TPC MPN Uji Bonterey

TPC, MPN, Uji Bonterey
” TPC,
MPN,
UJI BONTEREY”
Disusun Oleh :
KELOMPOK
SEKOLAH MENENGAH KEJURUAN NEGERI 13 BANDUNG

PROGRAM KEAHLIAN ANALISIS KIMIA DAN TEKNIK KOMPUTER
JARINGAN
Jl. Soekarno-Hatta Km. 10 Telp/Fax. (022) 7318960 – 40286
E-mail : smkn13@bdg.centrin.net.id
2008
…..
MAKALAH MIKROBIOLOGI
Kata Pengantar
Puji serta syukur kami panjatkan atas rahmat dan karunia-Nya sehingga
kami dapat menyelesaikan makalah ini dengan penuh rasa tanggung jawab dan
tepat waktu dalam pengumpulannya.
Tujuan disusunnya makalah ini adalah untuk memenuhi salah satu tugas
mata pelajaran mikrobiologi, khususnya mengenai masalah pembelajaran
praktikum di semester 5 ini, mengenai TPC, MPN, dan Uji Bonterey dalam
metode analisa yang dilakukan, serta untuk menambah pengetahuan mengenai
Ilmu biologi/mikrobiologi.
Kami juga ingin mengucapkan terima kasih kepada semua pihak-pihak
yang telah membantu kami dalam penyusunan makalah ini.
Semoga makalah ini dapat bermanfaat bagi kami khususnya selaku
penyusun dan bagi siapa saja yang telah membacanya pada umumnya. Akhir kata
tiada gading yang tak retak, demikian pula dengan makalah ini yang masih jauh
dari sempurna. Tak lupa kritik dan saran sangat kami harapkan demi
penyempurnaan di masa yang akan datang.
Bandung, Agustus 2009
Penyusun
…..
Daftar Isi
Kata Pengantar …………………………………………………………….. i

Daftar Isi ………………………………………………………………….... ii
BAB I PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang ……………………………………………………. 1
1.2 Tujuan ……………………………………………………….……. 1
BAB II PEMBAHASAN
2.1. Perhitungan Mikroba dengan TPC ………………………………... 5
2.1.1 Pengenalan dasar Praktikum TPC……………………………. 9
2.1.2 Praktikum TPC (Angka Lempeng Total)…………………….. 11
2.2 Analisis Metode MPN ……………………………………………. 15
2.2.1 Analisis koliform metode MPN……………………………… 15
2.2.2 Praktikum MPN secara umum……………………………….. 18
2.2.3 Pengujian Escherichia coli…………………………………… 21
2.2.4 Analisis kualitas dan sanitasi air……………………………... 23
2.3 Uji Bonterey ……………………………………………………….. 26
2.3.1 Fermentasi karbohidrat………………………………………. 27
2.3.2 Uji IMVIC……………………………………………………. 33
2.3.3 Penggunaan citrat…………………………………………….. 44
BAB III PENUTUP

3.1. Kesimpulan ……………………………………………………….. 47
3.2. Saran ..........……………………………………………………….. 47
Daftar Pustaka ………………………………………………………........ 48

LAMPIRAN ......………………………………………………………… 49
…..
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Pengukuran kuantitatif populasi mikroorganisme sangat diperlukan untuk
berbagai macam penelaahan mikrobiologis. Terdapat berbagai macam cara untuk
menghitung jumlah mikroorganisme, akan tetapi secara mendasar, ada dua cara
yaitu secara langsung dan secara tidak langsung. Ada beberapa cara perhitungan
secara langsung, antara lain adalah dengan membuat preparat dari suatu bahan
(preparat sederhana diwarnai atau tidak diwarnai) dan penggunaan ruang hitung
(counting chamber). Sedangkan perhitungan cara tidak langsung hanya untuk
mengetahui jumlah mikroorganisme pada suatu bahan yang masih hidup saja
(viabel count). Dalam pelaksanaannya, ada beberapa cara yaitu : perhitungan pada
cawan petri (total plate count / TPC), perhitungan melalui pengenceran,
perhitungan jumlah terkecil atau terdekat (MPN metode), dan kalorimeter (cara
kekeruhan atau turbidimetri).
Tujuan dari analisa ini adalah agar siswa/pratikan mampu melakukan uji
bakteriologis terhadap air minum dengan metode MPN (Most Probable Number).
Pengujian bakteri koliform yang berasal dari cemaran tinja (faecal koliform)
secara serentak dengan uji penegasan yang menggunakan media BGLB, maka
dilakukan juga hal yang sama yaitu 1 ose kultur yang positif dari LST Broth atau
LB, dipindahkan ke dalam tabung EC medium yang baru. Semua tabung MC
medium yang telah diinokulasikan oleh kultur dari LST-Broth, kemudian
diinkubasikan pada suhu 45,5°C selama 24 jam dan hasil pembentukan gas
dicatat. Kerapatan bakteri faecal koliform diperkirakan dengan tabel MPN.
Diferensiasi bakteri koliform dapat diarahkan ke dalam reaksi IMVIC.
Berbagai macam uji mokrobiologis dapat dilakukan terhadap bahan pangan,
meliputi uji kuantitatif mikroba untuk menentukan daya tahan suatu makanan, uji
kualitatif bakteri patogen untuk menentukan tingkat keamanan dan uji indikator
untuk menentukan tingkat sanitasi makanan tersebut. Pengujian yang dilakukan
…..
terhadap tiap bahan pangan tidak sama tergantung berbagai faktor, seperti jenis
dan komposisi bahan pangan, cara pengepakan dan penyimpanan serta
komsumsinya, kelompok konsumen dan berbagai faktor lainnya
a) Total Plate Count (TPC)

TPC (Total Plate Count) atau ALT (Angka Lempeng Total) dan sering
disebut juga sebagai PLT (Perhitungan Lempeng Total), digunakan dan dipakai
untuk uji cemaran mikro di Industri baik, itu industri makanan, kosmetik terutama
untuk bahan-bahan sampel yang berwujud padat dan cair, baik sampel alami atau
pun yang ada di dalam kemasan dari suatu produk.
Secara umum tujuan untuk dilakukan TPC ini adalah untuk menentukan
total mikroba yang ada pada suatu sampel (baik padat ataupun cair) dengan
metode pengenceran serial dan cawan tuang, dimana pengenceran serial ini
merupakan proses pengenceran yang dilakukan dalam beberapa tahap kali
pengencerannya, sedangkan setelah dilakukan proses pengenceran, maka akan
dituangkan ke dalam cawan petri untuk dilakukan proses analisa lebih lanjut, yaitu
tahap inkubasi dan proses perhitungan jumlah mikroba.
Penghitungan jumlah mikroorganisme dengan cara viable count atau disebut
juga sebagai standar plate count didasarkan pada asumsi bahwa setiap sel
mikroorganisme yang hidup di dalam suspensi, akan tumbuh menjadi 1 (satu)
koloni setelah diinkubasikan di dalam media biakan dan lingkungan yang sesuai.
Setelah masa inkubasi, jumlah koloni yang tumbuh dihitung dan merupakan
perkiraan atau dugaan dari jumlah mikroorganisme dalam suspensi tersebut.
Penghitungan jumlah mikroorganisme hidup (viable count) adalah jumlah
minimum mikroorganisme. Hal ini disebabkan oleh koloni yang tumbuh pada
lempengan agar merupakan gambaran mikroorganisme yang dapat tumbuh dan
berbiak di dalam media dan suhu inkubasi tertentu. Sebagai contoh, sampel tanah
mungkin mengandung bakteri yang bersifat aerobik dan anaerobik. Jika suspensi
yang berasal dari sampel tanah ini ditumbuhkan dalam keadaan aerob, maka
hanya mikroorganisme yang bersifat aerob dan aerob fakultatif saja yang dapat
tumbuh, sedangkan mikroorganisme anaerob tidak dapat tumbuh. Bila media
…..
biakan tidak mengandung biotin, maka hanyalah mikroorganisme yang tidak

memerlukan biotin saja yang dapat tumbuh, sedangkan mikoorganisme yang
memerlukan biotin sebagai faktor pertumbuhan tidak dapat tumbuh. Berdasarkan
hal tersebut, media biakan dan lingkungan pertumbuhan dapat diatur sehingga
hanya mikroorganisme tertentu saja yang dapat tumbuh. Metode seleksi ini lazim
digunakan untuk mengisolasikan mikroba patogen di dalam air, makanan, dan
spesimen penyakit-penyakit tertentu.
b) Most Probable Number (MPN)

Metode MPN (Most Probable Number) untuk uji kualitas mikrobiologi air
dalam praktikum digunakan kelompok koliform sebagai indikator. Kelompok
koliform mencakup bakteri yang bersifat aerobik dan anaerobik fakultatif, batang
Gram negatif, dan tidak membentuk spora.
Metode MPN ini digunakan untuk menguji kualitas air yang dianalisis di
dalam suatu langkah pengerjaan metode analisa, dengan proses perhitungan total
bakteri yang melibatkan bakteri Esherichia coli, sampel yang digunakan adalah
sampel air yang diujikan, dan apabila terdapat bakteri E.coli di dalam sampel air
tersebut, maka dapat dinyatakan bahwa sampel air tersebut telah terkontaminasi
oleh bakteri E.coli, yang berasal dari kotoran, baik itu kotoran yang berasal dari
kotoran manusia, maupun hewan.
Pada dasarnya MPN ini didasarkan pada ada tidaknya bakteri Escherichia
coli dalam suatu sampel air yang kita analisa. Apabila tedapat bakteri Escherichia
coli. Dan jenis koliform lainnya maka dapat disimpulkan bahwa air tersebut telah
terkontaminasi oleh bakteri E.coli yang mungkin saja berasal dari kotoran-kotoran
yang dikeluarkan oleh manusia atau pun hewan dari hasil pencernaan yang
dilakukan oleh tubuhnya.
c) Uji Bonterey
Secara garis besar dan umum, uji bonterey dapat diartikan sebagai proses
uji ada tidaknya aktivitas yang ditimbulkan oleh suatu mikroba melalui
…..
penguraian suatu zat oleh aktivitas mikroba/bakteri yang dikenal dengan nama
reaksi fermentasi dari suatu sampel.
Terdapat beberapa uji biokimiawi dan mikrobiologi yang diperlukan untuk
proses identifikasi suatu mikroorganisme, baik yang dikenal maupun yang tidak
dikenal, diantaranya adalah :
1) Uji IMVIC ( Indol – Methyl-red – Voges-Praskuaer – Citrate).

2) Uji Fermentasi Karbohidrat
3) Uji Oksidase dan uji katalase
4) Hidrolisis urea
Proses pengujian yang dilakukan ini pada dasarnya adalah untuk

menganalisis ada tidak aktivitas mikroba di dalamnya. Hal ini yang menunjukna
layak tidaknya suatu bahan, baik itu makanan atau minuman, bahkan bahan-bahan
yang lain untuk dapat diproduksi dan dipasarkan, karena tidak semua bahan-bahan
yang telah terdapat di masyarakat berkualitas baik.
Uji-uji yang dilakukan didasarkan pada metode analisa dasar
mikroorganisme melalui kegiatan praktikum mikrobiologi dan analisa terhadap
suatu bahan, baik dengan menggunakan alat-alat instrumen maupun dengan
menggunakan alat-alat analisa seadanya dengan proses pengerjaan yang aseptis
sebelumnya. Metode dasar yang digunakan ini umumnya sama halnya dengan
praktikum uji dari suatu bahan di lab-lab klinis, dengan mengetengahkan
pengadaan mikroba dalam lingkungan masyarakat.
1.2 Tujuan
1. Mampu memenuhi salah satu tugas mata pelajaran mikrobiologi, yakni
pembuatan makalah tentang TPC (Total Plate Count), MPN (Most
Probable Number), dan Uji Bonterey (Uji Identifikasi Mikroba), tepat
waktu dalam pengumpulannya.
2. Pemahaman tentang pola pengajaran di dalam praktikum dengan referensi
yang tepat, dalam pelaksanaannya
…..
BAB II
PEMBAHASAN
2.1 Perhitungan Mikroba dengan TPC

Dalam proses penentuan pertumbuhan dari suatu mikroba, yaitu baik dalam
pembuatan kurva prtumbuhan atau pun dalam penyajian yang lain, sebelumnya
dilakukan dahulu proses perhitungan. Cara perhitungan yang paling umum
dilakukan didalam metode praktikum mikrobiologi ini adalah dengan cara proses
pengenceran. Proses analisa yang dilakukan tentu saja dengan metode pengerjaan
yang aseptis, karena yang dibutuhkan hanyalah pertumbuhan dari suatu mikroba,
dari dalam sampel yang kita preparasikan untuk kegiatan praktikum bukan dari
luar bahan yang kita siapkan.
Metode Pengencerannya :
Dengan pengenceran, disiapkan beberapa buah tabung yang berisi aqua-des
steril sebanyak 9 mL. Kepada masing-masing tabung kemudian ditambahkan 1
mL sampel yang mau diperiksa secara bertahap, yaitu :
a) 1 mL sampel ke dalam tabung pertama, hingga konsentrasi larutan di
dalam tabung pertama menjadi 10-1.
b) 1 mL dari tabung pertama dimasukan ke dalam tabung kedua, hingga
konsentrasi larutan di dalam tabung kedua menjadi 10-2.
Dan seterusnya sampai mencapai larutan dengan konsentrasi terendah, hal

ini dimaksudakan untuk proses pengenceran dari suatu sampel, sehingga nanti
tidak akan menyulitkan di dalam proses pengamatan mikroba dari sampel yang
sedang kita analisis. Karena pada dasarnya sampel yang kita analisis ini, belum
tentu memiliki jumlah mikroba yang sedikit pada awalnya, tetapi hampir
dipastikan dan diyakini, bahwa pada awal preparasinya, suatu sampel akan
membawa jumlah mikroba yang cenderung memiliki jumlah yang banyak, apalagi
…..
jika sampel yang kita bawa dari bahan alami, yaitu jenis sampel terbuka, berbeda
dengan sampel tertutup, karena hal ini pasti dibedakan tergantung dari jenis
sampel yang sedang kita analisis.
Dari tiap-tiap tabung kemudian diambil 1 mL larutan dan ditanamkan ke
dalam cawan petri berisi media pdat. Pertumbuhan koloni yang timbul pada tiap-
tiap cawan, dihitung. Di dalam cawan petri ini harus diperhitungkan faktor
kerapatan pertumbuhan koloni. Karena kalau pertumbuhan terlalu rapat, biasanya
sulit untuk dipertanggung-jawabkan hasil yang telah di dapat. Juga untuk
pertumbuhan yang terlalu jarang, sehingga diperlukan adanya pemilihan cawan
yang ditumbuhi koloni yang paling tinggi kemungkinannya untuk dihitung. Dan
hal yang perlu dicatat pengenceran ini dilakukan untuk mempermudah proses
pengamatannya juga, karena semakin encer sampel suatu larutannya, maka
kemungkinan untuk tumbuhnya pun semakin besar, dan mikroba yang tampak
pun akan semakin sedikit.
Dari gambaran di bawah ini terlihat jelas bahwa cawan yang paling
memungkinkan untuk dihitung adalah cawan yang diisi pengenceran 10-3
(1/1.000) yang menghasilkan jumlah koloni 159 sel. Sehingga perhitungan
menjadi :
159 x 103 = 1,59 x 105 sel/mL

dimana,
159 = jumlah koloni pada cawan tersebut.
103 = pengencaran yang dihitung.
Cara pemgenceran berikutnya lebih diperjelas, sehingga pertumbuhan koloni

mana yang dapat dipergunakan untuk perhitugan dan mana yang tidak digunakan,
juga dengan jelas akan menjadi nampak. Proses yang dilakukan secara aseptis ini
bertujuan agar semua mikroba yang kita analisis, kerena bisa saja apabila analisis
dan proses pengerjaannya tidak dilakukan dengan langkah pengerjaan yang
aseptis, mikroba yang akan tercampurkan akan terambil dari mana saja, di luar
dari sampel yang kita ujikan.
…..
(Gambar. Cara perhitungan jumlah mikroba dengan pengenceran)
adapun metode yang lain dan dapat digunakan :
Gambar. cara perhitungan dengan pengenceran sederhana
…..
Untuk menentukan jumlah bakteri dapat digunakan beberapa cara pengerjaan :

1) Jumlah bakteri secara keseluruhan (total cell count). Pada cara ini
dihitung semua bakteri baik yang hidup maupun yang mati.
2) Jumlah bakteri yang hidup (viable count). Cara ini hanya
menggambarkan jumlah sel yang hidup, sehingga lebih tepat bila
dibandingkan teknik pada total cell Count.
Perhitungan bakteri secara keseluruhan.

a. Menghitung Langsung secara Mikroskopik
Pada cara ini dihitung jumlah bakteri dalam satuan isi yang sangat kecil.
Untuk ini digunakan kaca obyek khusus yang bergaris (Petroff-Hauser) berbentuk
bujur sangkar. Jumlah cairan yang terdapat antara kaca obyek dan kaca penutup
mempunyai volume tertentu, sehingga satuan isi yang terdapat dalam satu bujur
sangkar juga tertentu.
Pembesaran yang digunakan untuk melihat bakteri membatasi volume cairan
yang sedang diperiksa. Hanya cairan yang mengandung bakteri dalam jumlah
tinggi yang dapat menggunakan cara seperti ini. Selain menghitung secara
langsung dengan mata, dapat pula digunakan alat penghitung elektronik Coulter
Counter. Dengan alat ini dihitung semua benda yang memiliki ukuran diameter
30 µm, sehingga cairan yang akan dihitung jumlah bakterinya haruslah benar-
benar hanya mengandung bakteri.
b. Menghitung dengan cara kekeruhan

Cara ini menggunakan spektrofotometer atau nefelometer. Dasar teknik ini
adalah banyaknya cahaya yang diabsorpsi sebanding dengan banyaknya sel
bakteri pada batas-batas tertentu. Cara ini dilakukan untuk mengaplikasikan
segala macam keterampilan yang dimiliki dalam metoda penghitungan jumlah
mikroba yang hidup di dalam suatu sampel yang sedang kita analisis, tetapi juga
haruslah hati-hati di dalam proses pengerjaannya, alangkah lebih bermanfaatnya
jika dilakukan di dalam tahap pengerjaan yang baik.
…..
2.1.1 Pengenalan dasar praktikum TPC (Total Plate Count)

Kegiatan praktikum TPC ini bertujuan untuk menentukan total mikroba yang
ada pada suatu sampel (baik sampel yang padat maupun yang cair) dengan metode
pengenceran serial dan cawan tuang. Dimana pengenceran serial ini dimaksudkan
agar proses pengamatan lebih mudah, karena koloninya lebih sedikit dalam cawan
petri yang diamati. Juga hal ini bertujuan untuk memenuhi syarat perhitungan
dalam data statistik yang telah ditetapkan secara pasti.
Dimana syarat perhitungannya adalah :
Jumlah koloni yang masuk ke dalam perhitungan adalah koloni dengan jumlah
anatara 30 – 300 koloni mikroba dari sampel. Hal ini dimaksudkan agar
sesuatu dengan data statistik.
a. Jenis-jenis sampel untuk TPC

1) Sampel cairan (co : sirup, susu, macam minuman)
2) Sampel serbuk (co : susu bubuk)
3) Sampel kental (co : kecap)
4) Sampel padat (co : biskuit)
5) Sampel beku (co : daging beku)
Cat : pada sampel padat preparasi yang dilakukan adalah darus ditimbang terlebih
dahulu, baru dilakukan proses pelarutan dengan bantuan pemanasan.
b. Pelarut yang digunakan

1) Air steril
2) Peptone water (Pw)
3) Buffered Peptone Water (Bpw)
4) Buffered Distilled Water (BDw)
5) Phosphat Buffered Distilled Water (PBDw)
Cat : hal yang harus dilakukan adalah gunakan pelarut baik yang dapat melarutkan
sampel, tetapi apabila sampel tidak dapat larut baik, maka cukup dilarutkan
menjadi suspensinya saja.
…..
c. Pengencer dan media yang digunakan

1) Pengencernya adalah air steril sebanyak 9 mL di dalam tabung-tabung
reaksi yang dipersiapkan untuk proses pengenceran.
Cat : Jumlah pengencer ini dipengaruhi oleh asal atau jenis sampel ada 2 macam asal
sampel, yaitu :
a) Sampel yang kontaminasinya besar yaitu bahan-bahan alami, dan berasal
dari tempat terbuka, contoh : gorengan, buah-buahan di pinggir jalan,
makanan terbuka. Pengenceran yang dilakukan dari 100 s/d 10-7 atau lebih.
b) Sampel yang kontaminasi sedikit, berasal dari bahan-bahan yang sudah
dikemas dan pastinya tertutup.contoh : makanan dalam kemasan dan ber-
merk, frutang, air aqua. Pengenceran dilakukan sampai 10-4 atau 10-5.
2) Media yang digunakan adalah media PCA (Plate Count Agar)
Tahapan pembuatannya :
1. Menghitung kebutuhan massa
2. Menimbang massa media padat
3. Melarutkan (bantuan pemanasan)
4. Mengecek pH media dalam larutan
5. Mengukur kebutuhan media
6. Membungkus media dalam larutan
7. Sterilisasi media.
d. Preparasi sampel untuk TPC

Preparasi yang dilakukan baik sampel padat maupun cair adalah dengan
alat-alat yang steril tentunya.
 Preparasi untuk sampel cair
1) Mensterilkan seluruh permukaan kemasan dari bahan atau sampel dengan
menggunakan kapas beralkohol di lap.
2) Melakukan sampling secara aseptis dengan wadah steril.
3) Mesterilkan wadah atau kemasan.
4) Menghomogenkan sampel (supaya mikroba rata di semua sampel bahannya)
5) Memipet secara aseptis.
6) Melakukan tahapan pengerjaan selanjutnya.
 Preparasi untuk sampel padat (berlaku juga untuk yang kental)
…..
1) Menyediakan kertas alumunium foil untuk sampling.

2) Membungkus sampel atau bahan padat dengan kertas AF.
3) Melakukan sampling secara aseptis.
4) Mensterilkan wadah atau kemasan yang diperlukan.
5) Menghomogenkan atau menghaluskan secara aseptis yaitu dengan cara
blender atau menumbuknya).
6) Menimbang secara aseptis sampel yang telah dipreparasikan.
7) Melarutkan secara aseptis (dekat api, dan jika perlu lakukan proes
pemanasan).
8) Memipet sampel secara aseptis.
9) Melakukan langkah pengerjaan analisis praktikum selanjutnya.
Catatan penting :
Pada langkah pengerjaan praktikum TPC hal yang paling utama dilaksanakan
adalah melakukan semua pekerjaan secara aseptis dan menyelesaikan semua
metode pemipetan dari botol sampel ke tabung-tabung, dan ke dalam cawan petri
setelah itu daru menambahakan 15 mL PCA suhu 45ºC - 50ºC.
2.1.2 Praktikum TPC (Angka Lempeng Total)

 Prinsip Pengerjaan
Pertumbuhan mikroorganisme aerob dan anaerob (psikrofilik, mesofilik dan
termofilik) setelah contoh diinkubasikan dalam media agar pada suhu 35°C ± 1°C
selama 24 jam 48 jam ± 1 jam mikroorganisme ditumbuhkan pada suatu media
agar, maka mikroorganisme tersebut akan tumbuh dan berkembang biak dengan
membentuk koloni yang dapat langsung dihitung. Penentuan Angka Lempeng
Total dapat dilakukan dengan dua cara. Pertama, metoda cawan agar tuang/pour
plate yaitu dengan menanamkan contoh ke dalam cawan Petri terlebih dahulu
kemudian ditambahkan media agar. Kedua, metode cawan agar sebar/spread plate
yaitu dengan menuangkan terlebih dahulu media agar ke dalam cawan petri
kemudian contoh diratakan pada permukaan agar dengan menggunakan batang
gelas bengkok.
 Alat dan Bahan
…..
1. Peralatan
a) Timbangan dengan ketelitian 0,0001 g;
b) Autoclave;
c) Inkubator 35 °C ± 1°C
d) Anaerobic jar;
e) Cawan petri 15 mm x 90 mm;
f) Botol pengencer 20ml;
g) Alat penghitung koloni;
h) Blender beserta Jar yang dapat disterilisasi atau stomacher;
i) Batang gelas bengkok diameter 3 mm–4 mm, dengan panjang tangkai 15
cm-20cm;
j) Pipet gelas atau pipetor : 0,1 ml, 1 ml, 5 ml dan 10 ml.
2. Bahan
a) Sampel susu murni
b) PCA (Plate Count Agar) dalam tabung sebanyak 20 mL.
c) Larutan pengencer
 Prosedur
HARI PERTAMA :
Metoda cawan agar tuang/pour plate method
a) Pipet 1ml dari setiap pengenceran 10-1,10-2, dst dan masukkan ke dalam
cawan Petri steril. Lakukan secara duplo untuk setiap pengenceran.
b) Tambahkan 12 ml - 15 ml PCA yang sudah didinginkan dalam waterbath
hingga mencapai suhu 45°C ± 1°C ke dalam masing-masing cawan yang
sudah berisi contoh. Supaya contoh dan media PCA tercampur sempurna
lakukan pemutaran cawan ke depan ke belakang dan ke kiri-ke kanan.
CATATAN : Untuk pengujian bakteri termofilik, penambahan media PCA kedalam cawan sebanyak 40 ml - 50 ml.
…..
c) Setelah agar menjadi padat, untuk penentuan mikroorganisme aerob

inkubasi cawan-cawan tersebut dalam posisi terbalik dalam inkubator
selama 48 jam ±2 jam pada suhu 22°C ±1°C (psikrofilik); 35°C
(mesofilik); 45°C (termofilik).
d) Untuk penentuan mikroorganisme anaerob, inkubasi cawan-cawan
tersebut dalam posisi terbalik dalam anaerobik jar dan masukkan kedalam
inkubator selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 22 °C ±1°C (psikrofilik); 35°C
Metoda cawan agar sebar /spread plate method

a) Tuang 12 ml – 15 ml PCA ke dalam cawan-cawan petri steril dan
dinginkan. Pipet 0,1 ml dari setiap pengenceran (10-1,10-2, dst) ke dalam
cawan petri yang telah berisi media PCA diatas dan ratakan dengan
menggunakan batang gelas bengkok. Lakukan secara duplo untuk setiap
pengenceran.
b) Setelah contoh meresap kedalam agar (diamkan sekurang-kurangnya 1
jam); Untuk penentuan mikroorganisme aerob inkubasi cawan-cawan
tersebut dalam posisi terbalik dalam inkubator selama 48 jam ± 2 jam pada
suhu 22°C ±1°C (psikrofilik); 35°C (mesofilik); 45°C (termofilik). Untuk
penentuan mikroorganisme anaerob, inkubasi cawan-cawan tersebut
dalam posisi terbalik dalam anaerobik jar dan masukkan kedalam
inkubator selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 22°C ± 1°C (psikrofilik); 35°C
c) Lakukan kontrol tanpa contoh dengan mencampur larutan pengencer
dengan PCAmedia PCA.
HARI KEDUA :
1. Menghitung jumlah koloni pada lempengan agar. Gunakan lempengan
agar yang mempunyai 30 – 300 koloni. Bila tidak ada lempengan yang
mempunyai kisaran jumlah koloni tersebut, gunakan lempengan agar yang
mempunyai koloni sekitar 300. Dan apabila tidak terdapat jumlah koloni
…..
yang ditetapkan sebelumnya, maka hal yang harus dilakukan adalah

melakukan pengulangan dalam proses pengambilan sampel dan kemudian
berlanjut dengan penambahan proses pengenceran, misal asalnya proses
pengenceran hanya sampai tahap 10-4 akan menjadi 10-6, jadi ditambahkan
agar tidak terlalu menyulitkan dalam proses pengamatannya nanti.
2. Menentukan jumlah mikroorganisme hidup dengan cara mengalikan
jumlah koloni dengan faktor pengenceran. Dan langkah terakhir yang
perlu untuk dilakukan adalah melaporkan hasil pengamatan dan
perhitungan yang telah dilakukan dalam pengerjaan analisis mikrobiologi.
Format Laporan Total Plate Count
Pengenceran Volume* yang Jumlah koloni CFU/mL
sampel digunakan
10-2
10-3
10-4
*Volume suspensi yang dimasukan ke dalam cawan.
(a) penghitungan jumlah hidup, lazimnya dilakukan dengan cara memasukkan volume suspensi tertentu
dalam cawan Petri. Lempengan agar diinkubasikan, kemudian dihitung jumlah koloni yang tumbuh setelah
masa inkubasi. Bila kandungan mikroorganisme dalam sampel terlampau banyak, artinya berkisar dalam
jumlah yang tinggi, maka sampel harus diencerkan.
…..
2.2 Analisis Metode MPN (Most Probable Number)

Berbagai mikroba patogen seringkali ditularkan melalui air yang tercemar
sehingga dapat menimbulkan penyakit pada manusia maupun hewan. Mikroba ini
bisanya terdapat dalam saluran pencernaan dan mencemari air melalui tinja.
Selain itu air yang tercemar dapat pula menyebabkan penyakit kulit dan mata, atau
pun berbagai jenis penyakit-penyakit pada organ-organ tubuh yang lainnya.
Mikroba asal tinja ini yang sering menyebabkan penyakit yang ditularkan
melalui air (water-bone disease) mencakup Salmonella typi, Shigella spp,
Salmonella paratyphi, dan Vibrio cholerae. Disentri yang disebabkan oleh
Campylobacter jejuni dan Escherichia coli dapat pula ditularkan melalui air.
Bakteri, virus dan protozoa dapat juga mencemari air melalui tinja sehingga
menimbulkan penyakit. Virus yang dapat mencemari air melalui tinja adalah virus
hepatitis A dan polio.
Keragaman mikroba yang dapat menimbulkan penyakit ini menyebabkan
para ahli mencari indikator untuk menunjukkan adanya mikroba patogen sehingga
dapat diketahui kualitas mikrobiologi atau sanitasi air. Sehingga indikator banyak
digunakan kelompok koliform, meskipun dapat digunakan indikator lainnya.
Analisis mikrobiologi yang lengkap ditulis di dalam “Standard Methods for the
Examination of Water and Wastewater” (American Public Health Asociation).
2.2.1 Analisis Koliform Dengan MPN

Metode MPN ini merupakan uji deretan tabung yang menyuburkan
pertumbuhan koliform sehingga diperoleh nilai untuk menduga jumlah koliform
dalam sampel yang sedang diujikan atau dianalisis. Jumlah koliform ini bukan
penghitungan yang tepat namun merupakan angka yang mendekati jumlah dalam
keadaan yang sebenarnya. Uji ini diawali dengan memasukkan 10 mL cairan dari
sampel ke dalam Lauryl tryptose broth. Uji awal ini disebut uji duga (pre-
sumptive test). Dalam uji duga, setiap tabung yang menghasilkan gas dalam masa
inkubasi diduga mengandung bakteri koliform. Uji dinyatakan positif, bila terlihat
gas dalam tabung Durham.
…..
Koliform memfermentasikan laktosa dengan pembentukan asam dan gas dalam

waktu 48 jam pada suhu 35ºC. kelompok koliform dipilahkan menjadi koliform
asal tinja dan bukan-tinja (misalnya tanah). Koliform asal tinja mampu
menghasilkan gas di dalam kaldu E.C dalam waktu 24 jam, pada suhu 44,5 ºC.
indikator ini dimaksudkan untuk mengecek antara sanitasi dari suatu bahan yang
umumnya adalah air yang digunakan sebagai sampel.
Tabung yang memperlihatkan pembentukan gas diuji lebih lanjut dengan uji
peneguhan dan bila diperlukan dilakukan uji koliform asal-tinja. Uji peneguhan
dilakukan untuk meneguhkan bahwa gas yang terbentuk disebabkan oleh kuman
koliform dan bukan disebabkan oleh kerja sama beberapa spesies sehingga
menghasilkan gas. Uji koliform asal-tinja dilakukan apabila ingin diketahui bahwa
kuman koliform yang diperoleh termasuk koliform yang diperoleh termasuk
koliform asal-tinja. Untuk uji peneguhan digunakan Brilliant Green Bile Lactose
Broth (BGBL) yang diinokulasikan dengan satu mata ose media, yang
memperlihatkan hasil positif pada uji duga. Kaldu BGBL diinkubasikan pada
suhu 35ºC selam 48 jam.
Untuk koliform asal-tinja, inokulasi dilakukan pada media E.coli yang
diinkubasi pada suhu 44.5ºC selam 24 jam. Pembentukkan gas di dalam tabung
menunjukkan hasil yang positif. Media dan suhu inkubasi menyuburkan kuman
yang diseleksi, baik dalam uji peneguhan maupun uji koliform asal-tinja. Uji
positif ini menghasilkan angka indeks angka ini disesuaikan dengan tabel MPN
untuk menentukan jumlah koliform dalam sampel.
Apabila diperlukan dapat dilakukan uji lengkap dengan menggunakan media
yang menunjukkan hasil positif pada uji peneguhan. Proses pengujian pada
metode MPN (Most Probable Number) ini tidak lain hanyalah untuk
menunjukkan adanya indikasi dan tanda-tanda dari suatu sampel apakah di
dalamnya mengandung/memiliki mikroba yang dapat merugikan bagi pihak
penggunanya. Di samping Uji peneguhan, adapun Uji Lengkap, Uji Koliform
tinja, dan yang paling awal dilakukan adalah Uji Pendugaan. Beberapa uji ini
digunakan sebagai langkah awal untuk melakukan analisa koliform pada suatu
sampel air, apakah tercemar atau pun tidak oleh E.coli.
…..
Cara pengerjaan uji lengkap terlihat pada gambar di bawah ini.
Gambar. Metode MPN

Tahapan uji duga, uji peneguhan dan uji lengkap pada uji MPN. Indeks MPN ditentukan
dari tabung yang menunjukkan hasil positif.
Metode MPN (Most Probable Number) untuk uji kualitas mikrobiologi air
dalam praktikum digunakan kelompok Koliform sebagai indikator. Kelompok
Koliform mencakup bakteri yang bersifat aerobik dan anaeorobik fakultatif,
batang gram negatif dan tidak membentuk spora. Koliform memfermentasikan
laktosa dengan pembentukkan asam dan gas dalam waktu 48 jam pada suhu 35°C.
Dalam metode MPN digunakan medium cair, berbeda dengan metode cawan
yang menggunakan medium padat (Agar). Perhitungan dilakukan berdasarkan
jumlah tabung yang positif, yaitu yang ditumbuhi oleh mikroba setelah inkubasi
pada suhu dan waktu tertentu. Pengamatan tabung positif dapat dilihat dengan
timbulnya kekeruhan atau terbentuk gas dalam tabung durham.
…..
2.2.2 Praktikum MPN secara umum :

a) Pengerjaan Analisis koliform dengan metode MPN
Bahan yang diperlukan :
 Sampel air minum yang akan diuji
 Lauryl Tryptose Broth (2x)
 Brilliant Green Bile Lactose Broth (BLBG)
 E.coli broth
 Eosin methylene Blue agar (EMG)
 Nutrient agar (agar miring)
 Biakan Escherichia coli
Cara mengerjakan :
Hari pertama
1. Memipet 10 mL sampel air dalam 5 tabung lauryl tryptose broth
konsentrasi 2x.
2. Melakukan proses inokulasi lauryl tryptose broth dengan biakan E,coli.
Biakan ini merupakan control positif.
3. Menginkubasi deretan tabung ini pada suhu 35ºC selama 48 jam!
Hari kedua
1. Mengamati tabung lauryl tryptose broth 2x. media ini merupakan media
penyubur bagi kelompok koliform. Menyimpan tabung yang menunjukkan
hasil yang positif.
2. Menyediakan tabung kaldu BGBL dan tabung E.coli. kaldu BGBL
menyuburkan koliform, sedangkan kaldu E.coli serta suhu inkubasi
menyuburkan koliform asal-tinja.
3. Menginokulasi kaldu BGBL dan E.coli dengan 1 mata ose lauryl tryptose
broth yang menunjukkan hasil positif. Kemudian menyediakan kontrol
positif dengan menginokulasikan kedua media tersebut dengan E.coli.
…..
4. Menginkubasi kaldu BGBL yaitu pada suhu 35ºC selama 48 jam.

Kemudian mengamati pembentukan gas!
5. Menginkubasi kaldu E.coli dalam penangas air tepatnya pada suhu 44.5ºC
selam 24 jam. Memperhatikan pembentukan gas yang muncul.
Hari ketiga
1. Dari tabung BGBL yang menunjukkan hasil positif, gores lempengan agar
EMB. Inkubasi pada suhu 35ºC selama 24 jam.
2. Membandingkan angka indeks yang diperoleh dari tabung BGBL dengan
tabel MPN untuk koliform!
3. Kemudian lakukan hal yang sama untuk tabung E.coli untuk koliform
asal-tinja.
Format laporan pengerjaan analisis air metode MPN

Tabung 1 2 3 4 5
24 jam
Uji duga
48 jam
Lauryl tryptose broth
24 jam
Uji peneguhan
48 jam
(BGBL broth)
24 jam
Koliform asal-tinja
48 jam
E.coli broth
Tuliskan hasil sebagai berikut :

(+) : pembentukan gas (-) : tidak ada pembentukan gas
(td): tidak diuji
Uji Lengkap
Jumlah koloform : MPN/100mL
Asal-tinja : MPN/100mL
…..
…..
Indeks MPN metode 5 tabung

Tabung yang Tabung yang
MPN/100mL MPN/100mL
memperlihatkan gas memperlihatkan gas
0-0-0 <2 4-2-0 22

0-0-1 2 4-2-1 26
0-1-0 2 4-3-0 27
0-2-0 4 4-3-1 33
1-0-0 2 4-4-0 34
1-0-1 4 5-0-0 23
1-1-0 4 5-0-1 31
1-1-1 6 5-0-2 43
1-2-0 6 5-1-0 33
2-0-0 5 5-1-1 46
2-0-1 7 5-1-2 63
2-1-0 7 5-2-0 49
2-1-1 9 5-2-1 70
2-2-0 9 5-2-2 94
2-3-0 12 5-3-0 79
3-0-0 8 5-3-1 110
3-0-1 11 5-3-2 140
3-1-0 11 5-3-3 180
3-1-1 14 5-4-0 130
3-2-0 14 5-4-1 170
3-2-1 17 5-4-2 220
4-0-0 13 5-4-3 280
4-0-1 17 5-4-4 350
4-1-0 17 5-5-0 240
4-1-1 21 5-5-1 350
4-1-2 26 5-5-2 540
5-5-3 920
5-5-4 1.600
5-5-5 ≥ 2.400
…..
2.2.3 Pengujian Escherichia coli.

E. coli merupakan bakteri gram negatif, berbentuk batang, uji indole positif
dan mampu memfermentasi berbagai karbohidrat seperti glukosa, laktosa, manitol
dan arabinosa. Media Eosin Methylene Blue mempunyai keistimewaan
mengandung laktosa dan berfungsi untuk memilah mikroba yang memfermentasi
laktosa seperti E. coli dengan mikroba yang tidak memfermentasikan laktosa
seperti S. aureus; P. aeruginosa dan Salmonella. Mikroba yang memfermentasi
laktosa menghasilkan koloni dengan inti berwarna gelap dengan kilap logam,
sedangkan mikroba lain yang dapat tumbuh koloninya tidak berwarna. Adanya
eosin dan methylene blue membantu mempertajam perbedaan tersebut. Namun
demikian jika media ini digunakan pada tahap awal, karena kuman lain juga
tumbuh terutama P. aeruginosa dan Salmonella sp dapat menimbulkan keraguan.
Bagaimanapun media ini sangat baik untuk mengkonfirmasi bahwa kontaminan
tersebut adalah E.coli.
Media MacConkey Agar mempunyai keistimewaan memilah bakteri enterik
gram negatif yang memfermentasi laktosa, karena media ini mengandung laktosa,
crystal violet dan neutral red bile salt. Kemampuan E. coli memfermentasi
laktosa menyebabkan penurunan pH, sehingga mempermudah absorpsi neutral
red untuk mengubah koloni menjadi merah bata dan bile/ empedu diendapkan.
Koloni lain (S. aureus; P. aeruginosa dan Salmonella), bila tumbuh tidak akan
berwarna karena tidak mampu memfermentasi laktosa. Mikroba lain yang dapat
tumbuh pada media ini antara lain Enterobacter; Proteus; Salmonella; Shigella,
Aerobacter; Enterococcus.
Media MacConkey Broth, walaupun tidak tercantum di FI-IV, sebenarnya media
ini bermanfaat sekali dalam memilah E. coli dari mikroba lain terutama S. aureus,
P. aeruginosa dan Salmonella. Adanya Oxgall dalam media berperanan dalam
menghambat bakteri gram positip lain seperti S. aureus. Kandungan laktosa
sangat penting untuk memilah E. coli dari mikroba lain yang tidak memfermentasi
laktosa, terutama P. aeruginosa dan Salmonella. Fermentasi laktosa oleh E. coli
menyebabkan pH turun. Kondisi asam akan menyebabkan bromo cresol purple
(media berwarna ungu) berubah menjadi kuning (media berwarna kuning) dan
…..
adanya pembentukan gas yang dapat diamati pada tabung durham. Sedangkan
Salmonella dan P. aeruginosa tidak dapat mengubah warna media karena tidak
memfermentasi laktosa, sedangkan mikroba lain yang mampu memfermetasi
laktosa dan mempunyai ekspresi pada media seperti E. coli adalah Enterobacter
aerogenes. Adapun cara memilah E. aerogenes antara lain dengan reaksi indole.
E. coli mempunyai reaksi positif, sedang E. aerogenes bereaksi negatif. Dengan
sifat tersebut media ini sangat baik untuk memilah E. coli dari mikroba lain pada
tahap awal terutama P. aeroginosa; S. aureus dan Salmonella.
(Gambar. Bakteri Escherichia coli sebagai

penyebab kontaminasi utama dalam air minum)
Escherichia coli merupakan bakteri yang memiliki bentuk batang lurus, 1,1 –
1,5 µm x 2,0 – 6,0 µm, motil dengan flagelum peritrikus atau nonmotil.
Merupakan kelompok bakteri Gram negatif. Dapat tumbuh dengan mudah pada
medium nutrient sederhana. Dengan laktosa yang difermentasikan oleh sebagian
besar galur dengan produksi asam dan gas. Kandungan G+C DNA adalah 50
sampai dengan 51 mol %.
Escherichia coli merupakan penghuni normal saluran pencernaan manusia
dan hewan berdarah panas. Biasanya tidak patogenik. Anggota lain kelompok
koliform ialah Klebsiella pneumoniae, yang tersebar luas di alam; terdapat dalam
tanah, air dan padi-padian, dan juga dalam saluran pencernaan manusia dan
hewan. Dalam melakukan analisa untuk uji dari suatu cemaran yang dilakukan
dapat digunakan beberapa spesies atau kelompok bakteri telah dievaluasi untuk
menentukan sesuai tidaknya untuk organisme indikator. Di antara organisme-
organisme yang dipelajari, yang hampir memenuhi semua persyaratan suatu
organisme indikator yang ideal adalah Escherichia coli dan kelompok bakteri coli
lainnya yang dianggap sebagai indikator polusi tinja.
…..
2.2.4 Analisis Kualitas dan Sanitasi Air

Istilah bakteri indikator sanitasi dikenal dalam bidang mikrobiologi pangan.
Bakteri indikator sanitasi adalah bakteri yang keberadaannya dalam pangan
menunjukkan bahwa air atau makanan tersebut pernah tercemar oleh kotoran
manusia yang mengingat banyaknya jumlah mikroorganisme ini, maka perlu
dilakukan suatu uji pemeriksaan terhadap bahan pangan tersebut agar aman
dikonsumsi. Bakteri-bakteri indikator sanitasi umumnya adalah bakteri yang
lazim terdapat dan hidup pada usus manusia sehingga dengan adanya bakteri
tersebut pada air atau makanan dapat menunjukkan bahwa dalam satu atau lebih
tahap pengolahan air atau makanan pernah mengalami kontak dengan kotoran
yang berasal dari usus manusia dan oleh sebab itu kemungkinan terdapat bakteri
patogen lain yang berbahaya. Ada tiga jenis bakteri yang dapat digunakan untuk
menunjukkan adanya masalah sanitasi, yaitu Escherichia coli, kelompok
Streptococcus (Enterococcus) fecal, dan Clostridium perfringens.
Pengadaan air bersih untuk kepentingan rumah tangga diantaranya adalah
untuk air minum, air mandi, dan keperluan sehari-hari. Keadaan air ini haruslah
memenuhi peryaratan yang sudah ditentukan sesuai dengan peraturan
internasional dari WHO dan APHA ataupun peraturan nasional setempat. Dalam
hal ini kualitas air bersih di Indonesia harus memenuhi persyaratan yang tertuang
di dalam peraturan Menteri Kesehatan RI No. 173/Men. Kes/Per/VIII/77 dimana
setiap komponen yang diperkenankan berada di dalamnya harus sesuai.
Kualitas Air Berdasarkan Nilai IPB (Indeks Pencemar Biologis)
Nilai IPB Kalitas air
0–8 Bersih, jernih
9 – 20 Tercemar ringan
21 – 60 Tercemar sedang
60 – 100 Tercemar berat
Perhitungan mikroba untuk keperluan nilai IPB harus dilakukan secara

langsung, misalnya dengan menggunakan ruang penghitung (counting chamber),
jadi tidak melalui cara yang tidak langsung. Pemeriksaaan air secara
mikrobiologis untuk coli dilakukan tiga tahap pengerjaan yaitu Tes presumtif (tes
perkiraan), Tes konfirmatif (tes penentuan), Tes lengkap.
…..
Jika dikaji lebih lanjut, suatu badan air, disini misalnya kolam ikan, dimasuki
buangan organik, misalnya yang berasal dari manusia dan kegiatan di dalam
rumahnya akan menyebabkan terjadinya gejolak kehidupan berbentuk siklus yang
dinamakan Siklus Biologis dinamis
Yaitu :
1) Manusia menghasilkan buangan berbebtuk urin, tinja, dan sampah ke
dalam perairan (kolam ikan misalnya).
2) Oleh bakteri buangan tersebut akan diuraikan menjadi ion-ion tertentu
yang sesuai dengan benda asalnya.
3) Hasil uraian akan digunakan oleh bakteri itu sendiri dan mikroalge untuk
pertumbuhan biomassa-sel, juga akan merupakan sumber nutrient untuk
tanaman air (misalnya kangkung, eceng, genjer, dsb).
4) Akibat dari adanya biomassa-mikroalge, proses fotosintesis akan terjadi
dengan menghasilkan oksigen yang dibutuhkan oleh bakteri menguraikan/
mengoksidasikan buangan.
5) Juga biomassa-mikroalge merupakan makanan utama dari Zooplankton,
zooplankton merupakan sumber utama makanan ikan/hewan kecil, serta
ikan/hewan air kecil merupakan sumber utama makanan ikan besar, serta
akhirnya ikan merupakan suber protein, lemak, dan karbohidrat bagi
manusia.
6) Juga tanaman air, akhirnya akan merupakan sumber karbohidrat, lemak,
vitamin dan protein bagi manusia.
Secara umum pengukuran coli hanya dilakukan sampai Tes Presumtif

(perkiraan) saja, yang hasilnya dicocokan dengan table JPT analisa dari badan
statistik. Berdasarkan kepada hasil tes perkiraan, maka jumlah bakteri Coli
sudah dapat ditentukan berdasarkan tabel tadi (Jumlah Perkiraan Terdekat)
atau dengan MPN (Most Probable Number) per 100 mL.
Dengan adanya siklus biologis ini kita dapat memperkirakan berbagai

kemungkinan yang dapat dilakukan secara lengkap.
…..
(Gambar. Siklus Biologis-dinamis di dalam perairan)
Mikroorganisme sebagai indikator kualitas air

Pada pemeriksaan mikrobiologis yang rutin terhadap air untuk menentukan aman
tidaknya untuk diminum, tidaklah cukup jika mendasarkan uji-uji yang digunakan
hanya terdapat adanya (terisolasinya) mikroorganisme patogenik karena alasan
sebagai berikut :
1) Kemungkinan besar patogen masuk ke dalam air secara sporadis.
2) Bila terdapat dalam jumlah amat sedikit, maka sifat patogen tidak
terdeteksi.
3) Hail pemeriksaan laboratorium dapat dikethaui setelah 24 jam atau lebih.
Ciri mikroorganisme indikator

1) Terdapat di alam tercemar.
2) Terdapat dalam air bila ada patogen.
3) Jumlah mikroorganisme indikator berkolerasi dengan kadar polusi
4) Memiliki kemampuan bertahan hidup lebih besar dari yang patogen.
5) Mempunyai sifat seragam dan mantap
…..
2.3 UJI BONTEREY

UJI UNTUK IDENTIFIKASI MIKROBA
Mikroorganisme tumbuh dan berkembang biak dengan menggunakan berbagai
bahan yang terdapat di berbagai lingkungan, baik lingkungan yang lembab, basah,
maupun lingkungan yang kering, sehingga mikroorganisme ini dapat hidup di
berbagai jenis lingkungan, tetapi tentu saja tergantung dari jenis mikroorganisme
tersebut. Zat hara yang terdapat di lingkungan sekelilingnya ini terdiri dari
molekul-molekul sederhana seperti H2S dan NH4+, atau terdapat senyawa atau
molekul-molekul organik yang kompleks seperti protein dan polisakarida.
Mikroba mengoksidasikan zat hara ini untuk memperoleh energi dan senyawa
pemula untuk sintesis dinding sel, membran dan flagela.
Penggunaan zat hara ini tergantung dari aktivitas metabolisme mikroba.
Metabokisme seringkali menghasilkan hasil sampingan yang dapat digunakan
untuk identifikasi suatu mikroorganisme.
Pembahasan dari suatu analisis ini dimaksudkan untuk mengetahui berbagai
macam identifikasi yang dilakukan untuk mengetahui jenisnya ini. Hal ini
mencakup berbagai uji untuk mengetahui aktivitas metabolisme suatu
mikroorganisme. Pengamatan aktivitas metabolisme ini diketahui dari
kemampuan mikroorganisme untuk menggunakan dan menguraikan molekul yang
kompleks seperti zat pati, lemak, protein dan asam nukleat. Selain itu pengamatan
ini juga dilakukan pada molekul-molekul yang sederhana seperti asam amino dan
sakarida. Hasil dari berbagai uji ini digunakan untuk pencirian dan identifikasi
suatu mikroorganisme.
Berbgai macam identifikasi yang dilakukan baik itu secara langsung
terhadap bakterinya maupun dalam keadaan tidak langsung, akan memeberikan
hasil yang berbeda tentunya. Dari berbagai uji-uji identifikasi tersebut akan dapat
memudahkan ketercapaian suatu analisa dengan mengetengahkan tentang
pentingnya, bahkan kerugian yang ditimbulkan oleh suatu mikroorganisme ini.
Pada dasarnya kita tentu tahu bahwa mikroba ada yang bersifat patogen dan ada
yang tidak, sehingga kita harus mampu untuk mengenali dan memilih mana saja
bakteri yang diidentifikasikan patogen.
…..
2.3.1 FERMENTASI KARBOHIDRAT

Kemampuan memfermentasikan berbagai karbohidrat dan produk fermentasi
yang dihasilkan merupakan ciri yang sangat berguna dalam identifikasi dari suatu
mikroorganisme.
Hasil akhir fermentasi karbohidrat ditentukan oleh sifat mikroba, media
biakan yang digunakan, serta faktor lingkungan, antara lain suhu dan pH. Media
fermentasi harus mengandung senyawa yang dapat dioksidasikan dan
difermentasikan oleh mikroorganisme. Glukosa termasuk senyawa yang paling
sering dan penting untuk digunakan oleh mikroorganisme dalam proses
fermentasi.
Untuk menentukan adanya fermentasi, di laboratorium digunakan media kaldu
karbohidrat dan media MR-VP. Pembentukan asam dapat diketahui dengan
menanamkan indikator ke dalam suatu media. Kaldu karbohidrat digunakan untuk
uji pembentukan asam dan gas. Pembentukan gas dapat ditentukan dengan
menggunakan tabung Smith atau tabung Durham. Tabung Smith digunakan bila
jumlah dan macam gas yang dihasilkan harus ditentukan. Sedangkan tabung
Durham ini digunakan bila tidak diketahui macam dan jumlah gas yang
dihasilkan. Bila terbentuk gas, maka gas masuk ke dalam tabung Durham dan
mendesak cairan dalam tabung ini; gas ini terlihat sebagai gelembung udara yang
terperangkap dalam tabung Durham.
Kaldu karbohidrat ini mengandung 0,5 – 1 % karbohidrat. Karbohidrat yang
sering dipakai adalah glukosa, laktosa, manitol, maltosa, dan sukrosa. Selain
karbohidrat ke dalam media ditambahkan juga beef extract dan peptone sebagai
sumber nitrogen, vitamin dan mineral. Untuk mengetahui pembentukan asam, ke
dalam media ditambahkan indikator. Bila dalam proses fermentasi, bakteri atau
mikroba ditumbuhkan dalam biakan dalam cair yang mengandung glukosa, maka
hasil proses fermentasi dapat berupa asam. Asam yang dihasilkan akan
menurunkan pH media biakan yang telah dibuat. Indikator yang sering digunakan
adalah merah fenol dan bromcresol purple. Bila dalam media biakan ditambahkan
indikator pH seperti misalnya brom-cresol-purple atau merah fenol, maka
…..
pembentukan asam ini ditandai oleh perubahan warna menjadi kuning. Pada pH >
7.0, merah fenol berwarna merah sedangkan bromocresol purple berwarna ungu.
Gambar. Reaksi Fermentasi Karbohidrat

(a) Tabung control, (b) Fermentasi Asam laktat,
(c) Fermentasi asam campuran, (d) Fermentasi
alkohol
Pada pengamatan di atas kita dapat mengetahui hal yang paling mendasar dari
reaksi fermentasi kabohidrat di dalam tabung Durham. Perbandingan yang
diperoleh antara salah satu tabung yang dicampur atau diisi dengan asam akan
menyebabkan berawarna kuning, sehingga akan terlihat reaksi fermentasi
karbohidrat secara jelas di pandangan dalam membedakan dari warna.
Proses selanjutnya :
Setelah diperoleh koloni-koloni dalam keadaan terpisah dalam lempeng
pembiakan, maka tindakan selanjutnya ialah mengadakan pemeriksaan sifat-sifat
biokimia yang penting untuk menunjang diagnosis yang ingin ditegakkan. Selain
itu isolasi dalam keadaan murni pada koloni itu digunakan untuk mengetahui
reaksi fermentasi terhadap jenis-jenis gula yang termasuk golongan
monosakarida, disakarida, dan polisakarida. Caranya adalah sebagai berikut.
…..
1) Jenis-jenis gula tersebut dimasukkan ke dalam medium pembiakan cair

atau padat. Medium yang dipakai tergantung pada kebutuhan hidup tiap
jenis organisme yang diteliti.
2) Untuk mengetahui ada tidaknya fermentasi terhadap gula tersebut, maka
ke dalam medium tersebut ditambahkan indikator yang dapat
menunjukkan perubahan pH ke arah asam atau basa.
3) Jenis-jenis gula yang dipakai ditetapkan dalam satu deret (dinamakan
deret aneka gula), dan letaknya dalam deret pada tiap kali pemeriksaan
tidak berubah, sehingga hasil dari tiap deret dapat dinyatakan dalam satu
formula tetap untuk tiap jenis organisme untuk laboratorium itu.
Misalnya bila suatu laboratorium menggunakan deret aneka gula dengan
urutan glukosa, laktosa, maltosa, dan sakarosa, maka bila deret ini
ditanam dengan Salmonella typhi, hasil yang diperoleh dalam bentuk
formula adalah (+ – + –) yang berarti bahwa fermentasi terjadi pada
tabung-tabung glukosa dan maltosa, sedang laktosa dan sakarosa tidak
difermentasi.
4) Ke dalam tabung-tabung (dalam medium cair) dimasukkan pula tabung
kecil yang letaknya terbalik (tabung Durham) untuk mengetahui apakah
dalam proses fermentasi itu terbentuk gas atau tidak. Bila gas terbentuk,
sebagian gas itu akan berkumpul dalam tabung Durham, sehingga
tampak rongga kosong. Bila hal ini terjadi pada medium padat dalam
tabung, mengakibatkan medium retak atau terdorong ke atas.
Gambar 14.1
Struktur antigenik Salmonella typhi.
…..
5) Cara menanam organisme ke dalam medium gula ini dilakukan sekaligus

untuk satu deret. Dengan menggunakan jarum sebagian koloni diambil
dan disentuhkan secara beruntun ke dalam medium gula tersebut.
6) Pengeraman dilakukan dalam suhu yang sesuai, untuk bakteri patogen
umumnya pada suhu 37oC.
7) Reaksi positif diperlihatkan oleh perubahan indikator, yang dinyatakan
dengan tanda + (positif) dan bila indikator tidak berubah berarti tidak
terjadi fermentasi, yang dinyatakan dengan tanda – (negatif).
Perlu diperhatikan dalam hal penggunaan indikator, bahwa pemilihannya

harus disesuaikan dengan keadaan pH medium pembiakan yang berubah akibat
fermentasi. Bila fermentasi mengakibatkan terbentuknya asam, pH medium akan
lebih rendah dari pH semula, dan penurunan ini tergantung pada jumlah asam
yang terbentuk dan jenis bakteri yang mengadakan fermentasi. Bila Ph turun
sampai 6,0 dan indikator yang dipakai merah fenol (phenol red), akan tampak
bahwa medium yang tadinya merah berubah menjadi kuning. Tetapi bila dipakai
indikator merah metil (methyl red), maka pada pH 6,0 indikator ini belum
memperlihatkan perubahan yang nyata. Baru pada pH yang jauh lebih asam,
merah metil tampak merah, sehingga bagi bakteri yang tidak membentuk asam
sebanyak ini, hasilnya dapat dibaca negatif, walaupun ada fermentasi. Karena
jenis gula dalam reaksi fermentasi ini banyak, maka untuk menghindarkan
kekeliruan tiap jenis gula diberi sandi warna, biasanya pada tutup tabung,
misalnya kuning untuk glukosa, ungu untuk laktosa, merah untuk maltosa, dan
biru untuk sakarosa. Selain reaksi deret aneka gula, masih dilakukan reaksi-reaksi
biokimia lainnya, baik untuk keperluan khusus atau untuk keperluan diferensiasi.
Untuk bakteri golongan koliform ditambahkan suatu deret khusus untuk
diferensiasi, yaitu deret IMViC. Singkatan ini berasal dari huruf I dari indol, M
dari metilmerah, Vi dari Voges – Prauskauer dan C dari “citrate” (sitrat). Maksud
dari pemeriksaan ini adalah untuk mengadakan diferensiasi jenis-jenis bakteri dari
golongan koliform, yang penting artinya dalam pemeriksaan air.
…..
1. Uji fermentasi karbohidrat

Biakan : Escherichia Coli
Staphylococcus aureus
Micrococcus luteus
Saccharomyces cerevisiae
Media : Kaldu karbohidrat,
Glukosal, sukrosa, laktosa, maltosa, dan manitol yang
mengandung indikator BCP (brom-cresol-purple). Selain BCP
dapat digunakan PR (phenol-red) sebagai indikator pH yang
digunakan.
Cara mengerjakan :
Hari pertama
1. Menandai tabung kaldu karbohidrat dengan : Jenis karbohidrat, nama
pembuat, biakan yang diinokulasikan, biakan yang digunakan untuk deret
karbohidrat pertama adalah E.Coli, deret kedua aureus, ketiga M.Luteus.
deret ke kempat S.cerevisiae dan deret kelima sebagai kontrol
2. Menginokulasikan deret karbohidrat pertama dengan E,coli, deret kedua
dengan S.aureus, deret ketiga dengan M.luteus dan deret keempat dengan
S.cerevisiae dan deret kelima sebagai kontrol. Dan melakukan inkulasi
dengan proses yang hati-hati sehingga tidak menimbulkan gelembung-
gelembung gas dalam tabung Durham.
3. Menginkubasikan kelima deret tabung di dalam incubator 35ºC selam 24
jam.
Hari kedua
1. Memeriksakan adanya fermentasi karbohidrat dengan melihat
pembentukan asam dan pembentukan gas. Pembentukan asam terlihat
sebagai perubahan warna kaldu karbohidrat menjadi kuning. Pembentukan
gas terlihat di dalam tabung Durham. Memperhatikan bahwa di dalam
…..
tabung kontrol tidak terjadi pembentukan gas. Pembentukan gas di dalam

tabung kontrol dapat terjadi bila sewaktu diinokulasi tabung yang berisi
kaldu dikocok terlalu keras atau bila digunakan kaldu yang disimpan di
dalam lemari es. Kemudian daya larut oksigen berkurang di dalam kaldu
yang dingin, namun sewaktu diinkubasikan pada suhu 37ºC Oksigen dapat
terperangkap di dalam tabung Durham.
2. Melaporkan hasil reaksi di dalam tabung yang berisi kaldu karbohidrat.
Contoh format laporan untuk uji Fermentasi karbohidrat

Karbohidrat
Organisme Glukosa Laktosa Sukrosa Maltosa Manitol
E.coli
S.aureus
M.luteus
S.cerevisia
e
Beri tanda hasil reaksi sebagai berikut :

A : Pembentukan asam
B : Pembentukan gas
AG : Pembentukan asam dan gas
B : Pembentukan baa
- : Tidak ada pertumbuhan
Dalam kaitannya dengan karbohidrat, ada beberapa cara uji yang dapat
dilakukan secara kualitatif untuk mengetahui karbohidrat untuk difermentasikan.
1) Uji Fehling, Barfoed, Benedict (ada tidaknya monosakarida).
2) Uji Antron (penentuan adanya gula dalam darah).
3) Uji Mollisch (karbohidrat secara umum).
4) Uji Selliwanof (penentuan fruktosa dalam sampel).
5) Uji Tauber (ada tidaknya pentosa dalam sampel).
6) Uji Iodin (ada tidaknya glikogen atau Eritrodekstrin).
7) Fenil-Hidrazin (untuk menentukan gugus karbonil lepas).
2.3.2 Uji IMVIC
…..
Banyak dilakukan untuk membedakan Enterobacter aerogenes dan

Esherichia coli dilakukan uji IMVIC yang terdiri dalri proses uji-uji :
 Uji Indol
 Uji Methyl Red
 Uji Voges Proskauer
 Uji Citrat
Kedua mikroorganisme tersebut akan memberikan hasil sebagai berikut :
I M Vi C
E.coli + + - -
A.aerogenes - - + +
1. Pemeriksaan Indol dan Uji Indol

Pemeriksaan Indol merupakan uji identifikasi yang didasarkan pada
penggunaan asam amino, baik sebagai media maupun sampel, atau standar. Asam
amino adalah molekul organik yang mengandung kelompok asam (COOH),
amino (NH2), dan R. Gugus R merupakan ciri khusus dan membedakan asam
amino yang satu dengan yang lainnya.
Miroorganisme menggunakan asam amino sebagai pembuka protein,
komponen sel dan kadangkala sebagai sumber energi. Asam amino ini
dimodifikasi dengan berbagai cara sewaktu metabolisme. Dalam praktikum ini
diperlihatkan berbagai cara mikroorhanisme memodifikasikan suatu asam amino.
Modifikasi asam amino dapat digunakan untuk pencirian, karena produk yang
dihasilkan akibat modifikasi asam amino dapat digunakan dalam identifikasi
mikroorganisme.
Asam amino triptofan merupakan komponen asam amino yang lazim terdapat
pada protein, sehingga asam amino ini dengan mudah dapat digunakan oleh
mikroorganisme akibat penguraian protein. Bakteri tertentu seperti misalnya
Escherichia coli mampu menggunakan triptofan sebagai sumber karbon.
E.coli menghasilkan enzim triptofanase yang mengkatalisasikan penguraian
gugus indol dari triptofan. Dalam media biakan, indol menumpuk sebagai produk
buangan, sedangkan bagian lainnya dari molekul triptofan (asam piruvat dan
NH4+) dapat digunakan untuk memnuhi kebutuhan zat hara mikroorganisme.
…..
Gambar. Struktur kimiawi asam amino
Pembentukkan indol dari triptofan oleh mikroorganisme dapat diketahui

dengan menumbuhkannya di dalam media biakan yang kaya dengan triptofan.
Triptofan biasanya diberikan dalam bentuk triptom suatu polipeptida yang kaya
dengan residu triptofan. Penumpukan indol dalam suatu media biakan dapat
diketahui dengan penambahan berbagai reagens. Reagens bereaksi dengan indol
dan menghasilkan senyawa yang tidak larut dalam air dan berwarna merah pada
permukaan medium.
Adapun proses hidrolisis triptofan dan uji indol, pada uji ini digunakan media
semi-padat yang kaya akan triptofan. Untuk melihat adanya indol dapat digunakan
beberapa reagens yaitu Kovacs, Gore, Ehrlich, dan Ehrlich-Bohme. Semua
reagens tersebut mengandung para-dimetil-aminobenzaldehida. Dalam praktikum
digunakan reagens Ehrlich-Bohme yang terdiri reagens A dan B.
Media untuk melihat pembentukan indol yang digunakan di laboratorium ini
bersifat semi-padat, oleh karena itu dapat digunakan juga untuk melihat
pergerakan bakteri. Jika bakteri bergerak akan terlihat pertumbuhan di sekitar
tusukan dan juga pada permukaan media. Media indol diinokulasikan dengan
menusukkan jarum ke dalam media semi-padat
Gambar. Cara menginolusikan biakan semi-padat

Pemeriksaan dimaksudkan untuk mengetahui apakah dalam proses
pertumbuhannya bakteri dapat membentuk indol dari triptofan. Adanya
…..
pembentukan indol dapat diketahui dengan reagens Ehrlich atau Kovacs, yang
mengakibatkan medium berwarna merah. Cara pengerjaannya adalah sebagai
berikut.
1. Medium pembiakan cair yang telah ditanam dieramkan selama 24 sampai
48 jam.
2. Reagens Ehrlich yang disediakan terdiri dari:
a. Para-dimetil-amino-benzaldehida = 9 g
b. Etil-alkohol = 190 ml
c. Asam klorida (pekat) = 40 ml
3. Ke dalam biakan ditambahkan 1 ml eter atau silol, dikocok, sehingga
tersebar rata di seluruh cairan, kemudian didiamkan sampai semua eter
atau silol berkumpul di permukaan.
4. Reagens diteteskan perlahan-lahan melalui dinding tabung sebanyak
kirakira 0,5 ml. Bila indol positif maka tampak cincin merah terbentuk di
batas cairan medium dan eter atau silol.
Indol dibentuk dari asam triptofan sebagai hasil aktivitas hidrolisis beberapa
spesies bakteri. Dalam hal ini yang perlu diperhatikan dalam medium pembiakan
hanya digunakan pepton yang mengandung asam amino. Indol adalah zat yang
dapat menguapkan dan dapat diperiksa adanya dengan penambahan
pdimetilaminobenzaldehida, atau dengan sepotong kertas yang diimpregnasi
dengan asam oksalat, kemudian diselipkan antara mulut tabung dan tutup kapas.
Penggunaan eter atau silol dimaksudkan untuk mengekstraksi indol dari medium,
karena indol dapat larut dalam eter atau silol, sehingga bila jumlah indol sedikit
dapat dikumpulkan ke permukaan medium dan bereaksi dengan reagens di
permukaan medium berupa cincin merah.
Uji indol ini dilakukan pada dasarnya adalah dengan menginokulasikan
biakan yang akan diujikan untuk melakukan teknik analisis mengidentifikasikan
suatu mikroba.
2. UJI METHYL RED
…..
Pada kaldu gula yang berisi tabung Durham, dapat diketahui kemampuan
mikroorganisme untuk memfermentasikan karbohidrat, tetapi hasil produksi
fermentasi tidak diketahui. Dalam praktikum digunakan media MR – VP untuk
mengetahui fermentasi asam campuran atau fermentasi butana-diol.
Uji Methyl red digunakan untuk menentukan adanya fermentasi asam
campuran. Beberapa bakteri memfermentasikan glukosa dan menghasilkan
berbagai produk yang bersifat asam sehingga akan menurunkan pH media
pertumbuhannya menjadi 5.0 atau lebih rendah. Penambahan indikator pH
“Methyl red” dapat menunjukkan adanya perubahan pH menjadi asam. Methyl
red berwarna merah pada lingkungan dengan pH 4.4 dan berwarna kuning dalam
lingkungan dengan pH 6.2.
GAMBAR. Keterikatan antara pembentukan asam dan waktu inkubasi sewaktu proses fermentasi
campuran mikroorgansime menghasilkan berbagai asam, sehingga menurunkan pH medium menjasi 5.0
atau menjadi lebih rendah.
Fermentasi asam campuran ditentukan dengan cara menumbuhkan

mikroorganisme dalam kaldu yang mengandung glukosa, dan setelah masa
inkubasi menambahkan reagens methyl red ke dalam kaldu. Apabila terjadi
fermentasi asam campuran maka kaldu biakan berubah menjadi kuning setelah
penambahan reagens methyl red. Uji ini sangat berguna dalam identifikasi
kelompok bakteri yang menempati saluran pencernaan.
…..
Pengujian dengan metil merah dilakukan untuk mengetahui apakah bakteri

dapat membentuk asam sedemikian banyaknya sehingga dapat mengubah
indikator metil merah menjadi merah. Beberapa jenis bakteri dapat membentuk
asam tetapi tidak cukup banyak untuk dapat mengubah indikator dan penurunan
pH sampai 5,0, pada umumnya sudah menghambat kelanjutan hidup
mikroorganisme. Sedang bakteri seperti Escherichia coli dapat memberikan hasil
pengujian positif karena dapat menurunkan hasil pengujian positif dan dapat
menurunkan pH sampai di bawah 4,5. Sebaliknya Klebsiella aerogenes
mengadakan dekarboksilasi dan kondensasi asam piruvat untuk membentuk
asetilmetilkarbinol, sehingga pH meningkat, dan bila ditambahkan metil merah
warnanya menjadi kuning, yang berarti hasil pengujian negatif. Pengujian
seharusnya jangan dilakukan sebelum biakan berumur dua hari pada suhu 37ºC
atau tiga hari pada suhu 30ºC. Reaksi ini tidak dapat dipercepat dengan
meningkatkan kadar glukosa dalam medium.
Gambar
Bakteri Escherichia coli.
Pada dasarnya pengerjaan praktikum Uji Methyl Red ini digunakan untuk
mengetahui perbedaan dan menggolongkan, serta memisahkan dua bakteri yang
tergolong mikroba yang patogen, yakni antara Escherichia coli dan bakteri
patogen Enterobacter aerogenes. Dengan menggunakan reagens methyl red yang
dapat mengidentifikasikan kedua bakteri tersebut untuk dapat digunakan dalam
tahapan proses pengerjaan analisa selanjutnya, terutama dalam hal identifikasi
mikroba patogen dari suatu bahan atau sampel.
…..
Proses pengerjan Uji Methyl-red

 Biakan Enterobacter aerogenes
 Kaldu MR – VP (Methyl Red – Voges Proskauer)
 Reagens Methyl Red
Cara mengerjakan :
Hari pertama
1. Menandai tabung kaldu MR – VP dengan biakan bakteri yang digunakan.
2. Menginokulasi kaldu MR – VP dengan biakan bakteri.
3. Menginkubasikan dalam suhu 35ºC selam 5 x 24 jam.
Hari kedua
1. Menambahkan 5 tetes reagens methyl red ke dalam tabung MR – VP.
2. Melaporkan hasilnya.
Uji bersifat positif apabila kaldu berwarna merah setelah penambahan
reagens methyl red.
Uji bersifat negatif apabila kaldu MR – VP berubah menjadi kuning atau
jingga setelah penambahan reagens.
Format Laporan Uji Methyl-Red

Perubahan warna setelah
Mikroorganisme
penambahan reagens
Esherichia coli
Enterobacter aerogenes
…..
3. Uji Voges-Proskauer
Uji ini digunakan dan dilakukan untuk mengidentifikasi mikroorganisme yang
melaksanakan fermentasi 2.3-butanadiol. Bila bakteri memfermentasikan
karbohidrat menjadi 2.3 butanadiol sebagai produk utama, akan terjadi
penumpukan bahan tersebut dalam media pertumbuhan. Penambahan 40% KOH
dan 5% larutan alpha-naphtol dalam ethanol dapat menentukan adanya asetoin
(asetilmetilkarbinol), suatu senyawa pemuka dalam sintesis 2.3-butanadiol. Pada
penambahan KOH, adanya asetoin ditunjukkan oleh perubahan warna kaldu
menjadi merah muda. Perubahan warna ini diperjelas dengan penambahan larutan
alpha-naphtol. Perubahan warna biakan lebih jelas terlihat pada bagian yang
berhubungan dengan udara, karena sebagian 2.3-butanadiol dioksidasikan kembali
menjadi asetoin sehingga memperjelas hasil reaksi. Berdasarkan hal ini tabung
yang berisi tabung dikocok sehingga berbuih, kemudian dibuka tutup tabungnya
dan dimiringkan di atas meja kerja.
Uji Vorges-Proskauer ini sebenarnya merupakan uji tidak langsung untuk
mngetahui adanya 2.3-butanadiol dan selalu didapatkan secara serentak, sehingga
uji VP absah untuk menentukan adanya 2.3-butanadiol.
Cara melakukan pengujian ini adalah sebagai berikut.

1. Reagens-reagens yang diperlukan terdiri dari:
a. larutan alfa-naftol 5% dalam alkohol absolut,
b. larutan KOH 40% yang mengandung 3% kreatin.
2. Dengan pipet 1 ml biakan umur 24 jam dimasukkan ke dalam tabung
Wasserman.
3. Ke dalam tabung ini ditambahkan 0,6 ml larutan alfa-naftol.
4. Selanjutnya ditambahkan 0,2 ml larutan KOH-kreatin.
5. Setelah dikocok campuran itu didiamkan selama 10–30 menit. Bila di
dalam biakan itu terbentuk asetilmetilkarbinol, akan timbul warna merah
pada permukaan medium, dan warna ini akan meluas sampai ke seluruh
campuran.
…..
Penanaman dalam medium pembiakan sitrat (Simmons Citrate Medium)

dimaksudkan untuk mengetahui apakah senyawa sitrat dapat dipakai sebagai satu-
satunya sumber karbon bagi organisme. Dalam medium ini digunakan
natriumsitrat sebagai sumber karbon. Bila natriumsitrat ini dapat diuraikan maka
amonium hidrogenfosfat turut teruraikan dan akan melepaskan NH3 sehingga
menyebabkan medium menjadi alkalis, dan indikator bromtimolbiru berubah dari
hijau menjadi biru. Penanaman dilakukan dengan jarum; penanaman berlebihan
dapat menghasilkan positif palsu.
Proses Pengerjaan Uji Voges-Proskauer

Cara mengerjakani :
Hari pertama
1. Menandai kaldu MR – VP dengan biakan bakteri yang digunakan.
2. Menginokulasi kaldu MR – VP dengan biakan bakteri.
3. Menginkubasikan dalam 35ºC selama 24 – 48 jam.
Hari kedua
1. Menambahkan 10 tetes larutan 40% KOH dan 15 tetes larutan alpha-
naphtol dalam kaldu MR – VP. Kemudian mengocok tabung sehingga
dengan baik meningkatkan aerasi sehingga terjadi peningkatan oksidasi
2.3-butanadiol menjadi asetoin dan memperjelas hasil reaksi uji ini. Hasil
reaksi dapat terlihat paling lambat setelah 30 menit.
2. Melaporkan hasil pengujian yang telah dilakukan. Uji ini bersifat positif
apabila kaldu berwarna merah dalam waktu 30 menit setelah penambahan
reagens. Uji yang bersifat negatif ini apabila kaldu MR – VP tidak
memperlihatkan perubahan warna setelah penambahan reagens.
Format laporan Uji Vorges-Proskauer

Mikroorganisme Perubahan warna setelah penambahan reagens
Esherichia coli
Enterobacter aerogenes
 Uji Pembentukan Oksidase
…..
Pengujian ini dikorelasikan dengan adanya sitokrom dalam kadar yang tinggi,
yang dapat dipakai untuk mengenal bakteri tertentu yang termasuk dalam genus
Pseudomonas dan Neisseria. Oksidasi dari p-aminodimetilanilina menjadi warna
merah tua sampai hitam, dapat dipakai sebagai ukuran aktivitas sitokrom.
Cara pengujiannya adalah sebagai berikut.

a. Biakan ditanam pada lempeng agar bulyon.
b. Pengeraman dilakukan pada suhu30oC sampai timbul pertumbuhan.
c. Permukaan lempeng pembiakan itu disiram dengan p-
aminodimetilanilina.
Bila koloni-koloni segera menjadi berwarna merah tua, menunjukkan bahwa

organisme itu diduga mengandung sitokrom-C. Dalam hal ini perlu diperhatikan
bahwa semua koloni dapat menjadi merah tua dengan reagens oksidase, bila
dibiarkan berada dalam cahaya. Karena itu pengujian harus segera diperiksa
setelah reagens diberikan. Cara lain untuk menguji oksidase, adalah menggunakan
potongan kecil kertas saring yang dicelupkan ke dalam satu persen tetrametil-p-
fenilendiamin dihidroklorida (atau kosalat). Kertas saring yang berwarna biru
tidak boleh dipakai. Dengan ose platina yang bersih dikerok sedikit biakan muda,
dan digosokkan di atas kertas saring. Tes oksidase positif menghasilkan warna
biru dalam waktu 10 detik. Ose yang kotor menghasilkan positif palsu dan biakan
tua tidak dapat dipercaya untuk pengujian ini. Karena telurit menghambat
oksidase.
Pada dasarnya uji ini berfungsi untuk menentukan adanya oksidase sitokrom
yang ditemukan pada mikroorganisme tertentu. Uji ini berguna dalam identifikasi
mikroorganisme patogen seperti misalnya Neisseria gonorhoea dan Pseudomonas
aerogenusa. Kedua bakteri ini memberikan hasil positif dalam uji oksidase. Di
dalammya terdapat perubahan warna yang disebabkan oksidase sitokrom
mengoksidasikan oksidase larutan reagens. Reagens yang dioksidasikan berwarna
hitam,namun jika ada reduksi tidak terjadi perubahan warna.
…..
 Uji Katalase
Katalase adalah enzim yang mengkatalisasikan penguraian H 2O2 (Hidrogen
Peroksida) menjadi air dan O2 (Oksigen). Hidrogen Peroksida bersifat toksik
terhadap sel karena bahan ini menginaktivasikan enzim dalam sel. Hidrogen
peroksida terbentuk sewaktu metabolisme aerob, sehingga mikroorganisme yang
tumbuh dalam lingkungan aerob harus menguraikan bahan toksik tersebut.
Katalase adalah salah satu enzim yang digunakan mikroorganisme untuk
menguraikan Hidrogen peroksida, enzim lainya yang dapat menguraikan
Hidrogen peroksida adalah peroksidase. Pada penguraian hidrogen peroskidase
oleh peroksidase tidak dihasilkan oksigen.
Uji katalse berguna dalam identifikasi kelompok bakteri/mikroba tertentu.
Pada bakteri berbentuk kokus, uji katalase digunakan untuk membedakan
Staphylococcus dan Streptococcus. Kelompok Streptococcus ini bersifat katalase-
negatif sedangkan Staphylococcus ini bersifat katalase-positif. Penentuan adanya
katalase diuji dengan larutan 3% H2O2 pada koloni terpisah. Pada bakteri yang
bersifat katalase-positif terlihat pembentukan gelembung udara sekitar koloni.
4. UJI CITRAT
Uji sitrat digunakan untuk melihat kemampuan mikroorganisme menggunakan
sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi. Untuk uji ini dapat
digunakan medium sitrat – koser berupa medium cair atau medium sitrat –
Simmon berupa medium padat. Simmon’s sitrate agar merupakan medium sintetik
dengan Na sitrat sebagai satu-satunya umber karbon, NH4+ sebagai sumber N dan
brom thymol blue sebagai indikator pH, sedangkan medium sitrat – Koser tidak
mengandung indikator. Apabila mikroorganisme mampu menggunakan sitrat,
maka asam akan dihilangkan dari medium biakan, sehingga menyebabkan
peningkatan pH dan mengubah warna medium dari hijau menjadi biru. Perubahan
dari warna hijau menjadi biru ini menunjukkan bahwa mikroorganisme mampu
menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon. Sedangkan pada
…..
medium sitrat – Koser kemampuan menggunakan sitrat dilakukan dan

ditunjukkan oleh kekeruhan yang menandakan adanya pertumbuhan.
Proses Pengerjaan Uji Citrat

 Biakan aerogenes
 Biakan vulgaris
 Biakan Pseudomonas aeruginosa
 Media biakan Simmons citrate agar.
Cara mengerjakan :
Hari pertama
1. Menandai tabung Simmon’s citrate agar dengan nama, tanggal, dan nama
mikroorganisme yang akan diujikan.
2. Menginokulasi tabung agar dengan inokulum yang tiptis. Inokulum yang
tebal kadangkala menyebabkan mikroorganisme seakan-akan dapat
tumbuh dalam simmon’s citrate agar, sehingga hasil yang tidak benar.
3. Menginkubasi di suhu 35ºC selam 48 jam.
Hari kedua
1. Memperhatikan atau mengamati perubahan warna dengan melihat
pertubuhan dan perubahan warna dari warna hijau ke warna biru.
2. Melaporkan hail pengujian yang telah dilakukan
Format Laporan Uji Citrat
Warna setelah Kesimpulan hasil
Mikroorganisme
masa inkubasi pengujian
E.coli
E.aerogenes
P.vulgaris
P.aeroginusa
2.3.3 PENGGUNAAN CITRAT
…..
Uji untuk melihat penggunaan sitrat, hidrolisis urea dan likuifikasi gelatin
sangat berguna dalam pencirian mikroorganisme. Penggunaan sitrat merupakan
salah satu uji dari deretan Uji IMVIC yang digunakan dalam pencirian bakteri
koliform. Hidrolisis urea sering kali digunakan untuk membedakan Salmonella
dari Proteus yang merupakan kuman patogen pada saluran urinaria, namun dapat
pula ditemukan dalam spesimen sebagai kuman non-patogen. Hidrolisis gelatin
sering digunakan dalam membedakan spesies tertentu Pseudomonas dan
mikroorganisme dalam saluran pencernaan.
Hidrolisis Gelatin
Gelatin adalah protein yang diperoleh pada waktu merebus tulang, tulang
rawan atau tenunan ikat hewani lainnya. Protein ini bila didinginkan membentuk
“gel”. Beberapa mikroorganisme tertenu mampu menguraikan molekul sehingga
asam amino yang dihasilkan dapat digunakan sebagai zat hara. Hidrolisis gelatin
oleh mikroorganisme tersebut dikatalisasikan oleh eksoenzim yang disebut
gelatinase. Gelatin yang telah dicerna tidak mampu membentuk gel dan cenderung
bersifat cair. Kemampuan untuk mencernakan gelatin dapat digunakan dalam
pencirian mikroorganisme. Sebagai contoh, serratia marcescens dapat dibedakan
dari Klebsiella pneumonia atau Escherichia coli bedasarkan kemampuan
mencernakan gelatin. Hidrolisis gelatin dapat pula digunakan untuk mengetahui
sifat patogen galur mikroorganisme karena sering kali dikaitkan dengan produksi
enzim untuk menguraikan bahan pengikat tenunan untuk memudahkan
penyebaran mikroorganisme.
Dalam Laboratorium, pencairan gelatin diuji dengan cara menusukkan
mikroorganisme yang akan diuji ke dalam media semi-padat yang mengandung
nutrient broth dan gelatin. Media ini diinkubasikan dan diamati kemampuan
mikroorganisme mencairkan gelatin. Pada suhu 35ºC, gelatin dapat mencair
apabila diinokulasikan dengan mikroorganisme yang mampu mapun tidak mampu
mencairkan gelatin. Berdasarkan hal tersebut, gelatin harus dimasukkan ke dalam
lemari es selam 30 menit untuk mengetahui kemampuan mikroorganisme
mencairkan gelatin. Apabila mikroorganisme mampu mencerna gelatin, maka
…..
media semi-padat gelatin tetap bersifat cair setelah dikeluarkan dari lemari es.
Sebaliknya bila mikroorganisme tidak mampu mencerna gelatin, maka media
semi-padat gelatin membeku kembali, setelah dikeluarkan dari lemari es.
Proses pengerjaan Hidrolisis Gelatin

 Biakan E.coli
 Biakan B.subtillis
 Biakan S.marcescens
 Media biakan gelatin
Cara mengerjakan :
Hari pertama
1. Menandai tabung gelatin dengan nama, tanggal pembuatan,
mikroorganisme yang akan diujikan.
2. Media diinokulasikan dengan cara menusukkan mikroorganisme yang
akan diujikan sedalam ¾ bagian dari lapisan permukaan.
3. Menginkubasikan pada suhu 35ºC selam 24 jam.
Hari kedua
1. Mengamati pertumbuhan dalam media gelatin, kemudian masukkan
tabung ke dalam lemari es selama 30 menit.
2. Mengamati pencairan gelatin setelah dikelauarkan dari lemari es.
Pencairan gelatin dapat dilihat dengan memiringkan tabung. Apabila
gelatin tetap dalam keadaan cair, maka mikroorganisme mampu
mencernakan atau menghidrolisiskan gelatin. Beberapa mikroorganisme
mampu mencernakan gelatin namun memerlukan waktu yang relatif lama.
Ini berarti bahwa medium gelatin harus diinkubasikan kembali selama 1
minggu sebelum dapat dinyatakan pengujian bersifat negatif. Laporkan.
…..
Uji Pencairan Gelatin

a) Medium pembiakan tegak dari gelatin nutrisi, tiogikolat gelatin medium,
dieramkan selama 7 hari pada suhu kamar, kemudian diperhatikan apakah
terjadi pencairan gelatin. Untuk organisme yang tumbuh lambat pada suhu
gelatin menjadi cair, diikutsertakan tabung kontrol dengan gelatin yang
tidak ditanam, dan setelah pengeraman kedua tabung diletakkan dalam
lemari es semalaman. Tabung kontrol harus membeku.
b) Medium agar gelatin ditanam dan dieramkan semalam pada suhu 37 oC.
Kemudian lempeng pembiakan itu disiram dengan larutan jenuh
ammonium sulfat. Organisme yang menghasilkan gelatinase akan
memperlihatkan lingkaran di sekitar koloni.
Hidrolisis Urea
Beberapa mikroorganisme mampu menghasilkan enzim urease yang
menguraikan urea menjadi ammonium dan CO2. aktivitas enzim urease ini dapat
diamati dengan menumbuhkan mikroorganisme dalam media biakan yang
mengandung urea dan indikator pH (biasanya phenol-red). Apabila
dihidrolisiskan, NH4+ terakumulasi dlam media menjadi basa. Perubahan warna
dari merah-jingga menjadi merah-ungu merupakan petunjuk terjadinya hidrolisis
urea. Urea bersifat stabil, sehingga media urea tidak dapat disterilkan dengan
autoclave. Sterilisasi dilakukan dengan cara filtrasi (penyaringan).
Genus Proteus dapat dibedakan dari beberapa bakteri Gram negatif lain
karena kesanggupannya menghasilkan banyak enzim urease. Bila dalam biakan
terdapat urease, urea dihidrolisis, sehingga terbentuk amonia yang mengubah
warna indikator dari kuning menjadi merah.
Reaksi Hidrolisis urea
…..
BAB III
PENUTUP
3.1 Kesimpulan
Dalam kehidupan yang kita jalani ini alangkah baiknya kita dapat melakukan
suatu kegiatan yang bermanfaat dan berguna bagi orang lain kelak. Pastinya
dengan menggunakan metode yang tepat dan benar. Dengan pembelajaran
mikrobiologi ini kami dapat memahami tentang arti pentingnya sebuah usaha
yang baik dan terarah. Dengan metode TPC, MPN, dan Uji Bonterey yang telah
difahami dan dipelajari, maka kita akan dapat membantu khalayak luas dan ramai,
khususnya masyarakat disekitar kita ataupun keluarga kita, dan umumnya adalah
seluruh umat manusia ini, tentunya dalam perihal kaitannya dengan masalah
mikroorganisme. Dengan usaha dan niat yang baik serta ilmu pengetahuan yang
telah diperoleh maka dapat meningkatkan kefahaman dan wawasan tentang
kegiatan praktikum yang akan dilakukan di semester 5 ini.
3.2 Saran
Memberikan pengetahuan serta wawasan kepada masyarakat atau siswa
tentang pembelajaran yang terdapat di semester 5 ini, dalam suatu pokok
pembahasan yang dapat digunakan atau dimanfaatkan sebagai pegangan dalam
pengerjaan praktikum mikrobiologi. Serta menyampaikan bahwa TPC, MPN, dan
Uji Bonterey ini merupakan jenis praktikum terapan yang dapat diaplikasikan di
dalam kehidupan nyata dan merealisasikannya dalam dunia ini.
…..
DAFTAR PUSTAKA
Bibiana. Praktikum Mikrobiologi. Bandung.

Sumber : www.google.com
www.wikipedia.com
SNI (Standar Nasional Indonesia) dan BSN (Badan Standar Nasional) tentang
mikroorganisme. 2008.
…..
LAMPIRAN
Lampiran pekerjaan :
• Dimas Seto Prasetyo :
Mencari bahan, mengetik, editing, konsep makalah, print.
• Hanifa Handayani :
Mencari bahan, mengetik, print, dan jilid.
…..

TPC MPN Uji Bonterey

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Judul Asli

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

TPC MPN Uji Bonterey

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

TPC, MPN, Uji Bonterey

SEKOLAH MENENGAH KEJURUAN NEGERI 13 BANDUNG

Bandung, Agustus 2009

Kata Pengantar …………………………………………………………….. i

BAB III PENUTUP

Daftar Pustaka ………………………………………………………........ 48

a) Total Plate Count (TPC)

biakan tidak mengandung biotin, maka hanyalah mikroorganisme yang tidak

b) Most Probable Number (MPN)

1) Uji IMVIC ( Indol – Methyl-red – Voges-Praskuaer – Citrate).

Proses pengujian yang dilakukan ini pada dasarnya adalah untuk

2.1 Perhitungan Mikroba dengan TPC

Dan seterusnya sampai mencapai larutan dengan konsentrasi terendah, hal

159 x 103 = 1,59 x 105 sel/mL

Cara pemgenceran berikutnya lebih diperjelas, sehingga pertumbuhan koloni

(Gambar. Cara perhitungan jumlah mikroba dengan pengenceran)

adapun metode yang lain dan dapat digunakan :

Gambar. cara perhitungan dengan pengenceran sederhana

Untuk menentukan jumlah bakteri dapat digunakan beberapa cara pengerjaan :

Perhitungan bakteri secara keseluruhan.

b. Menghitung dengan cara kekeruhan

2.1.1 Pengenalan dasar praktikum TPC (Total Plate Count)

a. Jenis-jenis sampel untuk TPC

b. Pelarut yang digunakan

c. Pengencer dan media yang digunakan

d. Preparasi sampel untuk TPC

 Preparasi untuk sampel padat (berlaku juga untuk yang kental)

1) Menyediakan kertas alumunium foil untuk sampling.

2.1.2 Praktikum TPC (Angka Lempeng Total)

c) Setelah agar menjadi padat, untuk penentuan mikroorganisme aerob

Metoda cawan agar sebar /spread plate method

yang ditetapkan sebelumnya, maka hal yang harus dilakukan adalah

2.2 Analisis Metode MPN (Most Probable Number)

2.2.1 Analisis Koliform Dengan MPN

Koliform memfermentasikan laktosa dengan pembentukan asam dan gas dalam

Cara pengerjaan uji lengkap terlihat pada gambar di bawah ini.

Gambar. Metode MPN

2.2.2 Praktikum MPN secara umum :

4. Menginkubasi kaldu BGBL yaitu pada suhu 35ºC selama 48 jam.

Format laporan pengerjaan analisis air metode MPN

Tuliskan hasil sebagai berikut :

Indeks MPN metode 5 tabung

0-0-0 <2 4-2-0 22

2.2.3 Pengujian Escherichia coli.

(Gambar. Bakteri Escherichia coli sebagai

2.2.4 Analisis Kualitas dan Sanitasi Air

Perhitungan mikroba untuk keperluan nilai IPB harus dilakukan secara

Secara umum pengukuran coli hanya dilakukan sampai Tes Presumtif

Dengan adanya siklus biologis ini kita dapat memperkirakan berbagai

(Gambar. Siklus Biologis-dinamis di dalam perairan)

Mikroorganisme sebagai indikator kualitas air

Ciri mikroorganisme indikator

2.3 UJI BONTEREY

2.3.1 FERMENTASI KARBOHIDRAT

Gambar. Reaksi Fermentasi Karbohidrat

1) Jenis-jenis gula tersebut dimasukkan ke dalam medium pembiakan cair

5) Cara menanam organisme ke dalam medium gula ini dilakukan sekaligus

Perlu diperhatikan dalam hal penggunaan indikator, bahwa pemilihannya

1. Uji fermentasi karbohidrat

tabung kontrol tidak terjadi pembentukan gas. Pembentukan gas di dalam

Contoh format laporan untuk uji Fermentasi karbohidrat

Beri tanda hasil reaksi sebagai berikut :

Banyak dilakukan untuk membedakan Enterobacter aerogenes dan