Alizarin adalah bahan utama untuk pembuatan pigmen danau marah dikenal sebagai pelukis

Rose marah dan alizarin merah. Alizarin dalam penggunaan paling umum dari istilah
memiliki warna merah tua, tetapi istilah ini juga merupakan bagian dari nama untuk beberapa
pewarna non-red terkait, seperti Alizarine cyanine Hijau dan Alizarine Brilliant Blue. Sebuah
penggunaan penting dari alizarin di zaman modern adalah sebagai agen pewarnaan dalam
penelitian biologi karena noda kalsium bebas dan kalsium tertentu senyawa warna ungu
merah atau cahaya. Alizarin terus digunakan secara komersial sebagai pewarna tekstil merah,
tapi pada tingkat lebih rendah dari 100 tahun yang lalu.

Alizarin red merupakan suatu metode untuk mengetahui pembentukan tulang pada embrio
atau untuk mendeteksi proses kalsifikasi pada tulang embrio. Tulang yang diwarnai oleh
Alizarin red akan berwarna merah tua, yang menandakan bahwa tulang tersebut telah
mengalami kalsifikasi. Warna merah tua terbentuk karena zat warna yang diberikan terikat
oleh kalsium pada matriks tulang. Proses kalsifikasi pada embrio ayam dapat diamati ketika
mulai umur inkubasi 9 hari.

Proses kalsifikasi atau terbentuknya tulang terjadi dengan 2 cara yaitu melalui osifikasi intra
membran dan osifikasi endokondral. Osifikasi intra membran merupakan proses
pembentukan tulang dari jaringan mesenkim menjadi jaringan tulang, contohnya pada proses
pembentukan tulang pipih. Sedangkan osifikasi endokondral yaitu proses pembentukan
tulang yang terjadi dimana sel-sel mesenkim berdiferensiasi lebih dulu menjadi kartilago
(jaringan rawan) lalu berubah menjadi jaringan tulang, misal proses pembentukan tulang
panjang, ruas tulang belakang, dan pelvis.

Metode mikroteknik untuk mengamati proses perkembangan organ tertentu dapat digunakan
pewarnaan khusus, misalnya pewarnaan alizarin untuk mendeteksi pengendapan mineral
kalsium pada proses pembentukan tulang keras. Mineralisasi matriks sel sangat
mempengaruhi proses pertumbuhan dan perkembangan jaringan tulang. Garam kalsium yaitu,
Ca karbonat pada cangkang telur ayam sangat berpengaruh dalam proses pengerasan tulang.
Tujuan

Tujuan dari praktikum kali ini adalah agar dapat melakukan prosedur pewarnaan Alizarin red
dan mengamati proses kalsifikasi tulang pada embrio ayam.

II. TINJAUAN PUSTAKA

Tulang selalu terbentuk dalam kerangka jaringan penyambung (connective tissue) yang telah
ada sebelumnya. Perbedaan-perbedaan dalam perkembangan terjadi karena dalam embrio
beberapa dari tulang-tulang itu diendapkan dalam mesenkim yang belum terdiferensiasi
(pembentukan tulang intra membran), sedangkan di bagian lain dari tubuh terjadi
pembentukan tulang yang didahului oleh sistem tulang rawan penumpu yang sementara
(pembentukan tulang endokondral) (Storer, 1978).

Proses penting pembentukan matriks tulang dan osifikasi (penulangan) adalah sama.
Osifikasi bermembran terjadi dalam tulang-tulang tengkorak pipih dan klavikula (tulang
selangka), sedangkan osifikasi endokondral bersifat khas untuk sebagian besar sisi kerangka
tubuh. Perbedaan antara kedua proses itu terletak dalam kenyataan bahwa pada osifikasi
endokondral, tiap spikula diendapkan sekeliling pecahan matriks tulang rawan yang telah
mengapur, sedangkan pada spikula tulang intra membran tidak terdapat kerangka semacam
itu ( Bevelander, 1988).

Matriks tulang mengandung unsur-unsur yang sama seperti jaringan-jaringan penyambung

lainnya, serat-serat dan bahan dasar. Pengendapan matriks ini oleh osteoblast disebut
osifikasi. Pengendapan garam-garam kalsium dalam matriks ini disebut kalsifikasi
(pengapuran), suatu proses yang terjadi normal pada tulang tetapi dapat terjadi patologis
dalam jaringan penyambung lain, seperti tulang rawan dan dinding pembuluh darah.
Kalsifikasi belum terjadi dalam matriks tulang, daerah itu disebut osteoid (Yatim 1983).

Tulang membentuk rangka tubuh, yang fungsinya untuk menahan berat badan. Otot volunter
(rangka) diinsersikan pada tulang melalui penyisipan tendon ke jaringan penyambung
periosteum. Tulang panjang membentuk suatu sistem tuas yang meningkatkan kekuatan yang
dihasilkan oleh kontraksi otot. Tulang melindungi sistem saraf pusat (yang terdapat di dalam
tengkorak dan kanalis spinalis) dan sumsum tulang (Junqueira & Carneiro, 1982).

III. MATERI DAN METODE

MATERI

Alat-alat yang digunakan pada acara praktikum ini adalah alat bedah, mangkuk, tempat
spesimen berupa 8 botol foto film, dan pipet tetes.

Bahan yang digunakan pada acara praktikum ini adalah embrio ayam umur inkubasi 10 hari,
larutan alkohol 70%, larutan pewarna Alizarin red, larutan penjernih A (gliserin 20 bagian +
KOH 4% 3 bagian + akuades 77 bagian), larutan penjernih B (gliserin 50 bagian + KOH 4%
3 bagian + akuades 47 bagian),larutan penjernih C (gliserin 75 bagian + akuades 25 bagian),
larutan KOH 1%, larutan gliserin murni, larutan garam fisiologis, dan akuades.

METODE

Telur ayam fertil yang telah diinkubasi atau dierami selama 10 hari dikeluarkan dari dalam
cangkang dan diletakkan di mangkuk yang telah diisi garam fisiologis.

Embrio dibersihkan dari membran ekstra embrional. Bila fetus telah memiliki bulu, maka
bulu-bulu tersebut dihilangkan agar tidak mengganggu pada saat identifikasi tulang yang
telah mengalami kalsifikasi.

Setelah embrio dibersihkan, kemudian dimasukkan ke dalam botol bening yang telah diisi
larutan alkohol 95%. Fetus direndam dalam larutan alkohol 95% ini selama kurang lebih 12
jam.

Embrio dipindahkan ke dalam botol yang berisi larutan KOH 1% dan dibiarkan dalam larutan
tersebut hingga otot menjadi transparan dan skeletonnya terlihat jelas.

Setelah jaringan otot transparan, embrio dipindahkan ke dalam botol yang berisi larutan
pewarna Alizarin red dan direndam dalam larutan ini hingga skeleton berwarna merah tua
atau ungu (kurang lebih selama 3 jam).

Embrio dipindahkan ke dalam larutan KOH 2%. Embrio direndam dalam larutan ini selama
kurang lebih 30 menit agar jaringan otot benar-benar menjadi transparan.

Embrio dipindahkan ke dalam larutan penjernih A selama 1 jam kemudian ke dalam larutan
penjernih B dan C masing-masing selama 1 jam.

Embrio dipindahkan ke dalam larutan gliserin murni yang telah diberi tymol.

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil

Gambar 1. Penulangan Embrio/Fetus

Keterangan Tulang yang telah mengalami kalsifikasi

metacarpals

clavicle

caudal vertebrae

tibio-tarsus

tarso-metratarsus

V. Pembahasan

Perkembangan tulang terdiri dari bertambahnya ukuran (tumbuh), kedewasaan dan umur.
Perubahan dari perkembangan membranous dan kartilaginous tulang keras disebut
pendewasaan tulang. Terdapat 5 periode pembentukan tulang yaitu: (1) periode embrionik:
mandibula, maksila, humerus, radius, ulna, femur, dan fibia (2) periode fetal: scapula, illium,
fibula (3) tulang muda: epiphisis pada anggota badan, karpal, tarsal, dan sesamoids (4) tulang
remaja: scapula, tulang rusuk, tulang pinggul/pinggang (5) tulang dewasa (Jessop, 1988).

Alizarin red adalah suatu metode mikroteknik untuk mengetahui pembentukan tulang pada
embrio atau untuk mendeteksi proses kalsifikasi pada tulang embrio. Tulang yang diwarnai
dengan alizarin red akan berwarna merah tua apabila tulang tersebut telah mengalami
kalsifikasi. Warna ini muncul karena zat warna yang diberikan terikat oleh kalsium pada
matriks tulang. Pembentukan system rangka dimulai pada inkubasi hari ke 5 ditandai dengan
kondensasi mesenkim prekartilago. Kondrifikasi dimulai pada hari ke 8 sedangkan osifikasi
dimulai pada hari ke 9 (Soeminto, 2000).

Proses pertumbuhan dan perkembangan jaringan tulang sangat tergantung pada mineralisasi
matriks ekstra sel. Komponen matriks ekstra sel utama yang berperan dalam proses
pengerasan tulang adalah garam kalsium. Embrio ayam, sumber kalsiumnya adalah Ca
karbonat pada cangkang sedangkan pada embrio mammalia kalsium ditransfer dari tubuh
induknya melalui plasenta (Villee, 1988). Kalsium adalah unsur yang sangat penting
dibutuhkan oleh tubuh, mineral ini sangat berfungsi dalam metabolisme dan pembentukan
tulang. Selain berperan dalam proses osifikasi, mineral kalsium yang dibutuhkan dalam
proses pembekuan darah, kontraksi otot, dan aktifitas enzim. Kalsium pada kelompok unggas
berperan dalam proses translokasi lemak dari darah ke dalam kuning telur (Karyadi, 2003).

Pembentukan tulang terjadi dengan dua cara. Cara pertama yaitu osifikasi intra membran
(membranous) dimana tulang terbentuk melalui konversi langsung dari jaringan mesenkim
menjadi jaringan tulang, atau dapat dikatakan pembentukan tulang dengan jalan transformasi
jaringan pengikat fibrosa. Cara yang kedua yaitu osifikasi endokondral, yakni pembentukan
tulang dimana sel-sel mesenkim berdiferensiasi terlebih dahulu menjadi kartilago (jaringan
rawan) kemudian berubah menjadi jaringan tulang.

Pertumbuhan tulang secara endokondral terdapat pada tulang sebelah dalam tubuh, seperti
vertebrae, costae, sternum dan extremitates. Proses penulangan diawali dengan masuknya
pembuluh darah membawa bahan tulang (ossein dan mineral) ke jaringan tulang rawan,
hadirnya osteoblast di situ, disusul dengan hadirnya pula chondroblast yang meresap tulang
rawan yang dirombak. Chondrosit menyusun diri menjadi jajaran lurus, disusul dengan
masuknya bahan kapur dan mineral lain ke matrix. Tulang akan terdiri dari lapisan-lapisan
(lamella) yang sebagian besar tersusun menurut lingkaran membentuk sistem Harvers
(Pattern,1971).

Larutan-larutan yang digunakan dalam percobaan ini mempunyai fungsi sendiri-sendiri.

Larutan alkohol berfungsi sebagai fiksatif. Larutan KOH dalam percobaan tersebut berfungsi
agar otot menjadi transparan dan skeletonnya terlihat jelas. Larutan pewarna Alizarin Red
berfungsi skeleton berwarna merah tua atau ungu. Larutan penjernih A, B, dan C berfungsi
untuk mengurangi kelebihan pewarna yang masuk ke dalam jaringan otot sehingga otot
menjadi tampak jernih transparan. Sedangkan, larutan gliserin berfungsi sebagai pengawet
spesimen. (Soeminto, 2000).

Adapun faktor-faktor yang mempengaruhi proses kalsifikasi pada embrio ayam, yaitu:

Hormon paratiroid, kalsitonin, dan vitamin D yang bertanggung jawab terhadap tingkat kadar
kalsium darah yang normal, yang akan mempengaruhi proses kalsifikasi. Kalsitonin adalah
hormon yang berasal dari sel-sel parafolikuler dari kelenjar tiroid. Hormon tersebut
mempunyai aksi dalam menurunkan kadar kalsium darah dan menghambat resorpsi tulang
sehingga mempengaruhi proses kalsifikasi.

Makanan juga berpengaruh dalam proses kalsifikasi. Hal ini khususnya berlaku terhadap
cukupnya persediaan dan tersedianya mineral-mineral seperti kalsium dan fosfor, yang
merupakan komponen-komponen anorganik utama dari tulang. Kekurangan kalsium atau
fosfor dalam makanan mengakibatkan pelanggaran dan kerapuhan tulang. Situasi dimana
kalsium cukup tetapi vitamin D kurang, terjadilah gangguan dalam penyerapan mineral dan
mineralisasi pada tulang yang sedang tumbuh (diantaranya tahap kalsifikasi) menjadi
terhambat (Yatim, 1983).

Berdasarkan hasil pengamatan, bagian-bagian tulang yang sudah mengalami kalsifikasi

adalah metacarpals, clavicle, caudal vertebrae, tibio-tarsus, dan tarso-metatarsus.

KESIMPULAN

Berdasarkan uraian di atas dapat diambil kesimpulan sebagai berikut :

Pewarna Alizarin Red digunakan untuk mendeteksi proses kalsifikasi pada tulang embrio.

Bagian-bagian tulang yang sudah mengalami kalsifikasi adalah metacarpals, clavicle, caudal
vertebrae, tibio-tarsus, dan tarso-metatarsus..

DAFTAR REFERENSI

Jessop, N. M. 1988. Theory and Problem of Zoology. B & JO Entreprise Pte Ltd, Singapore.

Karyadi, Bhakti., Mutmainnah, D., Kadir, A. dan Dadang S. 2003. Pemberian Rasio Kalsium
dan Fosfor terhadap Osifikasi Tulang Embrio Puyuh. UNIB, Bandung.
Pattern, B.M. 1971. Early Embriology of The Chick. Mc. Graw-Hill Publishing Company,
New Delhi.

Storer. 1978. General Zoology. McGrawHill Publishing Company, New York.

Villee, C. A., W. F. Walker, and R. D. Barnes. 1988. Zoologi Umum. Erlangga, Jakarta.

Yatim, W. 1983. Embryologi. Tarsito, Bandung.