VIROLOGI

METODE HEMAGLUTINASI

Disusun oleh:

Kelompok 5

1. Fifi Oktavia (1614313453010)

2. Kevin Prisnanda Nesa (1614313453016)
3. Margareta Yakolbe (1614313453021)

PROGRAM STUDI: D3 ANALIS KESEHATAN

STIKes MAHARANI MALANG

Jl. Akordion Selatan No.8B Kota Malang, Jawa Timur

Telp/Fax. (0341) 4345375

Website. www.stikesmaharani.ac.id

Email. informasi@stikesmaharani.ac.id

2018

1
A. Definisi
1. Hemaglutinasi
a. Uji hemaglutinasi (HA)
Uji hemaglutinasi (HA) adalah salah satu uji serologi untuk mengatahui
adanya virus yang menghemaglutinasi sel darah merah (SDM). Sampel yang
positif ditandai dengan adanya aggregate SDM seperti pasir pada dasar sumuran
mikroplat (Kencana et al., 2012). Uji HA digunakan untuk mendeteksi virus yang
memiliki hemaglutinin. Hemaglutinin ini dapat mengaglutinasi eritrosit beberapa
spesies hewan, salah satunya adalah eritrosit unggas. Kegunaan lainnya dari uji
HA adalah sebagai dasar untuk menentukan titer virus ND (Darminto, 1996). Uji
HA untuk menentukan titer virus ND didasarkan pada prinsip kemampuan
hemaglutinasi dari virus ND terhadap sel darah merah (Grimes, 2002).
Titer HA adalah pengenceran tertinggi yang masih dapat mengaglutinasi
eritrosit. HA sempurna ditandai dengan lapisan sel darah merah secara merata
pada dasar sumuran microplate dan penjernihan dari cairan di bagian atas tanpa
terjadinya pengendapan. Sedangkan hasil negative menunjukan sel darah merah
berbentuk titik di tengah sumuran (Ernawati dkk, 1996).
Beberapa virus mampu mengaglutinasikan sel darah merah. Kemampuan
ini sebagai contoh dari aktivitas biologik dan aktivitas ini dapat dihambat oleh
antibodi tertentu. Sisi partikel virus yang spesifik dapat berinteraksi dengan
reseptor mukoprotein pada sel darah merah dan permukaan sel lain. Interaksi dari
sisi reseptor dan virion membuat aglutinasi sel darah merah menjadi tampak.
Enzim virus neuraminidase memecah ikatan antara virus dan sel, dan melepas
keduanya ke dalam larutan. Antigen adalah bagian virus yang mengandung ikatan
dan antigen dari virus digunakan untuk uji hemaglutinasi(Stephen, 1980)

b. Uji Hemaglutinasi Inhibisi (HI)

Uji Hemaglutinasi Inhibisi (HI) adalah kemampuan mengukur antigen
yang terlarut untuk menghambat aglutinasi antara antigen dengan eritrosit oleh
antibodi. Jika sampel mengandung antigen , antigen terlarut akan bersaing dengan
eritrosit untuk berikatan dengan antibodi, sehingga menghambat aglutinasi sel
darah merah dengan menipiskan atau mengencerkan sampel dan dapat
menghitung jumlah antigen melalui titer pada sampel yang belum diketahui.
(Mayer, 2010)
Hemaglutinasi inhibisi merupakan yang diinduksikan oleh virus
sebagai prosedur untuk mengidentifikasi hemaglutinasi oleh virus atau metode
untuk mengukur konsentrasi dari antigen terlarut dalam spesimen biologis dimana
spesimen diinduksi dengan antibodi spesifik dan kemudian dengan eritrosit.
Pemeriksaan hemaglutinasi inhibition ini selain untuk mengidentifikasi virus juga
digunakan untuk menentukan kekebalan hewan terhadap suatu agen (virus)
melalui pengukuran titer antibodi spesifik dalam serum hewan tersebut.

2
 2. Macam-macam uji serologi
Beberapa uji serologi yang dikenal, diantaranya adalah:
a. Haemaglutination and Haemaglutination Inhibition Test (HA/HI)
b. Enzym-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
c. Agar Gel Presititation Test (AGPT)
d. Flourescent Antibody Technique (FAT)
e. Complement Fixation Test (CFT)
f. Radio Immuno Assay (RIA)

3. Uji HA/HI Untuk Identifikasi Penyakit Virus

Uji hemaglutinasi (HA/HI) digunakan khusus untuk virus-virus yang
memiliki protein hemaglutini pada amplopnya. Misalnya: Virus Newcastle
Disease, virus Avian Influenza, virus Parvo. Terjadinya hemaglutinasi ditandai
dengan butiranberpasir akibat adanya ikatan antara sel darah merah 1% dengan
protein hemaglutinin pada amplop virus.

B. Alat dan Bahan

Alat :
1) Gelas Objek
2) Batang korek api
3) Microplate
4) Penangas Air

Bahan:

1) Suspensi Antigen
2) Suspensi Sel Darah Merah
3) PBS

C. Prosedur
1. Cara Uji Hemaglutinasi
a) Cara Uji Hemaglutinasi Cepat
Uji hemaglutinasi cepat (rapid HA) dilakukan untuk deteksi cepat.
Cara kerja:
a. Diteteskan satu tetes suspensi antigen diatas gelas objek, didekatnya
diteteskan pula satu tetes suspense sel darah merah 1 %.
b. Kedua tetesan tersebut selanjutnya dicampurkan dengan menggunakan
batang korek api lalu diaduk beberapa saat sampai merata.
c. Diamati terjadinya butiran berpasir warna merah pada objek glas
sebagai tanda reaksi itu positif.

3
b) Uji Hemaglutinasi Teknik Mikrotiter
Uji ini untuk mengetahui titer virus, diperlukan untuk menyiapkan
antigen HA unit pada uji HI.
Cara kerja:
a. Disiapkan plat mikro 96 sumuran, lalu diisikan 0,025 µl PBS ke dalam
semua lubang.
b. Ditambahkan suspensi antigen yang diuji (dari cairan alantois hasil
panen) pada tahap uji sebelumnya ke dalam lubang satu dan dua,
selanjunya dilakukan pengenceran berseri kelipatan dua mulai dari
lubang kedua sampai lubang ke sebelas dengan menggunakan
pengencer mikro.
c. Ditambahkan 0,25 µl PBS ke dalam setiap lubang plat mikro (mulai
dari lubang 1 sampai lubang 12), selanjutnya diaduk dengan pengocok
mikro.
d. Ditambahkan ke dalam setiap lubang masing-masing 0,05 µl sel darh
merah 1 % mulai lubang 1 sampai lubang 12, lalu diayak selama 30
detik.
e. Plat mikro selanjutnya dieramkan pada suhu kamar dan diamati
timbulnya aglutinasi sel darah merah. Pengamatan dilakukan setiap 15
menit selama satu jam.
f. Titer virus ditentukan dari pengenceran tertinggi yang masih mampu
mengalutinasi sel darah merah 1%. Titer virus yang diperoleh
selanjutnya diencerkan menjadi 4 HA Unit.
g. Identifikasi virus dilanjutkan dengan uji HI

c) Uji Hambatan Hemaglutinasi (Uji HI)

Uji ini digunakan untuk mengidentifikasi lebih lanjut virus yang diuji
pada uji HA. Disamping itu uji HI juga dapat juga digunakan untuk
menentukan titer antibodi hewan pascavaksinasi.
Cara kerja:
a) Disiapkan plat mikro 96 sumuran, lalu diisikan 0,025 µl PBS ke dala
semua lubang.
b) Serum yang akan di uji dipanaskan terlebih dahulu pada penangas air
bersuhu 56 ºC selama 30 menit.
c) Ditambahkan 0,025 µl serum ke dalam lubang 1 dan 2 dari sumuran
plat mikro lalu diencerkan secara berseri kelipatan dua mulai dari
sumuran ke dua sampai lubang ke sepuluh dengan pengencer mikro.
d) Ditambahkan 0,25 µl suspensi antigen 4 HA unit mulai lubang nomor
1-11, lubang nomor 12 hanya diisi 0,25 µl PBS.
e) Plate mikro diayak selama 30 detik, kemudian diinkubasikan pada suhu
kamar (suhu 23º C) selama 30 menit. Kedalam setiap lubang
selanjutnya ditambahkan masing-masing 0.05 ml suspense sel darah
merah 1 %, diayak kembali selama 30 detik.

4
 f) Plate mikro diletakkan pada suhu kamar, diamati setiap 15 menit,
dibaca hasilnya . pengamatan dilakukan selama 1 jam. Titer HI
dinyatakan sebagai pengenceran tertinggi dari serum yang masih
mampu menghambat terjadinya hemaglutinasi virus secara sempurna.

D. Interpretasi Hasil

HA : Sampel yang positif ditandai dengan adanya aggregate SDM seperti pasir pada
dasar sumuran mikroplat.
HA : Sampel yang positif ditandai dengan adanya gumpalan SDM pada dasar
sumuran mikroplat.

E. Aplikasi Metode Hemaglutinasi Pada Virus Newcastle Disease (ND)

Penyakit Newcastle atau Newcastle Disease (ND) adalah penyakit

menular yang disebabkan oleh virus ND yang sering menyerang peternakan
unggas maupun burung liar dengan gangguan pencernaan, pernafasan, dan
syaraf (Anonimous, 2002). ND merupakan penyakit virus menular yang
biasanya mendominasi penyakit unggas di daerah tropis (Williamson dan Payne,
1993).

ND ditemukan pertama kali oleh Kraneveld pada tahun 1926 di

indonesia, karena menyerupai pes pada ayam makan disebut pseudovogelpest.
Kemudian pada tahun 1927 Doyle memberi nama penyakit tersebut dengan
sebutan New Castle Desease, dikarenakan terjadi di suatu daerah Inggris yaitu
Newcastle on Tyne juga terjangkit bpenyakit yang serupa (Syibli dkk,2014).

Newcastle Disease pertama kali dilaporkan di AS oleh Beach pada

tahun 1942. Penyakit ini telah muncul di California 5 atau 6 tahun sebelumnya
yang pada waktu itu belum dikenal sebagi ND tapi dikenal sebagai
Pneumoenchephalitis. Di Indonesia ND dapat ditemukan pada peternakan ayam
(pedaging atau petelur ) baik ayam ras maupun bukan ras di berbagai daerah di
seluruh penjuru tanah air, terutama daerah yang padat peternakan ayam.

Berdasarkan jurnal referensi yang kami ambil mengenai Virulensi

Virus Newcastle Desease Isolasi Lapang Berdasarkan Analisis Bioinformatika
Gen Protein Hemaglutinin Neuraminidase pada tahun 2015. Metode yang
digunakan untuk mengetahui infeksi Virus Newcastle Desease adalah
hemaglutinasi HA dan Hemaglutinasi Inhibisi (HI).

5
1. Alat dan Bahan
a) Alat :
1. Mikroplat Steril
b) Bahan :
1. NaCl 0,9%
2. Antigen VND
3. Suspensi Sel Darah Merah
4. 4 Sampel Virus ND yang diperoleh dari isolat lapang
 VND ayam lokal Bandung Bali 2014
 VND ayam ras Klungkung Bali 2014
 VND ayam ras Tabanan 1 Bali 2014
 VND ayam ras Tabanan 2 Bali 2014
5. Propagasi Virus Newcastle Disease
1. Keempat sampel VND isolate lapang dipropagasi pada
telur ayam bertunas (TAB) umur 9-10 hari melalui
ruang alantosis.
2. Propagasi pada TAB diawali dengan pengamatan telur
(Candling) untuk mengetahui keadaan embrio
3. Kemudian virus ND isolate lapangan diinjeksikan 0,1-
0,2 ml/butir telur dengan menggunakan tuberculin
syringe, lubang bekas tusukan pada cangkang ditutup
4. Selanjutnya TAB diinkubasikan pada suhu 370C
5. Melakukan pengamatan setiap hari selama 4 hari.
6. Terakhir alantosis dipanen dari telur embrio yang mati
dan dilanjutkan untuk uji serologi.

2. Prosedur
a) Uji Hemaglutinasi (HA)
1. Menyiapkan mikroplat steril kemudian pada masing-masing
lubang
(1 – 12) ditambahkan dengan 25 µl NaCl 0,9%.
2. Selanjutnya pada lubang pertama dan kedua ditambahkan antigen
VND sebanyak 25 µl
3. Mengencerkan berseri kelipatan dua mulai dari lubang kedua
sampai lubang kesebelas dengan menggunakan pengencer mikro.
4. Menambahkan NaCl 0,9% sebanyak 25 µl pada semua lubang (1 –
12).
5. Kemudian ditambahkan ke dalam setiap lubang 50 µl suspensi sel
darah merah ayam konsentrasi 1% kemudian diayak selama 30
detik.
6. Selanjutnya di inkubasi pada suhu kamar selama 1 jam dan reaksi
diamati setiap 15 menit ada atau tidaknya reaksi hemaaglutinasi sel
darah merah.

6
 b) Uji Hambatan Hemaglutinasi (HI)
1. Menyiapkan mikroplat steril kemudian pada masing-masing lubang
(1-12) ditambahkan 25 µl NaCl 0,9%
2. Lubang pertama sampai kesepuluh ditambahkan serum VND
3. Selanjutnya menginkubasi pada suhu kamar selama 1 jam dan
diamati setiap 15 menit ada tidaknya aglutinasi sel darah merah
4. Menambahkan antigen sebanyak 4 unit HA pada lubang pertama
sampai kesebelas
5. Kemudian menginkubasi pada suhu kamar salama 30 menit
6. Menambahkan 50 µl suspensi sel darah merah ayam kosentrasi 1%
pada semua lubang dan goyangkan mikroplat kembali selama 30
detik.
7. Melakukan inkusabi pada suhu kamar selama 1 jam dan amati setiap
15 menit ada tidaknya aglutinasi sel darah merah

3. Interpretasi Hasil
a. Uji Hemaglutinasi (HA)
Sampel yang positif ditandai dengan adanya aggregate SDM
seperti pasir pada dasar sumuran mikroplat
b. Uji Hambatan Hemaglutinasi (HI)
Sampel yang positif ditandai dengan adanya gumpalan SDM
pada dasar sumuran mikroplat.

4. Hasil dan Pembahasan

a) Uji Hemaglutinasi (HA)

Gambar a
Uji Hemaglutinasi (HA) dari keempat sampel VND
menunjukkan hasil positif. Gambar diambil dari bawah mikroplat, lajur
(+) : control positif, lajur SDM: control sel darah merah.

7
 Ket:
Uji Hemaglutinasi (HA) dari keempat sampel VND menunjukkan hasil
positif (Gambar Ia) dengan titer kisaran 25-20.

b) Uji Hambatan Hemaglutinasi (HI)

Ket:
Uji Rapid HI menunjukkan reaksi positif bahwa keempat sampel
merupakan Virus ND karena tidak terjadi hemaglutinasi pada sumuran
mikroplat yang berisi hiperimun serum ND. Uji hambatan hemaglutinasi
(HI), gambar diambil dari bawah mikroplat lajur K (+/-): control positif
(Atas) atau control negative (Bawah). Baris sAI (1-4): sumuran hiperimun
serum AI, Baris sND (1-4) : sumuran hiperimun serum ND.

8
 REFERENSI

Kencana GA.2017. Respons Imun Ayam Petelur Pascavaksinasi Newcastle Disease dan Egg
Drop Syndrome. Online,

https://media.neliti.com/media/publications/196589-ID-respons-imun-ayam-petelur-
pascavaksinasi.pdf. Diakses pada 14 november 2018.

Kencana GA.2017. Modul Training Cara Mengisolasi Virus Danmeng Identifikasi dengan
Uji Serologi Hemaglutinasi. Online,
https://simdos.unud.ac.id/uploads/file_pendidikan_1_dir/eb1ca00126ee2938f64067a40fc
3d8e7.pdf ). Diakses pada 15 November 2018.

Panus A.2015. Newcastle Disease Virus Infection Study on Duck and Chicken in Subang
District. Online,

http://oaji.net/articles/2016/1610-1452487823.pdf. Diakses pada 15 november 2018.

Rell F.2015. Virulensi Virus Newcastle Disease Isolat Lapang Berdasarkan Analisis
Bioinformatika Gen Protein Hemaglutinin-Neuraminidase. Online,

http://download.portalgaruda.org/article.php?article=412409&val=939&title=Virulensi-
Virus-Newcastle-Disease-Isolat-Lapang-Berdasarkan-Analisis-Bioinformatika-Gen-
Protein-Hemaglutinin-Neuraminidase. Diakses pada 13 November 2018.