PRAKTIKUM TEKNIK ANALISA MIKROORGANISME

MODUL III

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI Salmonella DARI BAHAN PANGAN

KP B

Hari, tanggal: Selasa, 14 Maret 2017

Praktikan: Jocelin Thea / 170115036

Bledy Faloy / 170115008

Asisten: Nalista Jayanthi / 170114013

Chessa Uly Thalia / 170114015

Dosen: Drs.Mangihot Tua Goeltom, M.Sc.

Ardhia Deasy Rosita Dewi,S.TP.,M.Sc.

FAKULTAS TEKNOBIOLOGI

UNIVERSITAS SURABAYA

2017
I. TUJUAN
Mampu mengisolasi dan mmengidentifikasi Salmonella pada bahan pangan
menggunakan teknik pengkulturan dan uji biokimia.
II. DASAR TEORI
Bakteri dari genus Salmonella adalah termasuk Gram negatif, fakultatif
anaerob, tidak membentuk spora, batang motil biasanya milik family
Enterobacteriaceae dan terutama terkait dengan hewan (Benson, 2001).
Salmonella adalah penyebab utama dari penyakit yang disebarkan melalui
makanan. Pada umumnya, serotipe Salmonella menyebabkan penyakit pada organ
pencernaan, mulai dari lambung hingga usus halus. Manusia dapat terkena bakteri
tersebut karena mengkonsumsi saluran pencernaan binatang seperti babi, sapi, dan
ayam. Penyakit yang disebabkan oleh Salmonella disebut salmonellosis. Ciri-ciri
orang yang mengalami salmonellosis adalah diare, keram perut, dan demam
dalam waktu 8-72 jam setelah memakan makanan yang terkontaminasi oleh
Salmonella. Gejala lainnya adalah demam, sakit kepala , mual dan muntah-
muntah. Tiga serotipe utama dari jenis S. enterica adalah S. typhi, S. typhimurium,
dan S. enteritidis. Kontaminasi Salmonella dapat dicegah dengan mencuci tangan
dan menjaga kebersihan makanan yang dikonsumsi. Pada praktikum uji
salmonella ini , sampel yang digunakan adalah hati ayam yang diambil dari pasar
tradisional. Dilakukan beberapa langkah, yaitu : pre-enrichment, selektive
enrichment, isolasi, uji biokimia, dan pewarnaan gram.
Hal pertama yang dilakukan adalah proses pre-enrichment. Pada proses ini,
hati ayam dicincang kecil-kecil agar bakteri yang ada di dalam juga bisa ikut
dikultur. Media yang digunakan adalah Lactose broth yang juga digunakan untuk
mendeteksi adanya koliform pada makanan dan air, dan sebagai bahan uji
fermentasi laktosa. Hasil dari tahap ini adalah media Lactose broth menjadi keruh
(Benson, 2001). Lalu tahap selective-enrichment yang menggunakan 2 media
yaitu: Selenite cystine (SC) broth dan Tetrathionate (TT) broth. Selenite cystine
digunakan untuk menghambat bakteri Gram positif dan menekan pertumbuhan
bakteri Gram negatif selain Salmonella. Sedangkan Tetrathionate (TT) broth
adalah medium yang kaya akan nutrient tertentu sehingga dapat menumbuhkan
dan memperbanyak sel dengan cepat. Proses selanjutnya yaitu isolasi kultur
bakteri dari media SC dan TT ke media Bismuth Sulfite (BS) agar, Xylose Lysine
Desoxycholate (XLD) agar, dan Hectoen Enteric (HE) agar. XLD agar
menunjukkan kemampuan bakteri tersebut dalam mereduksi sulfur maka pada
Salmonella koloninya menunjukkan hasil negatif sehingga koloninya berwarna
hitam. HE agar pada Salmonella koloninya berwarna hijau dengan inti yang
berwarna hitam. BS agar pada Salmonella koloninya berwarna hitam kecoklatan
(Leboffe, 2011).

Gambar 2.1 Koloni Salmonella pada media XLDA dan HEA (Leboffe, 2011).
Kemudian ada uji biokimia seperti pada media Triple Sugar Iron Agar (TSIA),
Lysine Iron Agar (LIA), SIM, MR-VP Broth, Simmons citrate agar (SCA). Pada
media TSIA, Salmonella pada produksi sulfur akan berwarna hitam (hasil positif).
Lalu di media LIA, produksi 𝐻2 𝑆 ditandai dengan adanya warna hitam pada
media.

Gambar 2.2 Hasil uji pada media TSIA dan LIA (Leboffe, 2011).
Pada uji Methyl Red-Vosgouer Phenol (MR-VP) yang menggunakan media
MRVP broth. MR digunakan untuk menguji kemampuan mikroorganisme dalam
menghasilkan dan mempertahankan produk asam akhir yang stabil dari fermentasi
glukosa dan mengatasi kapasitas buffer sistem. Hasil positif Salmonella yaitu
berubah menjadi warna merah setelah ditambah indikator metil red. VP digunakan
untuk mengidentifikasi mikroorganisme yang melakukan fermentase dengan hasil
akhir 2,3 butanadiol. Hasil positifnya yaitu berubah menjadi warna merah setelah
ditambah Reagen Barrit’s yang dapat menentukan adanya asetoin (asetil metil
karbinol) yang merupakan suatu senyawa pemula dalam sintesis 2,3 butanadiol
(Cowan, 2004). Lalu uji SIM pada media SIM broth dilakukan uji H2S dengan
menambahkan FeSO4 yang hasil positifnya media akan berubah menjadi warna
hitam (Leboffe, 2011). Untuk Simmons citrate agar
slant yang menggunakan media SCA slant yang
merupakan medium sintetik dengan Na-sitrat
sebagai satu-satunya sumber karbon, NH4+ sebagai
sumber N dan indikator BTB (Brom Timol Blue)
yang merupakan indikator pH. Bila mikroba
mampu menggunakan sitrat, maka asam akan
dihilangkan dari medium biakan, sehingga
menyebabkan peningkatan pH dan mengubah warna

Gambar 2.3 Hasil uji pada medium dari hijau menjadi biru (hasil positif)
SCA (Leboffe, 2011). (Leboffe, 2011).
Pada pewarnaan gram, bakteri yang diwarnai dibagi menjadi bakteri gram
positif (ungu) dan bakteri gram negatif (merah) (Pelczar & Chan, 1986).
Perbedaan warna antara bakteri gram negatif dan bakteri gram positif disebabkan
oleh adanya perbedaan struktur pada dinding selnya. Dinding Gram Positif
mengandung banyak peptidoglikan, sedangkan dinding bakteri Gram Negatif
banyak mengandung lipopolisakarida (LPS) (Suriawiria, 1999). Teknik ini
memerlukan 4 jenis reagen. Reagen pertama (warna dasar) berupa pewarna basa,
jadi pewarna ini akan mewarnai dengan jelas. Reagen kedua yang merupakan
mordant untuk memperkuat warna dasar. Reagen ketiga disebut bahan pencuci
warna (decolorizing agent). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada
komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat warna, maka
warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat
mengikat warna dasar, maka warna akan tercuci. Reagen terakhir adalah warna
pembanding, bila warna tidak tercuci maka warna pembanding akan terlihat, yang
terlihat pada hasil akhir tetap warna dasar (Colome, 2001).

III. ALAT & BAHAN:

A. ALAT : - Spiritus - Gelas Beaker
- Jarum Ose - Erlenmeyer
- Tabung Reaksi - Cawan Petri
- Kaca Objek - Pengaduk
B. BAHAN :
 Sampel
- Hati ayam
 Media
- Trypticase soy broth (TSB) - Simmons citrate agar
- Selenite cystine (SC) broth - Xylose desoxycholate (XLD) agar
- Lactose broth (LB) - Hektoen enteric (HE) agar
- Tetrathionate (TT) broth - Triple sugar ion agar (TSIA)
- Bismuth sulfite (BS) agar - SIM
- MR-VP Broth - Lysine iron agar (LIA)
 Reagen
- Kristal violet - Barrit A dan B
- Garam’s iodine - Fuchsin
- Etanol 96% - Reagen kovac’s
- Safranin - Metil merah

IV. SKEMA KERJA

 Penyiapan sampel dan prapengayaan

Dicacah Diaduk dan Inkubasi

Hati Media TSB
halus dilonggarkan 37oC selama
ayam secara steril
tutupnya sedikit 24 jam
 Pengayaan selektif

Media TSB Ambil 1-2 Tanam ke SC Inkubasi

yang telah ose dan TT broth 37oC selama
diinkubasi secara aseptik 24 jam

 Selective plating

Media SC dan TT broth Ambil Digores zig zag ke media Inkubasi

yang telah diinkubasi 1ose BS, XLD, HE secara aseptik 37oC selama
24 jam
 Enrichment koloni
Ambil koloni tunggal Inokulasi pada media Inkubasi 37oC
antara media BS, XLD, HE TSA slant secara aseptik selama 24 jam

 Uji metabolik / biokimia

 Triple Sugar Iron (TSI) agar

1 ose Tanam ke media dengan Inkubasi

kultur menusukkan bagian bawah lalu 24 -27 jam,
Amati dan Catat
(aseptis) digores zig zag suhu 37oC

 Lysine Iron Agar (LIA)

1 ose Tanam ke media dengan Inkubasi

kultur menusukkan bagian bawah lalu 24 -27 jam,
Amati dan Catat
(aseptis) digores zig zag suhu 37oC

 SIM Agar Deep Tube

1 ose kultur Tusuk ke media Inkubasi 24 -27

(aseptis) Amati dan Catat
jam, suhu 37oC

 MR-VP broth

1 ose Tanam ke Inkubasi

MR: Teteskan 3-5 metil red. Kocok lalu
kultur MR-VP 24 -27
jam, suhu VP: Teteskan 5-10 tetes amati dan
(aseptis) Broth
larutan Barrit A dan B catat
37oC

 Simmons citrate agar slant

1 ose kultur Gores zig zag pada Inkubasi 24 -27

(aseptis) permukaan media Amati dan Catat
jam, suhu 37oC

 Pewarnaan gram
Tetesi
kaca Tetesi Tetesi Tetesi
Tetesi Lugol Alkohol Fuchsin
objek
Biarkan Karbolgentian lalu 96%, lalu
dengan
kering violet lalu diamkan cuci diamkan
NaCl Keringkan
di udara diamkan 3 1 menit hingga 3 menit
0,9 % lalu Amati
lalu menit dan dan bilas pewarna dan bilas
lalu 1
fiksasi bilas dengan dengan tidak dengan
ose
air air luntur air
biakan
kultur
 V. HASIL PRAKTIKUM

Pre-enrichment. Selective enrichment.

Media: Trypticase Soy Broth Media: SC dan TT broth

Isolasi Salmonella.

A B B
A

C C
Media : Bismuth Sulfite (BS) Agar Media : Xylose desoxycholate (XLD) Agar

Keterangan:

A = Hasil
B = Kontrol
C = Swab
A B C
Media : Hektoen enteric (HE) Agar

Uji Biokimia.

1 2 3 4 1 2 3 4 1 3 2 4

Media : Triple Sugar Iron Media : Lysine Iron Media: SIM Deep
Agar (TSIA) Agar (LIA) Tube Agar
 1 3 2 4 1 2 3 4 1 3 2 4

Media: Simmons Citrate

Media: MR-VP Broth
Agar (SCA)
Keterangan: 1 = Hasil ; 2 = Positif ; 3 = Negatif ; 4 = Swab

Pewarnaan Gram

Gram : Negatif
Bentuk: Basil

Perbesaran 1000x

VI. PEMBAHASAN
Sampel yang digunakan adalah hati ayam yang akan diidentifikasi apakah
terdapat bakteri Salmonella atau tidak dengan dilakukan 5 proses, yaitu: pre-
enrichment, selective-enrichment, isolasi, uji biokimia, dan pewarnaan gram. Pada
tahap pre-enrichment, hasilnya adalah media berubah menjadi keruh. Lalu tahap
selective-enrichment, hasilnya pada media SC larutan berubah menjadi warna
orange dan pada TT larutan tetap berwarna putih. Selanjutnya proses isolasi ke
media Xylose desoxycholate (XLD) Agar menunjukkan adanya Salmonella
karena koloninya hitam dengan pinggiran merah, media Hektoen enteric (HE)
Agar menunjukkan adanya Salmonella karena adanya koloni hijau berintikan
hitam, media Bismuth sulfite (BS) Agar menunjukkan adanya Salmonella karena
koloninya berupa hitam kecoklatan.
Lalu dari ketiga media tersebut diambil salah satu koloni tunggal yang
benar-benar merupakan bakteri Salmonella ke media TSA slant agar menjadi
kultur bakteri. Setelah diinkubasi, dilakukan pengujian biokimia dengan media:
(1)Triple Sugar Iron Agar (TSIA) yang menunjukkan hasil positif mereduksi
sulfur sehingga berwarna hitam namun pada swab tidak berwarna hitam karena
menunjukkan hasil negatif, (2)Lysine Iron Agar (LIA) yang menunjukkan hasil
positif mereduksi sulfur sehingga berwarna hitam namun pada swab tidak
berwarna hitam karena menunjukkan hasil negatif, (3)SIM yang menunjukkan
hasil positif memproduksi H2S sehingga berwarna hitam namun pada swab tidak
berwarna hitam karena menunjukkan hasil negatif, (4)MR-VP Broth yang
menunjukkan hasil positif pada uji MR namun negatif pada uji VP, tetapi pada
swab menunjukkan hasil negatif pada uji VP dan pada uji MR larutan menjadi
warna hijau, (5) Simmons citrate agar (SCA) yang menunjukkan hasil negatif
dalam menggunakan sitrat, hal yang sama juga terjadi pada swab. Ketidaksesuaian
hasil yang didapat dari organ dan dari swab dapat dipengaruhi oleh adanya
kontaminan dari bakteri lain, terutama pada swab karena proses swab yang
dilakukan tidak steril sehingga sangat mungkin adanya kontaminan yang ada. Lalu
proses terakhir dilakukan pewarnaan gram untuk memastikan bahwa bakteri
tersebut adalah bakteri Salmonella, dan didapatkan hasil termasuk Gram negatif
dan berbentuk basil sehingga sudah sesuai dengan literatur.

VII. KESIMPULAN
Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan menggunakan sampel hati
ayam yang dibeli dari pasar tradisional, organ tersebut telah terkontaminasi oleh
bakteri Salmonella. Hal tersebut telat dibuktikan oleh serangkaian proses dari
tahap pre-enrichment, selective-enrichment, isolasi, uji biokimia, dan pewarnaan
gram yang menunjukkan hasil seperti dengan cirri-ciri dari bakteri Salmonella.

VIII. DAFTAR PUSTAKA

Benson. 2001. Microbiological Aplication : Laboratory Manual in General
Microbiology. New York : Mc Graw Hill.
Colome, J.S. Et.al. 2001. Laboratory Excercise in Microbiology. New York :
West Publishing Company.
Cowan, S.T. 2004. Manual for the Identification of Medical Fungi. London :
Cambridge University Press.
Koneman, E.W. 2006. Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology.
Philadelphia : Lippincott Company.

Leboffe, Michael .J., dan Burton E. Pierce. 2011. A Photographic Atlas of

Microbiology Laboratory. Colorado : Marton Publishing.

Pelczar, M. J., dan Chan, E.C.S. 2007. Elements of Microbiology. New York :
McGraw-Hill.

Suriawiria, U. 1999. Mikrobiologi. Jakarta : Universitas Terbuka.