PROPOSAL

PROGRAM RISET DESENTRALISASI DIKTI

2013

PENCARIAN OBAT UNTUK PENYAKIT ALZHEIMER DARI

AGATHIS DAMMARA (ARAUCARIACEAE)

1. Judul ini kurang tepat dengan tujuan, rumusan masalah, dan

metodologi yang disajikan, karena tidak dijelaskan metode pencarian
yang digunakanak seperti uji fitokimia, dll. judul yang dapat saya
sarankan sesuai tujuan yang tertulis ialah “Skrining Fitokimia dan
Uji Aktivitas Inhibitor Enzim BACE-1 (Β-Sekretase) Pada Ekstrak
Tanaman Agathis Dammara (Araucariaceae) Sebagai Obat Penyakit
Alzheimer”.

Ketua Tim Peneliti:

Dr. Lia Dewi Juliawaty

KK : Kimia Organik

Fakultas/Sekolah/Pusat/PP : FMIPA

INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG

 April, 2012

DAFTAR ISI

Halaman

IDENTITAS PROPOSAL....................................................................................................1
1 RINGKASAN PROPOSAL ............................................................................................... 2
2 PENDAHULUAN .......................................................................................................... 3
2.1 Latar belakang masalah ....................................................................................... 3
2.2 Tujuan riset ......................................................................................................... 5
3 METODOLOGI ............................................................................................................. 5
4 DAFTAR PUSTAKA ......................................................... Error! Bookmark not defined.
5 INDIKATOR KEBERHASILAN (TARGET CAPAIAN) ............. Error! Bookmark not defined.
6 JADWAL PELAKSANAAN ................................................. Error! Bookmark not defined.
7 PETA JALAN (ROAD MAP) RISET................................... Error! Bookmark not defined.
8 USULAN BIAYA RISET ................................................... Error! Bookmark not defined.
8.1 Belanja pegawai .................................................... Error! Bookmark not defined.
8.2 Belanja barang ...................................................... Error! Bookmark not defined.
8.3 Belanja jasa .......................................................... Error! Bookmark not defined.
9 CV TIM PENELITI ......................................................... Error! Bookmark not defined.
10 LAMPIRAN BUKTI CAPAIAN OUTPUT TAHUN 2010-2011. Error! Bookmark not defined.
1
1 RINGKASAN PROPOSAL

Penyakit Alzheimer merupakan salah satu penyakit yang ada di masyarakat Indonesia pada saat ini.
Penyakit ini merupakan penyakit demensia (kepikunan) yang diawali oleh kelemahan kognisi ringan
sehingga kemampuan seseorang untuk berpikir menjadi terganggu, penurunan daya ingat, kesulitan
berbahasa, dan kesulitan dalam melakukan kegiatan sehari-hari. Demensia terbagi atas dua yaitu
demensia primer dan sekunder. Demensia pada Alzheimer adalah demensia primer, sedangkan
demensia sekunder biasanya diantaranya disebabkan oleh tumor otak, cedera kepala dan stroke.
Penderita Alzheimer biasanya berusia lebih dari 65 tahun, namun penyakit tersebut bukan merupakan
bagian dari proses penuaan. Pada saat ini terdapat 60% penderita Alzheimer dari total populasi di dunia,
sedangkan di Indonesia pada tahun 2006 dilaporkan terdapat sekitar 606.000 penderita Alzheimer’s.
Penderita Alzheimer iperkirakan akan mengalami peningkatan seiring dengan bertambahnya jumlah
orang lanjut usia. Penyakit Alzheimer disebabkan oleh adanya plak amiloid dan neurofibrillary tangles.
Plak amiloid tersebut terbentuk dari pembelahan beta amiloid prekursor protein (APP) yang dikatalisis
oleh enzim BACE-1. Pemberian obat-obatan dapat efektif untuk penderita di awal demensia. Namun
dengan berjalannya waktu pemberian obat menjadi tidak efektif. Hingga saat ini belum ada obat yang
dapat menyembuhkan penyakit Alzheimer, obat-obatan yang ada misalnya donepezil, rivastagmin dan
galantamin hanya bersifat memperlambat progresivitas penyakit tersebut. Oleh karena itu maka para
peneliti sampai saat ini masih berusaha untuk menemukan obat yang potensial untuk penyakit Alzheimer
baik obat dari bahan alam ataupun sintetis misalnya obat-obatan yang memiliki aktivitas sebagai
inhibitor enzim BACE-1. Pada saat ini telah dikembangkan berbagai senyawa-senyawa alam yang berasal
dari tumbuhan sebagai inhibitor enzim BACE-1. Salah satu kelompok senyawa yang memiliki aktivitas
tersebut yaitu kelompok senyawa biflavonoid. Berdasarkan laporan dari beberapa penelitian yang
dilakukan oleh peneliti di mancanegara, diketahui bahwa kelompok senyawa ini dapat ditemukan pada
berbagai macam cemara-cemaraan dan paku-pakuan, salah satu diantaranya yaitu tumbuhan genus
Agathis. Dari 21 genus Agathis di dunia, 11 spesies tumbuh di hutan tropis Indonesia. Salah satu
spesies Agathis yang tumbuh di hutan tropis Indonesia yaitu Agathis dammara. Spesies yang dikenal
dengan nama lokal damar ini, merupakan tumbuhan yang memiliki nilai ekonomi yang tinggi karena
kayu dan getahnya banyak dimanfaatkan untuk keperluan industri seperti pada pembuatan kertas,
furnitur, dan pelitur. Selain itu, pohon damar juga memiliki nilai ekologis yaitu sebagai paru-paru kota.
Sampai saat ini kajian kandungan senyawa kelompok biflavonoid dari pohon damar yang tumbuh di
Indonesia belum pernah dilaporkan sebelumnya. Oleh karena itu, dalam penelitian yang akan dilakukan
ini akan dikaji fitokimia dari spesies Agathis dammara terutama kandungan biflavonoidnya dan
senyawa-senyawa yang diperoleh akan dievaluasi pula aktivitasnya terhadap uji aktivitas yang berkaitan
dengan penyakit Alzheimer yaitu uji sebagai inhibitor enzim BACE-1 (β-sekretase). Hasil penelitian ini
akan memberikan arti yang penting baik bagi perkembangan ilmu kimia spesies Agathis, meningkatkan
nilai guna dari spesies Agathis Indonesia serta menemukan senyawa kimia yang potensial untuk
dikembangkan dalam pengobatan penyakit Alzheimer. Penelitian ini juga merupakan bagian dari
penelitian mengenai tumbuhan di hutan tropis Indonesia yang dilakukan di laboratorium Kimia Organik
Bahan Alam, KK Kimia Organik, FMIPA, ITB bekerjasama dengan Department of Pharmacognosy and
Phytochemistry, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Meiji Pharmaceutical University ,
Jepang yang membantu dalam segi uji aktivitasnya.

2
2 PENDAHULUAN

2.1 Latar belakang masalah

Penyakit Alzheimer merupakan salah satu penyakit demensia atau kepikunan yang diderita lebih dari tiga
puluh juta orang di dunia. (Sasaki, 2010). Penyakit ini menyerang otak dan umumnya diderita oleh
orang dengan usia lebih dari 65 tahun, namun penyakit ini bukanlah penyakit karena proses penuaan.
Penderita penyakit ini mula-mula terganggu daya ingatnya dan dapat menjadi pikun secara progresif dan
dapat menjadi cacat mental total (http://www.antarjatim.com). Penyebab penyakit ini diperkirakan
akibat adanya plak amiloid β (Aβ) dan neurofibrillary tangles. Plak amiloid β (Aβ) terbentuk oleh adanya
pembelahan β-amiloid prekursor protein (APP) dan dikatalis oleh enzim β-sekretase (BACE-1) (Sasaki,
2010). Proses pembentukan plak amiloid β tersebut ditunjukkan pada gambar 2.1.

Gambar 2.1 Proses pembentukan plak amiloid

(http://humpath.com/spip.php?article1993&id_document=2549)

Penemuan senyawa yang memiliki aktivitas sebagai inhibitor enzim BACE-1 dapat menjadi strategi yang
efektif dalam pengobatan penyakit Alzheimer. Sejumlah senyawa dari bahan alam telah digunakan
sebagai obat penyakit ini, diantaranya galantamin dan huperzin A (Harvey, 2008). Selain itu, berbagai
senyawa alam dari tumbuhan telah dicoba dikembangkan sebagai inhibitor enzim BACE-1, diantaranya
yaitu senyawa dari kelompok biflavonoid. Senyawa biflavonoid banyak ditemukan pada berbagai macam
cemara-cemaraan dan paku-pakuan (Sasaki, 2010). Salah satu genus tumbuhan yang telah diketahui
mengandung biflavonoid dan dapat ditemukan pula di hutan tropis Indonesia yaitu Agathis.

Genus Agathis termasuk kelompok famili Aracauriaceae selain genus Aracauria dan Wollemia dan
memiliki 41 spesies. Agathis memiliki 21 spesies (http//id.wikipedia.org/wiki/Agathis) dan terdistribusi di
daerah Indomalaya dan Australasia. Dua daerah yang memiliki keanekaragaman spesies ini yaitu
Kalimantan dan Kaledonia Baru. Tumbuhan Agathis ini merupakan pohon yang hijau sepanjang tahun
dan tumbuh di daerah pegunungan atau hutan hujan tropis dan subtropis (Kuntzman, 2007). Di
Indonesia telah dilaporkan terdapat 11 spesies Agathis dan dikenal dengan nama damar-damaran.
Beberapa spesies damar memiliki nilai ekonomis yang tinggi karena telah banyak digunakan dalam
industri yaitu bagian kayu untuk pembuatan furnitur dan bahan bangunan, sementara getahnya
digunakan untuk pelitur (Langenheim, 1995). Selain itu, pohon damar juga memiliki nilai ekonomis
sebagai paru-paru kota. Berdasarkan penelusuran literatur dilaporkan bahwa Agathis memilki
kandungan kimia utama biflavonoid, selain diterpen dan norlignan. Senyawa biflavonoid adalah senyawa
dimer flavonoid yang dihubungkan oleh ikatan C-C atau C-O-C. Pada genus Agathis, biflavonoid yang
ditemukan umumnya memiliki kerangka kupresuflavon (A) dan agatisflavon (B). Walaupun demikian,
terdapat pula kerangka lain yaitu amentoflavon (C), robustaflavon (D) dan hinokiflavon (E) yang
merupakan komponen minor (Khan, 1972).

3
Salah satu spesies Agathis yang tumbuh di hutan tropis Indonesia yaitu Agathis dammara yang dapat
ditemukan di Sulawesi selain di di Filipina. Tumbuhan ini pada saat ini telah ditanam juga di pulau Jawa.
Kayunya digunakan sebagai kauri dan spesies ini merupakan sumber dari resin copal (Jansen, 1994).
Sampai saat ini penelitian mengenai biflavonoid dari Agathis dammara ini belum pernah dilaporkan.
Pada penelitian ini, jaringan yang dipilih yaitu daun. Kajian fitokimia pada bagian daun dari spesies ini
dapat mengungkapkan keanekaragaman senyawa kimia pada spesies ini khususnya kelompok
biflavonoid. Selanjutnya, kajian aktivitas pada senyawa yang diisolasi sebagai inhibitor BACE-1 akan
memberikan informasi mengenai senyawa yang potensial untuk dapat digunakan dalam pengobatan
penyakit Alzheimer dan juga meningkatkan nilai guna dari tumbuhan damar yang ada di hutan tropis
Indonesia untuk kesejahteraan umat manusia, khususnya dalam bidang kesehatan.

4
 2.2 Tujuan riset

Penelitian yang diajukan pada proposal ini bertujuan melakukan kajian fitokimia khususnya senyawa
kelompok biflavonoid pada Agathis dammara Indonesia serta melakukan evaluasi aktivitas yang
berkaitan dengan penyakit Alzheimer yaitu uji sebagai inhibitor enzim BACE-1 (β-sekretase) untuk
memperoleh senyawa yang dapat digunakan untuk pengobatan penyakit Alzheimer
2. Rumusan Masalah yang dapat saya temukan pada proposal ini ialah Bagaimana melakukan
kajian fitokimia pada kelompok senyawa biflavonoid dalam senyawa Agathis Dammara serta
bagaimana aktivitas inhibitor enzim BACE-1 (β-sekretase) untuk penyakit Alzheime?.
Pada rumusan masalah ini sudah sesuai dengan metode yang digunakan. Pada metode yang
disajikan memberikan informasi mengenai uji aktivitas inhibitor enzim BACE-1 namun tidak ada
uji fitokimia, maka perlu ditambahkan metode uji fitokimia.

3 METODOLOGI
Metodologi pelaksanaan penelitian yang diusulkan ditunjukkan pada gambar 3.1
3. Metode yang disajikan kurang menjawab rumusan masalah, karena tidak memberikan
informasi tentang uji fitokimia pada kelompok senyawa biflavonoid dalam senyawa
Agathis Dammara. Sehingga perlu ditambahkan metode uji fitokimia.
Daun Agathis dammara
- P
enyiapan sampel
(pengeringan dan
pembuatan serbuk) Serbuk
kering

- E
kstraksi dengan aseton

Ekstrak aseton
- P
emisahan dan
pemurnian senyawa

Senyawa-senyawa murni

Penentuan struktur senyawa-senyawa Uji aktivitas inhibitor enzim

BACE-1
(analisis data spektroskopi senyawa-senyawa hasil
ultra violet, infra merah, 1D NMR (1H dan isolasi
13
C),
2D NMR (HMQC dan
HMBC), dan data
spektroskopi massa
Informasi struktur dan aktivitas senyawa-
senyawa

Senyawa berpotensi anti-Alzheimer

Gambar3. 1. Metodologi penelitian

5
Hal-hal yang terkait dalam metodologi tersebut yaitu sebagai berikut:

3.1. Bahan tumbuhan

Bahan tumbuhan yang digunakan adalah daun Agathis dammara dari hutan di Cikole, Lembang, Jawa
Barat. Selanjutnya, dilakukan penyiapan bahan untuk ekstraksi (pengeringan dan pembuatan serbuk).
Spesimen tumbuhan ini dideterminasi di Herbarium Bandungense, Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati,
Insitut Teknologi Bandung.

3.2. Bahan Kimia

Bahan kimia yang digunakan terdiri dari berbagai jenis pelarut organik teknis ( n-heksana, etil asetat,
metanol, aseton) dan pelarut pro-analis (kloroform). Selain itu digunakan silika gel 60G (kromatografi
cair vakum), silika gel 60 PF254 (kromatografi radial), sephadeks LH-20 (kromatografi kolom), silika gel
Kieselgel 60 (ukuran butir berbeda untuk kromatografi kolom gravitasi dan impreg), pelat alumunium
berlapis silika gel 60 GF254 ketebalan 0,25 mm (kromatografi lapis tipis), larutan 1,5% Ce(SO4)2 dalam 2N
H2SO4 dan H2SO4 10% dalam metanol (sebagai pereaksi penampak noda kromatografi lapis tipis).
3.3. Peralatan
Alat-alat yang digunakan yaitu peralatan gelas yang lazim digunakan di laboratorium kimia organik,
termasuk seperangkat alat destilasi, evaporator, alat spektrofotometer ultra violet,spektrofotometer
inframerah, spektrometer massa dan spektrometer Nucleic Magnetic Resonance (NMR) 1D (1H dan 13C)
dan 2D (HMQC dan HMBC).

3.4. Rencana Penelitian

Pada penelitian ini digunakan serangkaian tahapan kerja yang meliputi:

3.4.1. Ekstraksi
Sampel tumbuhan (serbuk kering daun Agathis dammara) diekstraksi dengan pelarut aseton (3 x 24
jam). Ekstrak yang diperoleh diuapkan pelarutnya pada tekanan rendah menggunakan rotary evaporator
sehingga diperoleh ekstrak aseton pekat dan kering.
(dilakukan di laboratorium Kimia Organik Bahan Alam, FMIPA, ITB)

3.4.2. Pemisahan dan pemurnian

Ekstrak aseton yang diperoleh dilarutkan dengan n-heksan untuk menghilangkan klorofil. Fraksi yang tak
larut dalam n-heksan dilarutkan kembali dalam aseton untuk menghilangkan tanin dan selanjutnya fraksi
yang larut dalam aseton dievaporasi pada tekanan rendah sehingga diperoleh ekstrak aseton bebas
klorofil dan bebas tanin. Selanjutnya, fraksi aseton tersebut dipisahkan dengan menggunakan
kromatografi cair vakum sehingga diperoleh sejumlah fraksi. Fraksi-fraksi tersebut diuji dengan
kromatografi lapis tipis dan dipilih fraksi yang mempunyai komponen yang signifikan dan jumlah yang
banyak untuk dipisahkan lagi dengan menggunakan berbagai metode kromatografi diantaranya
kromatografi radial, kromatografi cair gravitasi, HPLC dan dimonitor dengan kromatografi lapis tipis
sehingga diperoleh sejumlah senyawa murni.
(dilakukan di laboratorium Kimia Organik Bahan Alam, FMIPA, ITB)

3.4.3. Identifikasi senyawa murni

Kemurnian senyawa yang diperoleh dilakukan dengan verifikasi kemurnian senyawa-senyawa yang
diperoleh dengan uji kromatografi lapis tipis menggunakan tiga eluen yang berbeda dan penentuan titik
leleh (untuk senyawa berupa padatan).
(dilakukan di laboratorium Kimia Organik Bahan Alam, FMIPA, ITB)

3.4.4. Penentuan struktur

Struktur senyawa-senyawa murni yang diperoleh ditentukan berdasarkan analisis data spektroskopi
ultraviolet (UV), spektroskopi infra merah (IR), 1D ( 1H dan 13C) dan 2 D (HMQC dan HMBC) serta data
spektroskopi massa. Dari data spektroskopi ultra violet ditentukan kromofor yang terdapat dalam
molekul dan penentuan kerangka senyawa yang diperoleh, dari data spektroskopi infra merah dapat
ditentukan jenis gugus fungsinya (dilakukan di laboratorium Kimia Organik Bahan Alam, FMIPA, ITB),
6
data 1D (1Hdan 13C) menunjukkan jenis dan jumlah proton serta karbonnya, sedangkan data 2D (HMQC
dan HMBC) memperlihatkan hubungan antara proton karbon dengan tertentu. Sementara itu, data
spektroskopi massa menunjukkan rumus molekul dan fragmentasi yang dapat terjadi pada molekul
senyawa murni tersebut.
(Pengukuran data spektroskopi dilakukan di laboratorium Kimia Organik Bahan Alam, FMIPA ITB dan
laboratorium Basic Science A, FMIPA, ITB)

3.4.5. Uji aktivitas inhibitor enzim BACE-1 (Sasaki, 2010)

Uji inhibitor enzim BACE-1 dilakukan pada plat hitam 384-well dan menggunakan kit uji BACE-1
FRET(Invitrogen Co., USA). Pertama-tama sampel yang akan diuji dilarutkan dalam larutan buffer untuk
uji (50mM Natrium asetat, pH 4,5) dalam DMSO (sehingga konsentrasi akhir 10%). Selanjutnya, 10µL
larutan sampel, 10µL substrat BACE-1 (750 nM Rh-EVNLDAEFK-Quencher, dalam 50 nM amonium
bikarbonat), dan 10µL enzim BACE-1 (1,0 U/mL) dicampur dalam lubang sumur dan diinkubasi selama
60 menit di tempat gelap dengan suhu 25oC. Intensitas flouresen dari campuran tersebut diukur dengan
flourescent ascent (Thermo Scientific) untuk eksitasi pada 544 nm dan emisi 590 nM.
(Pengukuran dilakukan di laboratorium Department Pharmacognosy and Phytochemistry, Graduate
School of Pharmaceutical, Meiji Pharmaceutical University,Jepang)

Rasio inhibisi dihitung dengan persamaan sebagai berikut :

inhibisi (%) = [1 – {(S-So)-(B-Bo)/(C-Co)-(B-Bo)}] x 100

C = flouresen dari kontrol (enzim, substrat, dan konsentrasi larutan buffer untuk uji dalam DMSO
(konsentrasi akhir adalah 10%) setelah diinkubasi 60 menit.
Co = flouresen awal dari kontrol (enzim, substrat, konsentrasi buffer untuk uji dalam DMSO
(konsentrasi akhir adalah 10%) setelah diinkubasi 60 menit.
B = flouresen dari kontrol (substrat, konsentrasi buffer untuk uji dalam DMSO
(konsentrasi akhir adalah 10%) setelah diinkubasi 60 menit.
Bo = flouresen awal dari kontrol (substrat, konsentrasi buffer untuk uji dalam DMSO
(konsentrasi akhir adalah 10%) setelah diinkubasi 60 menit.
S = flouresen dari kontrol (enzim, larutan sampel dan substrat) dalam DMSO
(konsentrasi akhir adalah 10%) setelah diinkubasi 60 menit.
So = flouresen awal dari kontrol (enzim, larutan sampel dan substrat) dalam DMSO
(konsentrasi akhir adalah 10%) setelah diinkubasi 60 menit.

Untuk mengecek efek quenching dari larutan sampel yang diuji, maka larutan sampel ditambahkan ke
dalam campuran reaksi C, dan reduksi yang terjadi dalam nilai flouresennya oleh sampel dianalisis.
Sebagai kontrol positif yaitu inhibitor β-sekretase (Wako, Jepang).

Bandung, 5 April 2012

(Prof. Dr. Euis Holisotan Hakim)

7
8