Anda di halaman 1dari 14

Tahap-Tahap Uji Salmonella (SNI-01-2332.

2-2006)

A. Tahap pra-pengkayaan

Metoda ini didasarkan pada analisa 25 g atau 225 ml contoh dengan perbandingan 1 : 9 untuk
contoh dan media pengkayaan (lactose broth = LB). contoh yang akan diuji , kemudian di masukkan
dalam wadah atau plastik stomacher steril dan ditambahkan 225 ml larutan Lactose Broth
(LB). Homogenkan contoh (Stomacher) selama 2 menit untuk dianalisa. Secara aseptis, pindahkan
larutan contoh dalam wadah steril yang sesuai. Inkubasi 24 jam ± 2 jam pada suhu 35°C ± 1°C.
Lanjutkan pengujian sesuai dengan prosedur.

Sampel Tuna sebelum ditimbang

Sampel Tuna setelah ditimbang, siap di uji pada tahap Pra-Pengkayaan

(25 g sampel + 225 ml Lactose Broth)


Tahap Pra-Pengkayaan sebelum diinkubasi

Setelah diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35oC

B. Tahap pengkayaan

Kencangkan tutup wadah dan kocok perlahan contoh yang diinkubasi. Untuk produk perikanan
dengan tingkat kontaminasi tinggi, pindahkan 0,1 ml larutan contoh ke dalam 10 ml Rappaport-
Vassiliadis (RV) mediumdan 1 ml larutan contoh ke dalam 10 ml Tetrathionate Broth (TTB); Untuk
jenis produk perikanan lain, pindahkan 1 ml larutan contoh ke dalam masing-masing 10 ml SCB dan
10 ml TTB
Tahap Pengkayaan: dari contoh pra-pengkayaan ke media pengkayaan

TTB dan RV. Kemudian diinkubasi selama 24 jam pada Waterbath

suhu 43oC (untuk TTB) dan 42oC (untuk RV)

Inkubasi media pengkayaan selektif sebagai berikut:

inkubasi RV medium selama 24 jam± 2 jam pada suhu 42°C ± 0,2°C (Water bath);

Inkubasi TTB selama 24 jam ± 2 jampada suhu 43°C ± 0,2°C (Waterbath);

inkubasi TTB dan SCB selama 24 jam ± 2 jam pada suhu 35°C ± 1°C (Inkubator).

C. Tahap Isolasi

Kocok tabung (dengan vortex) dan dengan mengggunakan jarum loop (3mm) gores TTB yang
diinkubasi ke dalam media HE, XLD dan BSA. Siapkan BSA sehari sebelum digunakan dan simpan di
tempat gelap pada suhu ruang. Gores ke dalam media yang sama dari RV Broth atau SCB. Inkubasi
cawan BSA, HE dan XLD selama 24 jam pada suhu 35°C ± 1°C. Amati kemungkinan adanya
koloni Salmonella.
D. Pengamatan morfologi Salmonella

Ambil 2 atau lebih koloni Salmonella dari masing-masing media Agarselektif setelah 24 jam± 2 jam
inkubasi. Koloni-koloni Salmonella yang khas (typical) adalah sebagai berikut:

 Pada Hectoen Enteri (HE) Agar. Koloni hijau kebiruan sampai biru dengan atau tanpa inti
hitam. Umumnya kultur Salmonellamembentuk koloni besar, inti hitam mengkilat atau
hampir seluruh koloni terlihat berwarna hitam.

 Pada XLD Agar. Koloni merah jambu (pink) dengan atau tanpa inti hitam. Umumnya
kultur Salmonella membentuk koloni besar, inti hitam mengkilat atau hampir seluruh koloni
terlihat berwarna hitam.

 Pada Bismuth Sulphite Agar (BSA). Koloni coklat, abu-abu atau hitam; kadang-kadang
metalik. Biasanya media di sekitar koloni pada awalnya berwarna coklat, kemudian berubah
menjadi hitam (halo effect) dengan makin lamanya waktu inkubasi.

Koloni positif pada media selektif


HE (atas), BSA (kiri), dan XLD (kanan)
Koloni negatif pada media selektif

HE (atas), BSA (kiri), dan XLD (kanan)

Media TSI (merah) dan LIA (ungu) sebelum diinkubasi

LIA dan TSI positif setelah diinkubasi


 Ambil secara hati-hati bagian tengah koloni dengan menggunakan jarum inokulasi steril dan
goreskan ke permukaan media TSI agar dengan cara menggores agar miring dan menusuk
agar tegak. Tanpa mengambil koloni baru, gunakan jarum yang sama untuk menggores
media LIA dengan cara menusuk agar tegak lebih dahulu, setelah itu goreskan pada agar
miring.

 Inkubasi TSI dan LIA selama 24 jam ± 2 jam pada suhu 35°C± 1°C dengan membiarkan tutup
sedikit kendur untuk mencegah terbentuknya H2S yang berlebihan. Pada TSI,
kultur Salmonella yang khas memberikan reaksi alkalin (merah) pada goresan agar miring
dan asam (kuning) pada tusukan agar tegak, dengan atau tanpa H2S (warna kehitaman pada
agar). Pada LIA, kultur Salmonella yang khas memberikan reaksi alkaline (ungu) pada
keseluruhan tabung. Reaksi yang benar-benar kuning pada tusukan dinyatakan sebagai
kultur negatif. Jangan hanya melihat diskolorisasi pada tusukan untuk menyatakan kultur
negatif. Umumnya kultur Salmonellamembentuk H2S pada LIA. Beberapa kultur
non Salmonellamembentuk reaksi merah bata pada agar miring LIA. Reaksi TSI dan LIA dapat
dilihat pada Tabel 1. di bawah ini:

Tabel 1. Reaksi biokimia Salmonella pada TSI dan LIA

Media Agar Miring Agar Tegak Gas H2S


(goresan) (tusukan)

TSI Alkalin / K Asam / A (kuning) + /- + /-


(merah)

LIA Alkalin / K (ungu) Alkalin / K (ungu) +/- +

E. Identifikasi Salmonella

 Uji Urease

Pindahkan 1 ose penuh dari TSI Agar miring ke dalam Urea Broth. Inkubasikan selama 24 jam ± 2
jam pada suhu 35°C ± 1°C.
Reaksi positif Salmonella: Urease(-), Indol (-), Dulcito (+),

Lactose (-), Sukrose (-) dan Citrat (SCA) positif

 Uji Biokimia

a. Purple Broth base dengan 0,5% Dulcitol

Pindahkan 1 ose dari TSI ke dalam media dulcitol Broth. Kendurkan tutupnya dan inkubasi selama 48
jam ± 2 jam pada suhu 35°C ± 1°C, tetapi amati setelah 24 jam. Pada
umumnya Salmonella memberikan hasil positif, ditandai dengan pembentukan gas dalam
tabung durham dan pH asam (kuning) pada media. Reaksi negatif ditandai dengan tidak
terbentuknya gas pada tabung durham dan warna ungu (bromocresol purple sebagai indikator) pada
seluruh media.

b. Tryptone Broth (TB)

Pindahkan 1 ose dari TSI ke dalam media Tryptone Broth. Inkubasi selama 24 jam pada suhu 35°C ±
1°C dan selanjutnya ikuti prosedur di bawah ini:

Ø Potasium Cyanida (KCN) Broth

Pindahkan 1 ose dari TB 24 jam kedalam media KCN Broth. Tutup tabung rapat-rapat dan lapisi
dengan kertas parafilm. Inkubasikan selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35°C ± 1°C tetapi amati
setelah 24 jam. Hasil positif ditunjukkan dengan adanya pertumbuhan (ditandai dengan adanya
kekeruhan). Umumnya Salmonella tidak tumbuh pada media ini yang ditandai dengan tidak
terjadinya kekeruhan.

Ø Malonate Broth
Pindahkan 1 ose dari TB 24 jam kedalam media Malonate Broth. Inkubasikan selama 48 jam ± 2 jam
pada suhu 35°C ± 1°C, tetapi amati setelah 24 jam. Kadang-kadang tabung Malonate Broth yang
tidak diinokulasi berubah menjadi biru. Oleh karena itu gunakan Malonate Broth sebagai kontrol.
Reaksi positif ditandai dengan perubahan warna menjadi biru. UmumnyaSalmonella memberikan
reaksi negatif (hijau atau tidak ada perubahan warna) pada Broth ini.

Ø Uji Indol

Pindahkan 5 ml TB 24 jam kedalam tabung kosong dan tambahkan 0,2 ml – 0,3 ml Reagent kovacs’.
Amati segera setelah penambahan Reagen. Reaksi positif ditandai dengan terbentuknya cincin
merah pada permukaan media. UmumnyaSalmonella memberikan reaksi negatif (tidak terbentuk
cincin merah pada permukaan media).

Indol negatif (kiri) dan Indol positif (kanan)

reaksi Salmonella: Indol negatif


Reaksi positif Salmonella: KCN negatif dan Malonate negatif

 Uji Serologi Polyvalent Somatic (O)

Ambil 1 ose kultur dari TSI (dari butir 8.3f) yang telah diinkubasikan selama 24 jam – 48 jam dan
letakkan diatas gelas preparat, kemudian tetesi dengan larutan saline 0,85% steril dan emulsikan.
Letakkan 1 tetes Salmonella Polyvalent Somatic (O)Antiserum disamping suspensi koloni. Campurkan
koloniAntiserum sedikit demi sedikit dengan suspensi koloni sampai tercampur sempurna. Lakukan
kontrol dengan menggunakan larutan saline dan Antiserum. Miringkan campuran tersebut ke kiri
dan ke kanan, dan amati segera pada latarbelakang yang gelap. Amati hasil uji sebagai berikut:

Positif apabila terjadi penggumpalan pada larutan kultur dan tidak terjadi penggumpalan pada
larutan kontrol.

Negatif apabila tidak terjadi penggumpalan baik pada larutan kultur maupun larutan kontrol.

 Uji Biokimia Tambahan

Lakukan uji biokimia tambahan jika pada biakan tidak dapat diklasifikasikan sebagai Salmonella sp.

a. Purple Lactose Broth

Pindahkan 1 ose dari TSI Agar miring yang telah diinkubasi selama 24 jam – 48 jam kedalam phenol
red lactose atau purple Lactose Broth. Inkubasi selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35°C ± 1°C, tetapi
amati setelah 24 jam.

Positif, apabila terjadi pembentukan asam (kuning) dan gas pada tabung durham. Apabila hanya
terjadi pembentukan asam, maka dapat dinyatakan positif. Umumnya Salmonella memberikan hasil
negatif ditunjukkan dengan tidak terbentuknya gas pada tabung durham dan warna merah (phenol
redsebagai indikator) atau ungu (bromcresol purple sebagai indikator) pada seluruh media.

b. Purple Sucrose Broth

Pindahkan 1 ose dari TSI Agar miring yang telah diinkubasi selama 24 jam – 48 jam kedalam Phenol
red sucrose atau purple sucrose Broth. Inkubasi selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35°C ± 1°C, tetapi
amati setelah 24 jam.

Positif, apabila terjadi pembentukan asam (kuning) dan gas pada tabungdurham. Apabila hanya
terjadi pembentukan asam, maka dapat dinyatakan positif. Umumnya Salmonella memberikan hasil
negatif, ditunjukkan dengan tidak terbentuknya gas pada tabung durham dan warna merah (phenol
redsebagai indikator) atau ungu (bromcresol purple sebagai indikator) pada seluruh media.

C. Medium MR-VP
Pindahkan 1 ose dari TSI Agar miring ke dalam media MR-VP Broth dan inkubasikan selama 48 jam ±
2 jam pada suhu 35°C ± 1°C.

Ø Lakukan Uji VP

Pindahkan 1 ml MR-VP Broth yang telah diinkubasi selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35°C ± 1°C ke
dalam tabung reaksi steril dan inkubasikan kembali MR-VP Broth selama 48 jam ± 2 jam pada suhu
35°C ± 1°C untuk pengujian Methyl Red. Tambahkan 0,6 ml Alpha Alphanaphtol dan kocok.
Tambahkan 0,2 ml larutan 40% KOH dan kocok kembali. Untuk mempercepat reaksi tambahkan
sedikit Kristal kreatin, dan amati hasilnya setelah 4 jam. Perubahan warna menjadi merah
muda eosin sampai merah mirah delima (ruby) pada media menunjukkan reaksi
positif.Umumnya Salmonella memberikan reaksi VP negatif.

Ø Lakukan Uji MR

Tambahkan 5 tetes - 6 tetes indikator Methyl Red kedalam media MR - VP yang telah diinkubasi
selama 96 jam. Amati hasilnya dengan segera. Umumnya Salmonella memberikan reaksi positif,
ditandai dengan terjadinya difusi warna merah pada media. Terjadinya warna kuning menunjukkan
reaksi negatif.

VP negatif (kiri) dan VP positif (kanan)

Reaksi positif Salmonella: VP negatif


MR negatif (kiri) dan MR positif (kanan)

Reaksi positif Salmonella: MR positif

d. Simmon Citrat Agar

Pindahkan 1 ose dari TSI Agar miring kedalam media Simmon Citrate Agarmiring dengan cara
menggores agar miring dan menusuk agar tegak. Inkubasikan selama 96 jam ± 2 jam pada suhu 35°C
± 1°C.

Positif, apabila terjadi pertumbuhan yang biasanya diikuti dengan perubahan warnadari hijau
menjadi biru. Umumnya Salmonella memberikan hasil citratepositif.

Negatif, apabila tidak ada atau sedikit sekali pertumbuhan dan tidak terjadi perubahan warna.

Tabel 2. Reaksi Biokimia Salmonella


Hasil Reaksi Reaksi
No. Pengujian
Positif Negatif Salmonellasp

1 Glukosa (TSI) Tusukan kuning Tusukan merah Positif

Lysine Decarboxylase
2 Tusukan ungu Tusukan ungu Positif
(LIA)

3 H2S (TSI dan LIA) Hitam Tidak hitam Positif

Warna ungu Tidak ada perubahan


4 Urease Negatif
sampai merah warna

Lysine Decarboxylase
5 Warna ungu Warna kuning Positif
Broth (LDB)

Warna kuning Tidak ada perubahan


6 Dulcitol Broth Positif b
atau ada gas warna dan gas

KCN Broyh
7 Pertumbuhan Tidak ada pertumbuhan Negatif

Tidak ada perubahan


8 Malonate Broth Warna biru Negatif C
warna

Warna violet pada Warna kuning pada


9 Uji Indol Negatif
permukaan permukaan

Uji Serologi
10 Polyvalent Flagellar Penggumpalan Tidak ada penggumpalan Positif
(H)

Uji Serologi Polyvalent


11 Penggumpalan Tidak ada penggumpalan Positif
Somatic (O)

Warna kuning Tidak ada perubahan


12 Lactose Broth Negatif C
atau ada gas warna dan gas

Warna kuning Tidak ada perubahan


13 Sucrose Broth Negatif
atau ada gas warna dan gas
Uji Voges Proskauer Merah muda Tidak ada perubahan
14 Negatif
(VP) sampai merah warna

Warna merah
15 Uji Methyl Red (MR) Warna kuning menyebar Positif
menyebar

Ada pertumbuhan, Tidak ada pertumbuhan


16 Simmons Citrate Variabel
warna biru dan perubahan warna

Catatan:
a
+, 90% atau lebih positif dalam 1 atau 2 hari;

-, 90% atau lebih negatif dalam 1 atau 2 hari;

v, variabel
b
Mayoritas dari kultur Salmonella arizonae: Negatif
C
Mayoritas dari kultur Salmonella arizonae: Positif

Tabel 3. Kriteria untuk kultur non Salmonella

No. Pengujian Hasil (non Salmonella)

1
Urease Positif (warna ungu sampai merah)

Uji Indol dan Positif (warna merah pada permukaan


2
Polyvalent Flagellar (H) Negatif (tidak ada penggumpalan)

LDB dan Negatif (warna kuning)


3
KCN Positif (ada pertumbuhan)

Lactose Broth Positif (warna kuning ada gas) a,b


4

Sucrose Broth Positif (warna kuning ada gas) b


5

6 Uji VP Positif (merah muda sampai merah)


Uji MR Negatif (warna kuning menyebar)

Dengan:
a
Uji Malonate Broth positif lebih lanjut untuk menentukan jika biakan tersebut Salmonella arizonae.

Lakukan uji Malonate Broth untuk menentukan adanya Salmonella arizonae


b
Jangan membuang kultur Broth yang positif jika LIA menunjukkan reaksi Salmonella yang khas;
lakukan pengujian lebih lanjut untuk menentukan adanya bakteri Salmonella.