Nama

NIM
Kelompok
Laboratorium

: Nuraeni Kartika T
: G34140096
:6
:7

Tanggal Praktikum : 16 November 2016

Asisten Praktikum :
1. Sasti Regi B G34120055
2. Mazidah N.I G34120043

ISOLASI GENOM CENDAWAN

PENDAHULUAN
Latar Belakang

Semakin meningkatnya metode dalam ilmu genetika molekuler memudahkan

para ilmuan untuk mengidentifikasi suatu mikroba yang bersimbiosis atau hidup pada
tubuh organisme lain. Identifikasi dapat dilakukan melalui metode isolasi DNA genom.
Isolasi DNA genom merupakan suatu cara untuk mendapatkan DNA genom mikroba.
Isolasi DNA diawali dengan pembuangan atau perusakan dinding sel, dapat dilakukan
dengan cara mekanis seperti sonifikasi, tekanan tinggi, beku-leleh, atau cara enzimatis
seperti pemberian lisozim. Selanjutnya melisiskan sel, sentrifugasi, hingga pemurnian
DNA genom (Rifai 2011). Semua eukariot juga memiliki genom yang lebih kecil yang
berbentuk sirkular yaitu genom mitokondria. Genom eukariot yang terkecil berukuran
kurang dari 10Mb panjangnya. Sedangkan genom yang terbesar berukuran lebih dari
100 000 Mb. Identifikasi DNA genom eukariot dengan cara mengisolasi DNA genom
bakteri terlebih dahulu karena DNA genom bakteri memiliki sekuen subunit kecil yang
khas pada ribosomnya, yaitu 16s rRNA.
Isolasi genom cendawan sangat bermanfaat dalam bidang bioteknologi terutama
biologi molekuler. DNA bakteri yang telah berhasil di isolasi dapat diintroduksi ke
dalam tanaman untuk mengahasilkan bibit unggul, hal ini berguna dalam kegiatan
rekayasa genetika. Isolasi genom cendawan eukariot dapat digunakan untuk
mengidentifikasi suatu organisme melalui potongan gen tertentu. Oleh karena itu, secara
tidak langsung isolasi DNA bermanfaat untuk mengidentifikasi semua bentuk tingkatan
kehidupan mulai dari telur, larva, pupa, sampai dewasa bahkan mampu digunakan untuk
fragmen tubuh yang tidak diketahui asalnya. Aplikasinya dalam kehidupan yaitu dalam
analisis forensik atau analisis penyakit genetik (Zein & Prawiradilaga 2013).
Tujuan
Praktikum ini bertujuan mengisolasi genom cendawan (eukariot) dan
mengidentifikasinya secara molekular dengan menggunakan daerah ITS, gen penyandi
18S rRNA.

TINJAUAN PUSTAKA
Isolasi genom cendawan eukariot menggunakan beberapa cendawan yakni
Neurospora crassa yang terdapat pada oncom dan Rhizopus oryzae yang terdapat pada
tempe. Rhizopus oryzae jamur yang sering digunakan dalam pembuatan tempe. Jamur
ini aman dikonsumsi karena tidak menghasilkan toksin dan mampu menghasilkan asam
laktat. Sementara itu, Neurospora crassa merupakan jamur oncom yang termasuk
kedalam kelompok kapang (jamur berbentuk filamen). Tidak hanya itu, isolasi genom
cendawan eukariot menggunakan berbagai larutan. Beberapa larutan tersebut antara lain
nitrogen cair,buffer CTAB, PCI dan ETOH. Fungsi-fungsi larutan ini antara lain
penambahan nitrogen cair untuk menghancurkan sel atau jaringan (Faatih 2009).
. Fungsi dari penambahan larutan ETOH 70% untuk membersihkan sisa-sisa
larutan yang digunakan untuk mengendapkan DNA sebelumnya sehingga dapat
diperoleh DNA yang murni. Karena ETOH 70% termasuk etanol maka memiliki fungsi
yang sama yakni bertujuan membersihkan DNA plasmid dari pengotor-pengotornya.
Selanjutnya digunakan larutan pelisis sel lysing solution yang mengandung EDTA
(ethylenediamine tetraacetic acid) yang akan membentuk kompleks (chelate) dengan
ion logam, seperti Mg2+ yang merupakan kofaktor DNAse (Ardiana 2009).
Isolasi genom eukariot diawali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding
sel, yang dapat dilakukan baik dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi,
beku-leleh maupun dengan cara enzimatis seperti pemberian lisozim. Langkah
berikutnya adalah lisis sel. Bahan-bahan sel yang relatif lunak dapat dengan mudah
diresuspensi di dalam medium bufer nonosmotik, sedangkan bahan-bahan yang lebih
kasar perlu diperlakukan dengan deterjen yang kuat seperti triton X-100 atau dengan
sodium dodesil sulfat (SDS). Pada eukariot langkah ini harus disertai dengan perusakan
membran nukleus. Setelah sel mengalami lisis, remukan-remukan sel harus dibuang.
Biasanya pembuangan remukan sel dilakukan dengan sentrifugasi. Protein yang tersisa
dipresipitasi menggunakan fenol atau pelarut organik seperti kloroform untuk kemudian
disentrifugasi dan dihancurkan secara enzimatis dengan proteinase. DNA yang telah
dibersihkan dari protein dan remukan sel masih tercampur dengan RNA sehingga perlu
ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA. Molekul DNA yang telah

diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan penambahan amonium asetat dan

alkohol atau dengan sentrifugasi kerapatan menggunakan CsCl (Albert et al 2002).
METODE
0,1 gram sampel
(oncom &
tempe)

pelet

+ N2 cair
(mortar) lalu
haluskan

Sentrifuse
10.000 rpm 20
menit 4

+ 600

buffer CTAB
65 , 15
menit (bolakbalik) 5 menit
+ 600

L C:I

Bolak-balik

Sentrifuse
10.000 rpm 10
menit

Fase atas diambil

(500 L)
Tube baru

ETOH 70%

Tepung

+ 500

Freezer
overnight

+ 0,1 x Vol
NaoAC
+ 2-3x Vol
ETOH 100%

Tube baru

Fase atas diambil

(200 L)
Sentrifuse
10.000 rpm 10
menit

+ 600

L PCI

Bolak-balik

Keringkan 60
10 menit

+ 20-50

dH2O
Inkubasi 37
10 menit
elektroforesis