keadaan dimana protein terurai menjadi struktur primernya, baik
reversibel maupun ireversibel. Faktor-faktor yang menyebabkan denaturasi
adalah pH, panas, pelarut, kekuatan ion, terlarut, dan radiasi. Protein ada
yang reaktif karena asam amino penyusunnya mengandung gugus fungsi
yang reaktif, seperti SH, -OH, NH2, dan –COOH. Kelarutan protein di
dalam suatu cairan, sesungguhnya sangat dipengaruhi oleh beberapa faktor
antara lain, pH, suhu, kekuatan ionik dan konstanta dielektrik pelarutnya.
Protein seperti asam amino bebas memiliki titik isoelektrik yang berbeda-
beda. Titik Isoelektrik (TI) adalah daerah pH tertentu dimana protein tidak
mempunyai selisih muatan atau jumlah muatan positif dan negatifnya
sama, sehingga tidak bergerak ketika diletakkan dalam medan listrik. Pada
pH isoelektrik (pI), suatu protein sangat mudah diendapkan karena pada
saat itu muatan listriknya nol ( Hawab,2004).

Metode Biuret
Suatu peptida yang mempunyai dua ikatan peptida atau lebih dapat
bereaksi dengan ion Cu+ dalam suasana basa dan membentuk suatu
senyawa kompleks yang berwarna biru ungu. Reaksi ini dikenal dengan
nama reaksi biuret (Poedjiadi, 2006).
Menurut Lehninger (1982), Uji Biuret adalah salah satu cara
pengujian yang memberikan hasil positif ada senyawa-senyawa yang
memiliki ikatan peptida. Pengujiannya dapat dilakukan dengan cara
larutan yang mengandung protein ditetesi larutan NaOH, kemudian diberi
beberapa tetes larutan CuSO4 encer. Terbentuknya warna ungu,
menunjukkan hasil positif adanya protein.
Metode biuret merupakan salah satu cara terbaik untuk
menentukan kadar protein dalam suatu larutan. Dalam larutan basa Cu2+
membentuk kompleks dengan ikatan peptida suatu protein sehingga
menghasilkan warna ungu dengan absorbansi maksimal pada 540 nm.

4
 Ansorbansi ini berbanding lurus dengan konsentrasi protein dan tidak
tergatung jenis protein, karena seluruh protein pada dasarnya mempunyai
jumlah ikatan peptida yang sama persatuan berat (Tim Praktikum
Biokimia, 2017).
Protein yang terukur pada metode biuret adalah protein yang larut
air (protein terlarut), karena yang diukur adalah jumlah ikatan peptida
dalam protein, maka tidak dapat mendeteksi nitrogen dari senyawa non
peptida sehingga yang terukur adalah protein sesungguhnya.

 Kelebihan :
1. Murah
2. Cepat (30 menit)
3. Penyimpangan warna jarang ditemukan dibandingkan dengan
metode lain.
4. Sangat sedikit substansi lain yang terdeteksi
5. N dari non peptide dan non peptide tidak terdeteksi

 Kelemahan
1. Kurang sensitif dibandingkan lowry
2. Penyerapan warna dapat dipengaruhi oleh pigmen bila ada
3. Konsentrasi tinggi dari garam ammonium dapat menimbulkan
reaksi
4. Terjadi variasi warna pada jenis protein yang berbeda, kurang
sensitif terhadap jenis protein karena absorpsi yang terjadi
melibatkan ikatan peptida yang ada di semua protein, bukan pada
gugus samping spesifik.
5. Penyimpangan warna dapat terjadi pada larutan bila terdapat
kadar lemak dan karbohidrat yang tinggi

Spektrofotometri
Spektrofotometri yaitu metode analisis pengukuran kualitatif dan
kuantitatif dalam menentukan dan menetapkan nilai absorbansi suatu

5
senyawa. Spektrofotometri sesuai dengan namanya adalah alat yang terdiri
dari spektrometer dan fotometer. Spektrofotometer menghasilkan sinar dari
spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer adalah alat
pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau diabsorbsi. Jadi
spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi relatif jika energi
tersebut ditransmisikan, direfleksikan atau diemisikan sebagai fungsi
panjang gelombang. Kelebihan spektrofotometer dengan fotometer adalah
panjang gelombang dari sinar putih dapat lebih di deteksi dan cara ini
diperoleh dengan alat pengurai seperti prisma, grating atau celah optis.
Pada fotometer filter dari berbagai warna yang mempunyai spesifikasi
melewatkan trayek pada panjang gelombang tertentu (Gandjar, 2007).
Spektrum elektromagnetik dibagi dalam beberapa daerah cahaya.
Suatu daerah akan diabsorbsi oleh atom atau molekul dan panjang
gelombang cahaya yang diabsorbsi dapat menunjukan struktur senyawa
yang diteliti. Spektrum elektromagnetik meliputi suatu daerah panjang
gelombang yang luas dari sinar gamma gelombang pendek berenergi
tinggi sampai pada panjang gelombang mikro (Marzuki, Asnah, 2012).
Spektrum absorbsi dalam daerah-daerah ultra ungu dan sinar tampak
umumnya terdiri dari satu atau beberapa pita absorbsi yang lebar, semua
molekul menyerap radiasi dalam daerah UV-tampak. Oleh karena itu
mereka mengandung electron, baik yang dipakai bersama atau tidak, yang
dapat dieksitasi ke tingkat yang lebih tinggi. Panjang gelombang pada
waktu absorbsi terjadi tergantung pada bagaimana erat elektron terikat di
dalam molekul. Elektron dalam satu ikatan kovalen tunggal erat ikatannya
dan radiasi dengan energy tinggi, atau panjang gelombang pendek,
diperlukan eksitasinya (Wunas, 2011).
Keuntungan utama metode spektrofotometri adalah bahwa metode ini
memberikan cara sederhana untuk menetapkan kuantitas zat yang sangat
kecil. Selain itu, hasil yang diperoleh cukup akurat, dimana angka yang
terbaca langsung dicatat oleh detector dan tercetak dalam bentuk angka
digital ataupun grafik yang sudah diregresikan (Yahya S, 2013). Secara

6
sederhana instrument spektrofotometeri yang disebut spektrofotometer
terdiri dari :
Sumber cahaya – monokromatis – sel sampel – detector- read out

Gambar 5. Pembacaan Spektrofotometer UV-VIS

Cahaya yang diserap diukur sebagai absorbansi (A) sedangkan
cahaya yang hamburkan diukur sebagai transmitansi (T), dinyatakan
dengan hukum lambert-beer atau Hukum Beer, berbunyi: “Jumlah radiasi
cahaya tampak (ultraviolet, inframerah dan sebagainya) yang diserap atau
ditransmisikan oleh suatu larutan merupakan suatu fungsi eksponen dari
konsentrasi zat dan tebal larutan”.
Berdasarkan hukum Lambert-Beer, rumus yang digunakan untuk
menghitung banyaknya cahaya yang hamburkan:
atau

dan absorbansi dinyatakan dengan rumus:

A= - log T = -log

dimana I0 merupakan intensitas cahaya datang dan It atau I1 adalah

intensitas cahaya setelah melewati sampel.
Rumus yang diturunkan dari Hukum Beer dapat ditulis sebagai:
A= a . b . c atau A = ε . b . c
dimana:
A = absorbansi
b / l = tebal larutan (tebal kuvet diperhitungkan juga umumnya 1 cm)

7
 c = konsentrasi larutan yang diukur
ε = tetapan absorptivitas molar
a = tetapan absorptivitas

Ikan Mujair
Ikan mujair nila adalah merupakan salah satu jenis ikan yang kaya akan
manfaat, memperlancar proses metabolism dari karbohidrat, protein dari
lemak, mencegah terjadinya insomnia, mencegah kram dan kejang otot,
mengurangi terjadinya gangguan emosi, meningkatkan daya tahan dan
imunitas tubuh. Hasil penelitian menunjukkan besar kandungan gizi dari
ikan mujair (Syahril, 2016).
Kandungan Zat Gizi Ikan Mujair Segar
Energy 89 kal Karbohidrat 0 g
Protein 18,7 g Kalsium 96 mg
Lemak 1 g Fosfor 29 mg
BDD 80% Vitamin C 0 mg
Air 79,7 mL Vitamin A 6 RE
Sumber : Direktorat Gizi Departemen Kesehatan RI 2004

Klasifikasi ikan mujair sebagai berikut:

Kingdom : Animalia

8
 Filum : Chordata
Kelas : Actinopterygii
Ordo : Perciformes
Famili : Cichlidae
Genus : Oreochromis
Spesies : Oreochromis mossambicus.

Ikan mujair dibedakan menjadi beberapa jenis, antara lain mujair biasa,
mujair merah dan mujair albino. Berdasarkan warna sisik, ikan ini dapat
dibedakan ke dalam lima varitas, yaitu mujair dengan warna sisik abu-abu,
abuabu bercak putih, putih, hitam dan merah.

Ikan Mujair merupakan jenis ikan konsumsi air tawar, bentuk badan pipih
dengan warna abu-abu, coklat atau hitam. Mujair memiliki bentuk badan
yang pipih dan memanjang, bersisik kecil-kecil bertipe stenoid, tubuh
memiliki garis vertikal, sirip ekor memiliki garis berwarna merah. Warna
ikan ini tergantung pada lingkungan atau habitat yang di huni.

E. ALAT DAN BAHAN

Alat :
 Gelas Kimia 1 buah
 Labu Ukur 10 mL 1 buah
 Spatula 1 buah
 Mortal 1 buah
 Alu 1 buah
 Pipet Tetes Secukupnya
 Gelas Ukur 10 mL 1 buah
 Tabung reaksi 12 buah
 Spektroskopi UV-VIS 1 set
 Waterbath 1 set

9
 Bahan :
 Larutan standart protein 2mg 5 mL
 Reagen biuret 40 mL
 Ikan Mujair 1 gram
 Aquades Secukupnya

F. ALUR PERCOBAAN
1. Persiapan Sampel

Sampel (Ikan Mujair)

- Ditimbang 1 gram
- Dihancurkan dengan mortal alu
- Ditambah aquades 10 mL samapi
larut
- Disentrifuge dengan kecepatan
3500 rpm selama 10 menit
- Didekantasi
Larutan Protein Sampel

Filtrat Residu

Sampel

10
 2. Pembuatan Standart

1 mL lar. 1 mL lar. 1 mL lar. 1 mL lar. 1 mL lar.

protein dg protein dg protein dg protein dengan protein dengan
kadar 1mg kadar 2mg kadar 3 mg kadar 4mg kadar 5 mg

- Ditambah 5 mL reagen biuret

- Dikocok
- Diinkubasi padas suhu 37⁰C selama 10 menit
- Didiamkan selama 30 menit pada suhu ruang
- Diukur absorbansi masing-masing pada panjang gelombang 540 nm

Absorbansi

3. Penetapan Absorbansi larutan Blanko

1 mL aquades

- Dimasukkan ke dalam tabung

reaksi
- Ditambah 5 mL reagen Biuret
- Dikocok
- Diinkubasi dengan suhu 37℃
selama 10 menit
- Diukur absorbansi pada panjang
gelombang 540 nm dengan alat
spektrofotometer uv-vis
Absorbansi

11
4. Penentuan Absorbansi larutan sampel

1 mL sampel

- Dimasukkan ke dalam tabung reaksi

- Ditambah 5 mL reagen Biuret
- Dikocok
- Diinkubasi dengan suhu 37℃ selama 10
menit
- Diukur absorbansi pada panjang gelombang
540 nm dengan alat spektrofotometer uv-vis
Absorbansi

12
 G. HASIL PENGAMATAN
No Alur Percobaan Sebelum dan Sesudah Dugaan Reaksi Kesimpulan
1. Persiapan sampel Sebelum : Kandungan protein ikan mujair Sampel ikan mujair (larutan
Sampel : Padatan, berbau adalah 18,2 gram / 100 gram protein) menghasilkan warna
Aquades : tidak berwarna Dengan persentase sebesar putih keruh dan endapan
Sampel (Ikan Mujair)
18,2% berwarna putih.
- Ditimbang 1 gram
Sesudah :
- Dihancurkan dengan mortal alu
- Ditambah aquades 10 mL samapi + aquades : larutan putih
larut keruh
- Disentrifuge dengan kecepatan
Disentrifuge : filtrate putih
3500 rpm selama 10 menit
- Didekantasi keruh dan endapan putih
Larutan Protein Sampel
Residu : endapan putih
Filtrate : larutan putih keruh

Filtrat Residu

Sampel

13
 Cu2SO4.5H2O(aq)+ NaOH (aq) Semakin tinggi konsentrasinya
Penetapan Absorbansi larutan Standart
2. Sebelum : Cu(OH)2(aq) + Na2SO4 maka nilai absorbansinya

1 mL lar. 1 mL lar. 1 mL lar. 1 mL lar. 1 mL lar. - Larutan standart: larutan (aq) + 5H2O semakin tinggi pula, sesuai
protein dg protein dg protein dg protein dg protein dg tidak berwarna
dengan hukum Lmbert-Beer
kadar 1mg kadar 2mg kadar 3 kadar 4mg kadar 5 mg
mg - Reagen biuret: larutan bahwa A = K (absorbansi
berwarna biru
berbanding lurus dengan
- Ditambah 5 mL reagen biuret - Aquades: larutan tidak konsentrasi).
berwarna
- Dikocok
- Diinkubasi padas suhu 37⁰C selama 10 Sesudah :
menit - Larutan standart (kadar 1 (aq)
- Didiamkan selama 30 menit pada suhu mg) + reagen biuret: (Kompleks warna ungu)
larutan berwarna biru
ruang
keunguan (+)
- Diukur absorbansi masing-masing pada
panjang gelombang 540 nm - Larutan standart (kadar 2
mg) + reagen biuret:
Absorbansi larutan berwarna biru
keunguan (++)

- Larutan standart (kadar 3

mg) + reagen biuret:
larutan berwarna biru
keunguan (+++)

14
- Larutan standart (kadar 4
mg) + reagen biuret:
larutan berwarna biru
keunguan (++++)
- Larutan standart (kadar 5
mg) + reagen biuret:
larutan berwarna biru
keunguan (+++++)

- Diinkubasi: tidak terjadi

perubahan

- Didiamkan: warna larutan

stabil

- Nilai absorbansi
A1 = 0,112
A2 = 0,158
A3 = 0,200
A4 = 0,251
A5 = 0,235

15
3. Penetapan Absorbansi larutan Blanko Sebelum : Cu2SO4.5H2O(aq)+ NaOH (aq) Dari percobaan yang telah
- Aquades: larutan tidak Cu(OH)2(aq) + Na2SO4 dilakukan diperoleh hasil larutan
1 mL aquades berwarna
3. (aq) + 5H2O blanko yang tidak terjadi
- Reagen biuret: larutan perubahan yaitu larutan tetap
- Dimasukkan ke dalam tabung
berwarna biru
reaksi berwarna biru dengan nilai
- Ditambah 5 mL reagen Biuret absorbansi 0.
- Dikocok Sesudah :
- Diinkubasi dengan suhu 37℃ - Larutan blanko + reagen
selama 10 menit biuret: larutan berwarna
- Diukur absorbansi pada panjang biru
gelombang 540 nm dengan alat (aq)
spektrofotometer uv-vis - Diinkubasi: tidak terjadi (Kompleks warna ungu)
perubahan
Absorbansi - Nilai absorbansi
A=0

16
4. Penentuan Absorbansi larutan sampel Sebelum : Cu2SO4.5H2O(aq)+ NaOH (aq) Dari percobaan yang telah
- Larutan sampel: putih Cu(OH)2(aq) + Na2SO4 (aq) dilakukan diperoleh kadar
keruh
1 mL sampel + 5H2O protein dari ikan mujair sebesar
- Reagen biuret: larutan
warna biru 5,7187%.
- Dimasukkan ke dalam tabung
reaksi Sesudah :
- Ditambah 5 mL reagen Biuret - Larutan sampel+ reagen
- Dikocok biuret: larutan berubah
- Diinkubasi dengan suhu 37℃ warna menjadi ungu
selama 10 menit bening
- Diukur absorbansi pada panjang
- Diinkubasi: tetap (aq)
gelombang 540 nm dengan alat
berwarna ungu bening (Kompleks warna ungu)
spektrofotometer uv-vis
Absorbansi - Didiamkan: tidak ada
perubahan

Nilai absorbansi sampel:

0,286

17
H. ANALISIS DAN PEMBAHASAN
Pada hari Rabu, 26 September 2018 telah dilakukan percobaan dengan
judul yaitu Penentuan kadar protein dengan metode biuret. Tujuan dari
percobaan ini adalah untuk menentukan kadar protein yang ada pada
sampel ikan Mujair dengan menggunakan metode biuret. Protein adalah
makromolekul yang tersusun dari bahan dasar asam amino (Poedjiadi,
2006). Penentuan kadar protein dapat dilakukan dengan berbagai metode,
seperti : metode Kedjal, metode Formol, metode Lowry, Metode Biuret.
Analisis protein dalam bahan pangan dapat dilakukan dengan dua metode
yaitu metode kuantitatif dan kualitatif. Metode yang digunakan pada
percobaan ini yaitu metode biuret. Metode biuret yaitu metode pengujian
yang memberikan hasil positif pada senyawa yang memiliki ikatan
peptide. Protein yang terukur pada metode biuret adalah protein yang larut
dalam air. Hasil positif pada pengujian ini ditandai dengan larutan
berwarna ungu.

Pertama, disiapkan alat dan bahan. Alat-alat yang dibutuhkan yaitu :

mortal alu, tabung sentrifuge, tabung reaksi, incubator,labu ukur 10 mL,
gelas ukur 10 mL, dan spektrofotometer uv-vis. Bahan-bahan yang
dibuuthkan yaitu ikan mujair, reagen biuret, aquades, larutan standart
protein dengan kadar 5 mg/mL.

Persiapan Sampel
Pada percobaan ke satu yaitu persiapaan sampel. Sampel yang digunakan
yaitu ikan mujair. Tujuan dilakukan percobaan ini yaitu untuk
mendapatkan filtrate sampel protein dalam keadaan bebas kontaminan.
Pertama, dilakukan penimbangan sampel, sampel berwarna putih den bau
yang amis. Dan didapat massa sebesar 1,0136 gram. Setelah itu sampel di
masukkan ke mortal dan di hancurkan dengan alu sampai halus. Dilakukan
pengukuran aquades sebanyak 10 mL menggunakan gelas ukur 10 mL.
aquades tidak berwarna, aquades tersebut di masukkan sedikit demi sedikit
ke dalam mortal dan di hancurkan. Fungsi aquades dalam proses tersebut

18
yaitu mempermudah proses penghancuran sampel dan melarutkan sampel.
Yang dilarutkan yaitu protein yang larut air, albumin. Albumin yaitu
protein sederhana yang diasumsikan selalu ada pada protein. Setelah
sampel hancur, sampel di masukkan ke dalam tabung sentrifuge dan
mortal di bilas dengan aquades sebelumnya. Lalu, larutan sampel terebut
di sentrifuge pada kecepatan 3500 rpm selama 10 menit. Dan di hasilkan
filtrate dan residu. Residu berada pada lapisan bawah, dan filtart berada
pada lapisan atas. Residu berwarna putih dan larutan filtrate berwarna
putih keruh.

Pembuatan Standart
Percobaan kedua yaitu Pembuatan Standart. Percobaan ini bertujuan untuk
membuat kurva standart menggunakan MS.Excel dan dihasilkan kurva,
persamaan, dan regresi dari persamaan tersebut yang akan digunakan
untuk menentukan kadar protein dalam ikan mujair. Selain itu, alrutan
standart juga berfungsi sebagai penentu panjang gelombang maksimum.
Pertama, larutan standart protein dengan kadar 5 mg/mL dilakukan
pengenceran bertingkat untuk mendapatkan larutan standart protein
dengan kadar 1 mg; 2 mg/mL; 3 mg/mL; 4 mg/mL; 5 mg/mL. pertama
dilakukan perhitungan dengan persamaan sebagai berikut :
V1 . M1 = V2 .M2
Selanjutnya didapat volume dengan masing-masing kadar,
Kadar larutan protein Volume (mL)
(mg/mL)
1 5
2 6,7
3 7,5
4 8
5 5

Dan dilakukan pengenceran bertingkat.

19
Selanjutnya, larutan standart protein dengan konsentrasi 1, 2, 3, 4, 5
mg/mL dimasukkan ke dalam masing-masing tabung reaksi. Larutan
standart protein, tidak berwarna. Setelah itu di tambahkan 5 mL reagen
biuret ke dalam masing-masing tabung reaksi. Reaksi yang terjadi saat
pembuatan reagen Biuret yaitu :

CuSO4.5H2O (aq) + 2NaOH (aq)  Cu(OH)2 (aq) + NaSO4 (aq) + H2O (l)

Cu(OH)2 (aq)  Cu2+ (aq) + OH- (aq)

Larutan standart protein dengan kadar 1 mg/mL berwarna biru keunguan

(+), larutan standart protein dengan kadar 2 mg/mL berwarna biru
keunguan (++), larutan standart protein dengan kadar 3 mg/mL berwarna
biru keunguan (+++), larutan standart protein dengan kadar 4 mg/mL
berwarna biru keunguan (++++), larutan standart protein dengan kadar 5
mg/mL berwarna biru keunguan (+++++).

Pengukuran reagen biuret dilakukan menggunakan gelas ukur 25 mL.

reagen biuret memiliki warna biru. Selanjutnya dilakukan pengocokan
perlahan. Lalu diinkubasi pada incubator selam 10 menit pada suhu 37C.
5 tabung reaksi di letakkan pada rak tabung reaksi, dan rak tabung di
masukkan ke dalam incubator. Fungsi dilakukan incubasi yaitu
mempercepat reaksi antara Cu2+ dan peptide. Dilakukan pada suhu 37C
karena pada suhu tersebut yaitu keadaan dimana reaksi akan berjalan
optimum. Selanjutnya didiamkan selama 30 menit, pada pendiaman
larutan warna yang dihasilkan akan lebih stabil, sehingga pada uji
spektrofotometri akan di dapat nilai absorbansi yang lebih akurat. Reaksi
yang terjadi yaitu :

20
 (aq) + Cu2+ (aq) →
(aq)

Setelah didiamkan, Larutan standart protein dengan kadar 1 mg/mL

berwarna biru keunguan (+), larutan standart protein dengan kadar 2
mg/mL berwarna biru keunguan (++), larutan standart protein dengan
kadar 3 mg/mL berwarna biru keunguan (+++), larutan standart protein
dengan kadar 4 mg/mL berwarna biru keunguan (++++), larutan standart
protein dengan kadar 5 mg/mL berwarna biru keunguan (+++++).

Lalu, dilakukan pengukuran absorbansi pada panjang gelombang 540 nm.

Pada panjang gelombang tersebut merupakan panjang gelombang
maksimal yang dapat di serap oleh senyawa tersebut. Sebelumnya
spektrofotometer UV-VIS telah dilakukan kalibrasi menggunakan larutan
blanko.
Dan didapatkan hasil absorbansi yaitu

Kadar larutan protein (mg/mL) Absorbansi

1 0,112
2 0,158
3 0,200
4 0,251
5 0,235

Setelah nilai absorbansi tiap-tiap kadar di dapat, maka nilai-niloai tersebut

di input ke MS.Excel sebagai nilai x, dan kadar tiap-tiap larutan standart
protein di input sebagai y. dan didapatkan kurva sebagai berikut :

21
 0.3
y = 0.0339x + 0.0895
0.25 R² = 0.8876

0.2

absorbansi
0.15
Linear (Series1)
0.1

0.05

0
0 1 2 3 4 5 6
kadar larutan protein

Dari kurva diatas, didapat persamaan yaitu y = 0.0339x + 0.0895 dan

regresi sebesar R² = 0.8876. persamaan dan regresi diatas akan di gunakan
untuk mendapatkan kadar protein Ikan mujair dengan memasukkan nilai
absorbansi ikan mujair pada x.

Penetapan Absorbansi Larutan Blanko

Larutan blanko berfungsi sebagai kalibrasi untuk alat spektrofotometer,
Pertama, dilakukan pengukuran aquades sebanyak 1 mL menggunakan
gelas ukur 5 mL. setelah itu dituangkan ke dalam tabung reaksi. Aquades
tidak berwarna dan tidak berbau. Selanjutnya ditambahkan 5 mL reagen
biuret dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan dikocok perlahan.
Reaksi yang terjadi saat pembuatan reagen Biuret yaitu :

CuSO4.5H2O (aq) + 2NaOH (aq)  Cu(OH)2 (aq) + NaSO4 (aq) + H2O (l)

Cu(OH)2 (aq)  Cu2+ (aq) + OH- (aq)

Lalu dilakukan inkubasi pada suhu 37C selama 10 menit, Fungsi

dilakukan incubasi yaitu mempercepat reaksi antara Cu2+ dan peptide.
Dilakukan pada suhu 37C karena pada suhu tersebut yaitu keadaan

22
dimana reaksi akan berjalan optimum. Selanjutnya didiamkan selama 30
menit, pada pendiaman larutan warna yang dihasilkan akan lebih stabil,
sehingga pada uji spektrofotometri akan di dapat nilai absorbansi yang
lebih akurat. Setelah itu diukur absorbansinya pada panjang gelombang
540 nm dengan alat yaitu spektrofotometer UV-VIS ganda. Sebelum
dilakukan pengukuran absorbansi, spektrofotometer telah di ON kan dan di
bersihkan kuvet menggunakan larutan blanko. Setelah itu kuvet yang berisi
larutan blanko di masukkan pada alat spektrofotometer yang merupakan
tempat larutan blanko. Setelah itu kuvet kedua diisi aquades dan di
masukkan pada alat spektrofotometer. Dan pada computer di klik
Autozero. Nilai absorbansi nol.

Penentuan Absorbansi larutan Sampel

Pada percobaan keempat yaitu penentuan absorbansi larutan sampel pada
ikan mujair. Hal pertama yang dilakukan yaitu 1 mL larutan sampel yang
telah didapatkan pada percobaan pertama. 1 mL larutan sampel berwarna
putih keruh diukur menggunakan gelas ukur 5 mL. setelah itu dituangkan
ke dalam tabung reaksi. Setelah itu di tambahakan 5 mL reagen biuret
yang berwarna biru. Dan di lakukan pengocokan perlahan. Reaksi yang
terjadi yaitu

2 (aq)+ Cu2+(aq) → (aq)

Fungsi pengocokan agar larutan sampel dan reagen biuret homogen. Lalu
diinkubasi pada incubator selam 10 menit pada suhu 37C. 5 tabung reaksi
di letakkan pada rak tabung reaksi, dan rak tabung di masukkan ke dalam
incubator. Fungsi dilakukan incubasi yaitu mempercepat reaksi antara Cu2+
dan peptide. Dilakukan pada suhu 37C karena pada suhu tersebut yaitu
keadaan dimana reaksi akan berjalan optimum. Selanjutnya didiamkan

23
selama 30 menit, pada pendiaman larutan warna yang dihasilkan akan
lebih stabil, sehingga pada uji spektrofotometri akan di dapat nilai
absorbansi yang lebih akurat. Lalu, dilakukan pengukuran absorbansi pada
panjang gelombang 540 nm. Sebelumnya spektrofotometer UV-VIS telah
dilakukan kalibrasi menggunakan larutan blanko dan uji absorbansi pada
larutan standart protein 1,2,3,4,5 mg/mL. dan didapatkan nilai absorbansi
larutan sampel sebesar 0,268.
Setelah itu di dapatkan nilai absorbansi sebesar 0,268. Setelah itu
nilai absorbansi dimasukkan dalam persamaan yang didapat pada
percobaan 2. Persamaannya yaitu :
y = 0.0339x + 0.0895
nilai absorbansi dimasukkan dalam bersamaan tersebut sebagai y. dan di
dapatkan nilai x sebesar 5,7965. Maka niali x tersebut di amsusikan
sebagai konsentrasi sampel yaitu 5,7965 mg.
massa sampel dengan konsentrasi mg/mL dihitung menggunakan
persamaan berikut :

massa sampel (mg/mL) =

dan didapatkan massa sampel sebesar 101,36 mg/mL.

dengan konsentrasi tersebut di dapatkan kadar protein dengan persamaan
yaitu :

kadar protein =

dan didapatkan kadar protein sebesar 5,7187%.

24
I. KESIMPULAN
a. Semakin tinggi konsentrasi maka intensitas warna ungu yang
dihasilkan akan semakin tinggi sehingga nilai absorbansi yang
dihasilkan akan semakin besar Semakin tinggi konsentrasi, maka nilai
absorbansi akan semakin tinggi.
b. Didapatkan absorbansi sampel sebesar 0,57965 , didapatkan
konsentrasi sampel sebesar 5,7965 mg dan didapatkan kadar protein
sebesar 5,7187%
c. Persamaan garis singgung yang diperoleh y = 0,0339x + 0,0895
dengan nilai regresi R² = 0.8876.

J. JAWABAN PERTANYAAN
1. Buatlah kurva standart kosentrasi vs absorbansi. Dengan bantuan kurva
standart tersebut tentukan kadar protein sampel!
Jawaban :

Konsentrasi larutan
standart protein (mg/mL) A
1 0.112
2 0.158
3 0.2
4 0.251
5 0.235

0.3
y = 0.0339x + 0.0895
0.25 R² = 0.8876

0.2
absorbansi

0.15
Linear (Series1)
0.1

0.05

0
0 1 2 3 4 5 6
kadar larutan protein

25
 Persamaan regresi

y = 0,0339x + 0,0895

0,286 = 0,0339x + 0,0895

0,286 – 0,0895 = 0,0339x

0,1965 = 0,0339x

x = 5,7965

konsentrasi sampel : 5,7965 mg

massa sampel = = 101,36 mg/mL

kadar protein = x 100% = 5,7187%.

2. Apakah peptide akan memberikan reaksi positif trhadap pereaksi

Biuret? Jika benar demikian, bagaimana menentukan kadar protein
yang tercampur dengan peptide?
Jawaban :
Ya, karena Biuret merupakan salah satu cara yang terbaik untuk
menentukan kadar protein suatu larutan. Dalam larutan basa, Cu2+ akan
membentuk kompleks dengan ikatan peptida suatu protein, sehingga
menghasilkan warna ungu yang dapat diidentifikasi dengan
spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm. Absorbansi ini
berbanding lurus dengan kosentrasi protein dan tidak tergantung jenis
protein karena seluruh protein pada dasarnya mempunyai jumlah ikatan
peptida yang sama persatuan berat.

26
K. DAFTAR PUSTAKA

Fessenden. (1986). Kimia Organik Jilid 2. Jakarta : Erlangga.

Gandjar, G.H., dan Rohman, A. 2007. Kimia Farmasi Analisis.
Yogyakarta: Pustaka Pelajar: hal.120, 164, 166.
Gandjar, I. G. & Rohman, A., 2007, Kimia Farmasi Analisis, 323-346,
Pustaka Pelajar, Yogyakarta.

Girindra, A. (1986). Biokimia I. Gramedia, Jakarta.

Hawab, HM. 2004. Pengantar Biokimia. Jakarta : Bayu Media Publishing.
Lehninger. 1982. Dasar-Dasar Biokimia 1. Terjemahan Maggy
Thenawidjaja.Jakarta : Erlangga
Maharani, Endang Triwahyuni dan Yusrin. (2010) Kadar Protein Kista
Artemi Curah Yang Dijual Petambak Kota Rembang Dengan Variasi
Suhu Penyimpanan, Prosiding Seminar Nasional UNIMUS 2010,
Universitas Muhammadiyah
Marzuki, Asnah. 2012. Kimia Analisis Farmasi. Makassar: Dua Satu
Press.
Poedjiadi, Anna. 2006. Dasar-dasar Biokimia. Jakarta : UI-PRESS
Sabrina A. 2012. Perbandingan metode spektrofotometri UV-Vis dan
KCKT (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi) pada analisis kadar
asam benzoat dan kafein dalam teh kemasan.[Skripsi]. Malang (ID):
Universitas Negeri Malang
Sudarmadji. S., Haryono, B., Suhardi. 1996. Analisa Bahan Makanan dan
Pertanian. Liberty Yogyakarta. Yogyakarta.
Syahril. 2016. Perbandingan Kandungan Zat Gizi Ikan Mujair. Makassar :
UNiversitas Hassanudin.
Tim Dosen Biokimia. 2017. Petunjuk Praktikum Biokimia. Surabaya:
Jurusan Kimia FMIPA Unesa.

Wunas, Yeanny dan Susanti. 2011. Analisa Kimia Farmasi Kuantitatif

(revisi kedua). Makassar: Laboratorium Kimia Farmasi Fakultas
Farmasi UNHAS.

27
Yahya, Sripatundita. 2013. JURNAL SPEKTROFOTOMETER-UV-VIS.
Diakses tanggal 8 Oktober pukul 21.00 WIB.

28
 LAMPIRAN PERHITUNGAN
Perhitungan Pengenceran Larutan Standart
- Konsentrasi larutan standart protein 5 mg/mL
V1 . M1 = V2 .M2
V1 . 10 mg / mL = 10 mL . 5 mg / mL
V1 = 5 mL
- Konsentrasi larutan standart protein 4 mg/mL
V1 . M1 = V2 .M2
V1 . 5 mg / mL = 10 mL . 4 mg / mL
V1 = 8 mL
- Konsentrasi larutan standart protein 3 mg/mL
V1 . M1 = V2 .M2
V1 . 4 mg / mL = 10 mL . 3 mg / mL
V1 = 7,5 mL
- Konsentrasi larutan standart protein 2 mg/mL
V1 . M1 = V2 .M2
V1 . 3 mg / mL = 10 mL . 2 mg / mL
V1 = 6,7 mL
- Konsentrasi larutan standart protein 1 mg/mL
V1 . M1 = V2 .M2
V1 . 5 mg / mL = 10 mL . 1 mg / mL
V1 = 5 mL

Perhitungan kadar protein sampel (ikan mujair)

Diketahui :

A1 (1 mg/mL) = 0,112

A2 (2 mg/mL) = 0,158

A3 (3 mg/mL) = 0,200

A4 (4 mg/mL) = 0,251

A5 (5 mg/mL) = 0,235

29
 A Blanko : 0

A Sampel : 0,286

Persamaan regresi

y = 0,0339x + 0,0895

0,286 = 0,0339x + 0,0895

0,286 – 0,0895 = 0,0339x

0,1965 = 0,0339x

x = 5,7965

konsentrasi sampel : 5,7965 mg

massa sampel = = 101,36 mg/mL

kadar protein = x 100% = 5,7187%.

30
LAMPIRAN FOTO

Gambar Keterangan
Disiapkan alat dan bahan terlebih
dahulu.
1. Gelas ukur
2. tabung reaksi dan rak
3. mortar dan alu
4. gelas kimia
5. tabung sentrifuge
6. labu ukur 10 ml
7. sampel (ikan mujair)
Daging ikan mujair dipisah dengan
kulitnya.

Massa yang digunakan untuk

menentukan kadar protein pada sampel
(ikan mujair) yaitu sebesar 1,0136 gram

31
Sampel dihancurkan sampai halus
dengan mortar dan alu.

Kemudian diencerkan dengan

ditambahkan 10 ml aquades.

Dimasukkan kedalam tabung

sentrifuge. Kemudian tabung tersebut di
sentrifuge dengan kecepatan 3500 rpm
dalam waktu 10 menit.

Hasilnya, filtrat sampel terpisah dengan

residu sampel. Filtrat berwarna bening
kekeruhan, sedangkan residu berwarna
putih.

32
Dalam pembuatan larutan sampel,
disiapkan terlebih dahulu 1 ml Filtrat
kedalam tabung reaksi.

Dalam pembuatan larutan standar,

disiapkan 5 tabung reaksi dan masing-
masing diberikan 1 ml larutan standar
protein dengan kadar 1,2,3,4,5, mg.

Dalam pembuatan larutan blanko,

disiapkan 1 ml Aquades dan
dimasukkan kedalam tabung reaksi.

33
Saat ditambahkan 5 ml reagen biuret,
warna larutan standar protein dan
sampel berubah warna menjadi biru
bening. Sedangkan blanko berwarna
biru muda bening.

Kemudian diinkubasi pada suhu 370C

selama 10 menit.

34
Setelah diinkubasi, warna larutan
standar protein tetap berwarna biru
bening, blanko tetap berwarna biru
mudah bening, dan sampel tetap
berwarna biru bening.

Untuk mengetahui nilai absorbansi dari

setiap larutan, makan dilakukan
pengukuran absorbansi menggunakan
spektrofotometri UV-VIS.

35