ENUMERASI BAKTERI Ralstonia Solanacearum

(Laporan Praktikum Penyakit Tanaman Dan Pengendaliannya)

Oleh:
ABDI NORGANI
1810512310002
KELOMPOK 20

JURUSAN AGROEKOTEKNOLOGI
FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS LAMBUNG MANGKURAT
BANJARBARU
2020
 DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR ISI .............................................................................................. i

DAFTAR TABEL....................................................................................... ii

PENDAHULUAN ..................................................................................... 1

Latar Belakang .................................................................................. 1

Tujuan ............................................................................................... 3

TINJAUAN PUSTAKA ............................................................................. 4

Enumerasi.......................................................................................... 4
Enumerasi Bakteri............................................................................. 5
Teknik Enumerasi.............................................................................. 6
Metode Enumerasi............................................................................. 7

BAHAN DAN METODE .......................................................................... 10

Bahan dan Alat................................................................................... 10

Waktu dan Tempat............................................................................. 11
Prosedur Kerja.................................................................................. 11

HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................................. 12

Hasil................................................................................................... 12
Pembahasan....................................................................................... 12

KESIMPULAN DAN SARAN………………………………………….. 15

Kesimpulan………………………………………………………... . 15
Saran……………………………………………………………….. 15

DAFTAR PUSTAKA
 DAFTAR TABEL

Nomor Halaman

1. Enumerasi Bakteri........................................................................ 12
 PENDAHULUAN

Latar Belakang

Mikrobia dapat dinggal dimana-mana atau yang kita kenal dengan istilah

kosmopolitan (tanah, air dan sebagai simbiosis dari organisme lain), serta

mikrobia bersifat mikroskopis, yang hanya bisa dilihat dengan menggunakan

mikroskop, salah satunya adalah bakteri. Mikrobia dapat tumbuh dan berkembang

dengan sangat pesat di alam. Bakteri merupakan makhluk hidup yang sering

ditumbuhkan dalam medium untuk tujuan suatu penelitian. Pertumbuhan dan

perkembangan mikrobia berbentuk koloni-koloni yang sulit dihitung jumlah

bakterinya (Hastuti dan Ginting, 2007).

Pertumbuhan mikroba dapat diketahui dengan adanya pertambahan

ukuran, pertambahan jumlah, dan perubahan total kandungan materi selular dari

mikroba di dalam suatu populasi. Mengingat hal tersebut, terjadinya pertumbuhan

mikroba dapat diketahui dengan melakukan perhitungan terhadap jumlahnya atau

kandungan biomassanya. Enumerasi mikroba adalah teknik yang digunakan untuk

mengestimasi jumlah mikroorganisme dalam suatu bahan atau sampel. Pengertian

enumerasi mikorba tersebut menyatakan bahwa jumlah mikroorganisme dalam

suatu bahan sangat bervariasi dan sulit diketahui dengan pasti, sehingga

diperlukan cara perhitungan tertentu untuk mengetahui jumlah mikroorganisme

dalam suatu bahan (Aulia et al., 2015).

Teknik enumerasi mikroba ada dua yakni metode enumerasi mikroba

secara langsung dan cara tidak langsung. Enumerasi mikroorganisme secara

langsung merupakan cara perhitungan terhadap total dari jumlah sel mikroba
 2
dalam suatu sampel secara mikroskopik. Enumerasi secara langsung dapat

dilakukan dengan dua metode, yaitu metode perhitungan dengan kamar hitung

(Counting chamber) dan perhitungan dengan preparat olesan (Smear count).

Perhitungan mikroorganisme secara tidak langsung mempunyai berbagai metode

yang berbeda. Metode-metode yang dapat dilakukan untuk menghitung

mikroorganisme secara tidak langsung antara lain dengan turbidometer, dengan

cara kimia, dengan cara volume total, dengan cara berat kering, dengan kultur

tabung putar, dan enumerasi mikroba dengan metode total plate count (TPC).

Keuntungan menggunakan metode enumerasi mikroorganisme secara tidak

langsung adalah perhitungan hanya kepada mikroba yang masih hidup sehingga

hasilnya lebih akurat. Kekurangan dalam metode perhitungan tidak langsung

adalah membutuhkan waktu inkubasi yang lama sehingga hasilnya tidak didapat

dengan waktu yang cepat (Waluyo, 2004).

Enumerasi bakteri adalah teknik perhitungan jumlah mikroba dalam suatu

media tanpa mengidentifikasi jenis mikroba (bakteri, jamur, yeast) yang bertujuan

untuk menentukan jumlah sel dari suatu kultur bakteri secara kuantitatif.

Penetapan jumlah bakteri dilakukan dengan menghitung jumlah sel bakteri yang

mampu membentuk koloni di dalam media biakan atau membentuk suspense

dalam larutan biak. Analisis kuantitatif mikrobiologi pada bahan pangan ini

penting dilakukan untuk mengetahui mutu bahan pangan dan menghitung proses

pengawetan yang akan diterapkan pada bahan pangan tersebut (Pelczar dan Chan,

2006).

Tujuan
 3
Tujuan praktikum ini adalah untuk mengetahui cara enumerasi bakteri dan

metode sebar bakteri.

 TINJAUAN PUSTAKA

Enumerasi

Enumerasi adalah teknik perhitungan jumlah mikroba dalam suatu media

tanpa mengidentifikasi jenis mikroba (bakteri, jamur, yeast) yang bertujuan untuk

menentukan jumlah sel dari suatu kultur bakteri secara. Penetapan jumlah bakteri

dilakukan dengan menghitung jumlah sel dari suatu kultur bakteri yang mampu

membentuk koloni di dalam media biakan atau membentuk suspesi dalam larutan

biak. Analisis kuantitatif mikrobiologi pada bahan pangan ini penting dilakukan

untuk mengetahui mutu bahan pangan dan menghitung proses pengawetan yang

akan diterapkan pada bahan pagan tersebut (Ramona et al., 2016).

Menurut Waluyo (2004), ada beberapa cara yang dapat digunakan untuk

mengukur atau menghitung jumlah jasad renik, yaitu dengan cara perhitungan

jumlah sel (metode cawan hitung dengan pengenceran, hitungan mikroskopik dan

MPN), dengan cara perhitungan masa sel secara langsung (metode volumetrik,

gravimetrik dan turbidimetrik atau kekeruhan), dan dengan cara perhitungan

massa sel secara tidak langsung (metode analisis komponen, analisis produk

katabolisme dan analisis konsumsi nutrien).

Menurut Pelczar dan Chan (2006), koloni yang tumbuh tampak oleh mata

bugil dapat dihitung dengan asumsi bahwa satu koloni yang tumbuh berasal dari

satu sel. Dalam metode ini perhitungan yang paling valid secara statistik adalah

perhitungan koloni pada cawan yang memiliki koloni berkisar diantara 30-300

CFU/mL.
 5
Enumerasi Bakteri

Enumerasi bakteri adalah teknik perhitungan jumlah mikroba dalam suatu

media tanpa mengidentifikasi jenis mikroba (bakteri, jamur, yeast) yang bertujuan

untuk menentukan jumlah sel dari suatu kultur bakteri secara kuantitatif.

Penetapan jumlah bakteri dilakukan dengan menghitung jumlah sel bakteri yang

mampu membentuk koloni di dalam media biakan atau membentuk suspense

dalam larutan biak. Analisis kuantitatif mikrobiologi pada bahan pangan ini

penting dilakukan untuk mengetahui mutu bahan pangan dan menghitung proses

pengawetan yang akan diterapkan pada bahan pangan tersebut (Pelczar dan Chan,

2006).

Menurut Aulia et al. (2015), indek aktivitas dan nilai biomassa

mikroorganisme dapat ditunjukkan dengan mengetahui jumlah mikroorganisme

dalam perairan tersebut. Untuk mengetahui jumlah mikroorganisme dalam suatu

perairan ada dua cara dasar yaitu, perhitungan mikroorganisme secara langsung

(direct count), dan perhitungan bakteri secara tidak langsung (indirect count).

Perhitungan bakteri yang dilakukan ada dua jenis media yang dipakai

yaitu, Media NA dan Media MC, perbedaan warna media dapat dilihat dengan

mata telanjang yaitu media NA warna kuning bening sedangkan media MC merah

bening. Adanya pengenceran adalah sebagai pemecah koloni bakteri sehingga

bakteri terencerkan dan kemudian diambil untuk tanam pada media, ada

pengenceran sehingga jumlah pertumbuhan pada tiap pengenceran berbeda-beda

dan ini juga dipengaruhi oleh media dan kontaminasi (Waluyo, 2004).

Teknik Enumerasi
 6
Perhitungan jumlah mikroba dapat dilakukan dengan perhitungan

langsung maupun tidak langsung. Perhitungan secara langsung dapat mengetahui

beberapa jumlah mikroorganisme pada suatu bahan pada saat tertentu tanpa

memberikan perlakuan terlebih dahulu, sedangkan jumlah orgnisme yang

diketahui dari cara tidak langsung terlebih dahulu harus memberikan perlakuan

tertentu sebelum dilakukan perhitungan. Perhitungan secara langsung, dapat

dilakukan dengan beberapa cara antara lain, adalah dengan membuat preparat dari

suatu bahan (preparat sederhana diwarnai atau tidak diwarnai) dan penggunaan

ruang hitung (counting chamber) (Hastuti dan Ginting, 2007).

Perhitungan cara tidak langsung hanya untuk mengetahui jumlah

mikroorganisme pada suatu bahan yang masih hidup saja (viable count). Dalam

pelaksanaannya, ada beberapa cara yaitu: perhitungan pada cawan petri (total

plate count/ TPC), perhitungan melalui pengenceran, perhitungan jumlah terkecil

atau terdekat (MPN methode), dan calorimeter (cara kekeruhan atau turbidimetri)

(Hastuti dan Ginting, 2007).

Menurut Waluyo (2004) cara untuk menentukan jumlah bakteri dalam

suatu medium dapat dilakukan dengan jumlah bakteri secara keseluruhan (tottal

cell counts), bila menggunakan cara ini maka semua bakteri dalam medium

tersebut akan terhitung baik yang hidup maupun mati dan jumlah bakteri hidup

(viable counts), bila menggunakan cara ini maka sel hidup daja yang di hitung

sehingga lebih akurat.

Perhitungan secara langsung dilakukan secara mikroskopis, yaitu dengan

menghitung sel dibawah mikroskop. Setiap sel dalam suspensi contoh dengan

volume yang sangat sedikit dan telah diukur secara teliti, diukur dengan
 7
menggunakan slide khusus yaitu kotak penghitung (counting chamber). Volume

cairan yang terdapat pada tiap kotak kecil pada kotak hitung dapat diketahui

secara pasti sehingga jumlah sel dalam tiap kotak dapat terlihat dan dihitung, jadi

jumlah sel/ml larutan sel dapat diketahui (Aulia et al., 2015).

Perhitungan secara tak langsung dilakukan secara non mikroskopis,

Prinsip perhitungan secara tak langsung ini adalah jika mikroba yang masih hidup

ditumbuhkan pada medium agar, maka sel mikroba tersebut akan berkembang

biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dengan mata tanpa

menggunakan mikroskop (Aulia et al., 2015).

Metode Enumerasi

Menurut Aulia et al. (2015), perhitungan mikrobia secara langsung

dilakukan dengan cara menghitung jumlah sel yang hidup dan yang mati.

Terdapat beberapa cara/metode yang dapat dilakukan, antara lain, Counting

chamber yaitu pada perhitungan ini menggunakan haemocytometer dimana 1 tetes

suspensi biakan mikrobia pada alat ini ditutupi dengan gelas penutup dan diamati

dibawah mikroskop. Jumlah sel mikrobia tiap cc dapat ditentukan dengan cara

menentukan jumlah dari sel rata-rata pada tiap petak yang volumenya telah

diketahui.

Pengecatan dan pengamatan mikroskopik, pada cara ini, preparat

mikroskopik dibuat pada gelas benda kemudian suspensi bahan atau biakan

mikrobia yang volumenya telah diketahui diratakan diatas gelas benda pada luas

tertentu. Preparat di cat dan dihitung dengan cara mengukur garis tengahnya
 8
sehingga jumlah mikrobia yang terdapat pada gelas benda dapat dihitung

seluruhnya (Waluyo, 2004).

Filter membrane, pada cara ini, suspensi bahan atau biakan mikrobia

disaring, lalu disaring lagi dengan menggunakan filter membran yang telah

disterilkan. Jumlah sel dari volume yang disaring dapat dihitung dari jumlah sel

rata-rata tiap kesatuan luas pada filter membrane (Waluyo, 2004).

Metode yang digunakan dalam perhitungan tidak langsung yaitu metode

perhitungan cawan. Prinsip perhitungan cawan ini adalah jika mikroba yang

masih hidup ditumbuhkan pada medium agar, maka sel mikroba tersebut akan

berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dengan mata

tanpa menggunakan mikroskop. Metode hitungan cawan merupakan cara yang

paling sensitive untuk menghitung jumlah mikroba karena adanya alasan yaitu

hanya sel yang hidup dihitung, beberapa jenis mikroba dapat dihitung sekaligus,

dapat digunakan untuk isolasi atau identifikasi mikroba karena koloni yang

terbentuk mungkin berasal dari satu sel. Metode hitungan cawan dibagi menjadi

dua yaitu metode tuang (Pour plate) dan metode permukaan (Surface plate)

(Waluyo, 2004).

Jumlah masing-masing cawan diamati setelah inkubasi, cawan yang dipilih

untuk penghitungan koloni ialah yang mengandung antara 30 sampai 300 koloni,

karena jumlah mikroorganisme dalam sampel tidak diketahui sebelumnya, maka

untuk memperoleh sekurang-kurangnya satu cawan yang mengandung koloni

dalam jumlah yang memenuhi syarat tersebut maka harus dilakukan sederetan

pengenceran dan pencawanan. Jumlah organisme yang terdapat dalam sampel asal

 9
ditentukan dengan mengalikan jumlah koloni yang terbentuk dengan faktor

pengenceran pada cawan yang bersangkutan (Waluyo, 2004).

Metode viable count atau disebut dengan metode TPC (Total Plate Count)

merupakan kultur yang diencerkan sampai batas yang diinginkan. Kultur encer

ditumbuhkan kembali pada media, sehingga diharapkan setiap sel tumbuh menjadi

satu koloni, biasanya 4-12 jam. Namun, cara ini memiliki keterbatasan yaitu

jumlah sel terhitung biasanya lebih kecil dari sebenarnya dan tidak dapat

diaplikasikan pada bakteri yang tumbuh lambat. Faktor yang mempengaruhi

perhitungan bakteri dengan metode ini adalah jumlah sel bakteri hatus mendekati

kelipatan 10 pada setiap pengencerannya. Jika tidak, maka perhitungan dianggap

gagal (Waluyo, 2004).

 BAHAN DAN METODE

Bahan dan Alat

Bahan

Bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah sebagai berikut :

Media PDA, digunakan sebagai media pertumbuhan cendawan.

Alkohol, digunakan untuk menyeterilkan alat yang digunakan dalam

praktikum.

Aquades, digunakan untuk larutan dalam pengenceran.

Isolat bakteri Ralstonia, digunakan sebagai bahan untuk pengenceran

bakteri.

Alat

Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah sebagai berikut :

Cawan petri, digunakan sebagai wadah media PDA.

Mikropipet, digunakan untuk mengambil larutan pada pengenceran.

Labu erlenmeyer, digunakan untuk wadah aquades.

Segitiga perata, digunakan untuk meratakan sampel bakteri dalam cawan

petri.

Vortex, digunakan untuk menghomogenkan larutan pengenceran.

Rak tabung reaksi, digunakan sebagai tempat peletakkan tabung reaksi.

Bunsen, digunakan untuk memanaskan alat-alat laboratorium agar tetap

steril.

Cling warp, digunakan untuk melapisi samping cawan petri.

 11
Tabung reaksi, digunakan untuk wadah pengenceran.

Waktu dan tempat

Praktikum ini dilaksanakan pada hari Kamis tanggal 9 April 2020 pukul

14.50 WITA - selesai Tempat pelaksanaan di Laboratorium Produksi Jurusan

Agroekoteknologi Fakultas Universitas Lambung Mangkurat Banjarbaru.

Pelaksanaan

1. Mempersiapkan bahan dan alat.

2. Mengambil 1 mL aquades dan memasukkanya ke dalam cawan petri yang

berisi media PDA dan isolat bakteri ralstonia.

3. Mengambil larutan aquades pada cawan tadi sebanyak 1 mL dan

memindahkannya ke dalam tabung reaksi dengan menggunakan mikropipet

dan di vortex.

4. Mengambil kembali larutan pengenceran pada tabung reaksi sebanyak 1 mL

dan memasukkannya ke pengenceran tabung reaksi selanjutnya hingga 9 kali

(9-10) dan divortex.

5. Mengambil suspensi larutan pengenceran 10-9 sebanyak 0,1 mL dan

memindahkannya ke media yang baru pada cawan petri dan meratakannya

dengan segitiga perata, lalu di beri cling warp.

6. Menginkubasi sampel selama 24 jam.

 HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil

Berdasarkan praktikum yang telah dilaksanakan didapatkan hasil berupa

tabel sebagai berikut :

Tabel 1. Enumerasi bakteri

No Gambar Keterangan

1. Hari pertama jumlah koloni 248

2. Hari kedua jumlah koloni 253

Pembahasan

Pada praktikum enumerasi bakteri Ralstonia solanacearum ini dapat kita

ketahui bahwa dengan menggunakan metode TPC (Total Plate Count) dan

prosedur kerja dalam proses enumerasi bakteri. Dimulai dari mempersiapkan alat

dan bahan, menyemprotkan alkohol ke ruangan dan anggota badan terkait

praktikum agar ruangan dan tangan steril, menyalakan lampu bunsen, hingga

melakukan proses pengenceran pada bakteri Ralstonia solanacearum hingga

 13
prosedurnya selesai. Pengenceran dilakukan hingga 10−9. Menurut Dwidjoseputro

(2005), pengenceran yaitu suatu cara atau metoda yang diterapkan pada suatu

senyawa dengan jalan menambahkan pelarut yang bersifat netral, lazim dipakai

yaitu aquadest dalam jumlah tertentu. Penambahan pelarut dalam suatu senyawa

dan berakibat menurunnya kadar kepekatan atau tingkat konsentrasi dari senyawa

yang dilarutkan/diencerkan.

Langkah yang pertama dilakukan setelah menyiapkan alat dan bahan

adalah mengambil air aquades sebanyak 1 mL dari labu erlenmeyer dengan

menggunakan mikropipet, lalu memasukkan air aquades ke dalam cawan petri

yang berisi media PDA (Potato Dextrose Agar) dan juga isolat bakteri Ralstonia,

kemudian diratakan dengan menggunakan segitiga perata yang sudah disterilkan

dengan alkohol dan dibakar diatas api bunsen (didinginkan sebentar segitiga

perata dengan cara diayunkan pelan-pelan) lalu diratakan ke dalam media yang

ada dicawan petri. Langkah selanjutnya yaitu mengambil larutan aquades dengan

mikropipet dalam cawan petri tadi sebanyak 1 mL dan memindahkannya ke dalam

tabung reaksi pengenceran 10-1 yang berisi aquades 9 mL, setelah selesai lalu

tabung reaksi di vortex hingga homogen. Kemudian mengambil kembali larutan

dalam tabung reaksi 10-1 dengan mikropipet sebanyak 1 mL dan memasukkannya

ke dalam tabung reaksi pengenceran 10-2 dan divortex hingga homogen.

Langkah-langkah tersebut dilakukan hingga tabung reaksi pengenceran 10-9 yang

artinya dilakukan sebanyak 9 kali.

Setelah proses pengenceran selesai dilakukan, langkah selanjutnya yaitu

mengambil suspensi pada pengenceran 10-9 sebanyak 0,1 mL dan

memindahkannya ke media PDA baru yang telah disediakan didalam cawan petri.
 14
Kemudian suspensi yang dituang pada media PDA tersebut diratakan dengan

menggunakan segitiga perata yang telah disterilkan. Dan langkah terakhir adalah

melapisi cawan petri dengan cling warp dan cawan petri tersebut diinkubasi

selama 24 jam. Pengamatan baru bisa dilakukan stelah 24 jam inkubasi.

Prinsip pengenceran adalah menurunkan jumlah sehingga semakin banyak

jumlah pengenceran yang dilakukan, semakin sedikit jumlah mikroba, dimana

suatu saat didapat hanya satu mikroba pada satu media. Pengenceran bertingkat

yaitu memperkecil atau mengurangi jumlah mikroba yang tersuspensi dalam

cairan. Penentuan besarnya atau banyaknya tingkat pengenceran tergantung

kepada perkiraan jumlah mikroba dalam sampel. Digunakan perbandingan 1 : 9

untuk sampel dan pengenceran pertama dan selanjutnya, sehingga pengenceran

berikutnya mengandung 1/10 sel mikroorganisma dari pengenceran sebelumnya

(Dwyana Z, 2011).

Setelah di inkubasi selama 24 jam, maka pada hari pertama pengamatan

cawan tersebut terdapat bakteri berjumlah 248, pada hari kedua pengamatan

terdapat 253 jumlah bakteri yang ada di cawan petri, ternyata pada dua hari

tersebut terjadi pertambahan jumlah bakteri Rasltonia secara signitifikan.

 KESIMPULAN DAN SARAN

Kesimpulan

Dari percobaan yang telah dilakukan, maka dapat diambil kesimpulan

sebagai berikut:

1. Jumlah bakteri Ralstonia yang di enumerasi terbanyak pada hari kedua yaitu

253 jumlah bakteri yang ada dicawan petri.

2. Metode enumerasi Ralstonia yang digunakan adalah metode TPT (Total

Plate Count) yaitu koloni bakteri yang berkembang langsung dapat dilihat

dan dihitung tanpa menggunakan mikroskop/alat bantu.

Saran

Saran untuk praktikum ini adalah untuk respon yang dilihat selain bakteri

ralstonia, sarannya bakterii atau mikroba yang lain sebagai perbandingan respon.
 DAFTAR PUSTAKA

Dwidjoseputro, D. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambtan. Jakarta.

Dwyana Z,. 2011. Mikroobiologi Dasar. Universitas Hasanuddin. Makassar

Hastuti, R. D & Ginting, R. C. B. 2007. Enumerasi bakteri, cendawan, dan

aktinomisetes. Metode analisis tanah. Balai Besar Penelitian dan
Pengembangan Sumberdaya Lahan Pertanian, Bandung,
Aulia, R. Handayani, T. & Yennie, Y. 2015. Isolasi, identifikasi dan enumerasi
bakteri Salmonella spp. pada hasil perikanan serta resistensinya terhadap
antibiotik. Bioma. Jakarta.

Waluyo, L. 2004. Mikrobiologi Umum. UMM Press. Malang.

Pelczar, M.J & E. C. S. Chan. 2006. Dasar-dasar Mikrobiologi Jilid 2. UI Press.
Jakarta.
Ramona,Yan., R. Kawuri dan I.B.G. Darmayasa. 2016. Penuntun Praktikum
Mikrobiologi Umum untuk Program Studi Farmasi. Jurusan Biologi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana.
Bali.