LAPORAN PRAKTIKUM

JUDUL : Isolasi dan Identifikasi Virus

TUJUAN : Mahasiswa mampu melakukan isolasi dan identifikasi virus penyebab
penyakit ND dan AI pada unggas.

HARI/TANGGAL : Kamis, 21 Oktober 2021

DASAR TEORI :
A. Newcastle Diseas (ND)
Newcastle Disease dilaporkan pertama kali di Jawa oleh Kraneveld pada tahun 1926.

Doyle pada tahun 1927 berhasil mengisolasi virusnya pada suatu wabah yang terjadi di

Newcastle Upon Tyne Inggris. ND merupakan penyakit endemik hampir diseluruh dunia

kecuali di Benua antartika (Alexander, 2001). Wabah ND umumnya terjadi pada saat

peralihan musim yaitu pada musim panas ke musim penghujan atau sebaliknya. Perubahan

musim yang tajam sering terjadi di negara subtropis. Pada tahun 1973-1979 LPPH Bogor

mengamati kejadian ND di Indonesia, dimana pada bulan Mei-Juni yaitu pada pertengahan

musim kering tercatat paling rendah (10,6 %) kemudian naik sampai 24,2 % pada bulan

November-Desember atau permulaan musim hujan (OIE, 2012).

Kejadian ND yang dilaporkan kebanyakan disebabkan oleh virus ND tipe velogenik,

namun beberapa peternakan ayam di Australia di infeksi oleh virus ND tipe lentogenik.

Kematian akibat virus ND tipe velogenik atau tipe Asia paling tinggi, sedangkan akibat

velogenik tipe Amerika kematiannya 60-80% dan akibat serangan tipe mesogenik sekitar

10% (Ghiamirad, 2010; Hewajuli dan Damayanti 2011).

Newcastle Disease menyerang unggas semua umur baik yang dipelihara maupun yang

hidup secara liar termasuk berbagai jenis burung. ND juga menyerang manusia ditandai

dengan konjungtivitas yang berlangsung satu hari dan limfadenitas tetapi segera terjadi

penyembuhan. Penularan ND dapat terjadi dari satu hewan ke hewan lain melalui kontak
dengan hewan yang sakit dan bangkai penderita. Penularan dari satu tempat ketempat lain

dapat terjadi melalui pengangkutan, pekerja kandang, debu, angin, serangga dan makanan

yang tercemar. Di Indonesia peranan ayam buras masih menonjol dalam penyebaran ND. Hal

ini disebabkan karena sistem pemeliharaan yang kurang intensif, sehingga sulit untuk di

kontrol (Naipospos, 2004 ; Kencana 2012)

Newcastle Disease disebabkan oleh paramyxovirus Virus ini termasuk familia

myxovirus dan satu genus dengan virus sendai, parainfluensa-1, 2 dan 3 serta mumps. Pada

dekade terakhir ini telah berhasil diungkapakn 9 serotipe paramyxovirus dan virus ND

termasuk paramyxovirus-1 (PMV-1) (Adi et al., 2010; Kencana, 2012). Bentuk virus

bervariasi dari bulat dan oval dengan diameter 70-80 nm (nanometer) sampai bentuk filamen

dengan panjang 124-200nm. Sedangkan partikel virus yang lengkap (virion) berukuran 120

sampai 300 nm, tetapi lazimnya berukuran 180 nm. Virus ND tersusun atas asam inti ribo

beruntai tunggal (ss-RNA) dengan struktur helikal. Disebelah luar dari asam inti terdapat

lapisan yang disebut capsid. Kedua struktur ini disebut nucleocapsid dan dibungkus oleh

amplop. Amplop tersusun atas lipid, protein dan karbohidrat. Membran proteinnya terdiri dari

glikoprotein dan matriks protein yang berhubungan dengan aktivitas hemaglutinin dan

neuraminidase yang terletak pada satu peplomer. Glikoprotein memiliki ujung glikosilat

hidrofilik pada lapisan lemak Lapisan lemak dapat dirusak oleh pelarut lemak sehingga dapat

mengganggu virion (Alexander, 2001).

A. Sampel untuk bahan isolasi virus

Bahan untuk isolasi virus yang baik adalah jika sampel diambil dalam keadaan segar,

diambil saat infeksi pada fase akut. Penyakit ND dan AI mempunyai gejala klinis yang sangat

mirip, yakni: kelainan sistema respirasi yang ditandai ngorok, keluar leleran hidung, batuk

(Gambar 1). Gejala lain berupa gangguan sistim pencernaan yang ditandai: diare, bulu kusam
karena dehidrasi akibat diare profus. Ada pula gejala syaraf yang disebut tremor, ataxia,

tortikolis (tandanya sayap terkulai dan leher terpuntir ke belakang).

Gambar 1. Gejala klinis penyakit ND

Perubahan patologi anatomi dari organ yang diakibatkan oleh kedua penyakit tersebut

juga hampir sama. Perubahan patologi anatomi ditandai dengan perdarahan ringan sampai

berat yang dijumpai pada trakea, paru-paru, 12 usus, provektrikulus, ventrikulus, dan otak.

Perdarahan bentuk ptekie (perdarahan bintik) maupun eksimosa (perdarahan yang meluas)

seringkali ditemukan pada organ-organ tersebut.

Pada kasus AI perdarahan bintik juga ditemukan pada pankreas, juga pada kaki. Sampel

untuk bahan pembuatan inokulum diambil dari organ-organ yang mengalami perubahan

menciri (Gambar 2). Biasanya semakin menciri perubahan patologi anatominya maka

semakin tinggi pula titer virus hasil dipanen. Sampel organ diambil dalam keadaan segar, dan

usahakan pengambilan organ seseteril mungkin. Organ ditempatkan di dalam tabung kaca

steril selanjutnya dibuat inokulum untuk diinokulasikan pada media isolasi virus. Pada hewan

yang masih hidup, sampel pemeriksaan dapat diambil dengan menggunakan swab. Pada
unggas diambil dari swab trakea, swab kloaka. Pada mamalia juga dapat diambil dari swab

kerongkongan, swab vagina, swab preputium.

B. Media isolasi virus

Isolasi virus penting untuk mengonfirmasi keberadaan virus dan untuk karakterisasi

virus selanjutnya. Media yang umum digunakan untuk isolasi virus ND dan AI adalah Telur

ayam berembrio (TAB) spesific pathogen free (SPF) umur 9-11 hari dan chicken embrio

fibroblast (CEF). Alasan pemilihan telur ayam bertunas sebagai media isolasi Virus ND dan

AI , antara lain: a. Mudah diperoleh b. Relative bebas dari mikroorganisme pathogen c. Peka

terhadap infeksi virus ND dan AI d. Dapat diberikan tanda (ditulis dengan pensil: kode isolat,

asal isolat, tanggal inokulasi, jenis penyakit). Sebelum digunakan telur diperiksa (candling)

terlebih dahulu dengan menggunakan candler (teropong telur).

 Gambar 3. Telur Ayam Bertunas dan SPF

C. Candling Telur Ayam Bertunas

Pemeriksaan telur ayam bertunas disebut candling yang dilakukan pada ruangan gelap

untuk mengamati pergerakan embrionya. Teropong telur (candler) dihidupkan lalu telur

diperiksa di depan Candler. Diamati pergerakan embrio dan pembuluh darahnya. Telur yang

fertile ditandai dengan pergerakan aktif dan darahnya merah. Sebaliknya telur yang infertile

tidak ada pergerakan embrio dan pembuluh darahnya tampak hitam. Telur ayam bertunas

beserta bagian-bagiannya dimuat pada Gambar 4.

Gambar 4. Pemeriksaan TAB

D. Jalur Inokulasi

Jalur inokulasi yang umum dilakukan pada telur ayam bertunas diantaranya adalah: a.

inokulasi melalui ruang alantois b. inokulaasi melalui membrane korioalantois

(Chorioalantoic membrane= CAM) c. inokulasi kantong kuning telur (Yolk Sac) d. inokulasi

melaui ruang amnion (amnionic cavity) e. inokulasi melalui otak (intracerebtum) f. inokulasi

melalui pembuluh darah (intra vena). Contoh gambar jalur inokulasi dapat dilihat pada

gambar 5.

Gambar 5. Jalur inokulasi pada telur

METODE :
Isolasi virus diawali dengan pembuatan inokulum dari spesimen organ, penanaman inokulum

pada Telur Ayam Bertunas, pemanenan cairan Alantois

ALAT DAN BAHAN :

Sampel swab
Alat Bahan
Cotton swab Media transport
Eppendorf tube Antibiotik (prnicilin 2000 – 10000 IU/ml,
stretomycin 2 – 10 mg/ml)
Sentrifuge Telur
 Sampel Organ
Alat Bahan
Mortal steril Organ/jaringan
Eppendorf tube PBH pH 7,2 atau NaCl fisiologis
konsentrasi 10 – 20%
Tabung steril Antibiotika (dengan dosis 1000-5000 IU
penicillin dan 1000-5000 µg/ml
streptomisin)
Sentrifuge
Inkubator

Isolasi pada Telur Ayam Bertunas (TAB)

Alat Bahan
Pensil Telur berumur 9-10 hari
jarum penusuk Alkohol 70 %
Spuit dengan jarum berukuran 1 ml

Kuteks
Label
Inkubator

Pemanenan Cairan Alantois

Alat Bahan
Gunting Telur berumur 9-10 hari
mikropipet
Tabung eppendorf.

Sentrifuse

CARA KERJA :
1. Sampel Swab

SKEMA

Disiapkan alat dan bahan yang

akan digunakan

Cotton swab diambil dari media

transport dengan menggunakan
pinset.
 Media transport diambil sebanyak
1 ml, kemudaian dimasukkan
dalam eppendorf tube

Ditambahkan antibiotik ke dalam

media transport (penicillin 2000 –
10000 IU/ml, streptomycin 2 – 10
mg/ml)

DiSentrifuge 12000 rpm, selama

10 menit

Di Diamkan selama 15 menit

dalam suhu ruang sebelum
disuntikkan ke dalam telur.

2. Sampel organ

SKEMA

Sampel berupa organ atau jaringan diambil sebanyak kira-kira 1 gram, ditempatkan
Suspensi jaringan dipindahkan ke dalam tabung steril untuk disentrifuse dengan
pada mortar steril, lalu dipotong kecil-kecil dan digerus sampai halus sambil
kecepatan 2500 rpm selama 10-15 menit, kemudian dipisahkan supernatant dari
ditambahkan PBSsupernatan
Diambil bagian pH 7,2 atau boleh juga
sebanyak NaCl
9 ml, fisiologis sampai
ditambahkan dengan konsentrasinya
antibiotika 1 ml10-20
endapan.
yang sudah diencerkan (dengan dosis 1000-5000 IU penicillin dan 1000-5000 µg/ml
Campuran tersebut selanjunya dieramkan%. pada inkubator bersuhu 37ºC selama 30
streptomisin
menit. tersebut selanjuntnya digunakan
Campuran supernatan yang berisi antibiotika
sebagai bahan untuk isolasi virus pada tahap berikutnya

3. Isolasi pada Telur Ayam Bertunas (TAB)

 Cara inokulasi virus melalui Ruang Alantois. Jalur inokulasi ini dipilih untuk virus:
Newcastle Disease, Avian Influenza, Infectious Bronchitis, Egg Drop Syndrome. Telur
yang digunakan biasanya berumur 9-10 hari.
Jalur inokulasi adalah sebagai berikut:

SKEMA

Telur di candling untuk menentukan fertile atau tidak

Ditandai ruang udaranya dengan menggunakan pensil

Kulit telur didesinfeksi dengan alkohol 70%.

Dibuat lubang pada cangkang telur dengan menggunakan jarum penusuk

Dilakukan inokulasi 0.2 ml inokulum/ butir telur dengan menggunakan spuit dengan
jarum berukuran
Lubang tempat suntikan 1 ml.
tadi ditutup dengan menggunakan kuteks
Diberikan label pada telur tentang isolat yang diisolasikan

Telur diinkubasikan di inkubator bersuhu 37ºC dan diamati setiap hari dengan cara
di canding

Kematian telur kurang dari 24 jam diabaikan dan dianggap telur terkontaminasi.

Telur yang mati lebih dari 24 jam atau telur dengan embrio yang sudah lemah
selanjutnya dimasukkan ke almari pendingin selama satu malam.

Dilakukan pemanenan cairan alantois

4. Pemanenan Cairan Alantois

 Sebelum dipanen telur tersebut dimasukan kedalam lemari pendingin yang bertujuan
untuk mengurangi perdarahan saat melakukan pembukaan cangkang telur. Cara Panen
Cairan Alantois yaitu sebagai berikut:

SKEMA

Pemanenan dilakukan dengan membuka cangkang telur di daerah kantong udara

dengan gunting
Cairan alantois diambil dengan menggunakan mikropipet dan ditampung pada tabung
eppendorf.
Cairan allantois yang sudah ditampung pada tabung eppendorf kemudian
disentrifuge dan supernatan diambil lalu ditampung kembali pada tabung eppendorf
yang baru kemudian disimpan untuk uji serologi.

HASIL PENGAMATAN :
Gambar Keterangan
Dicari ruang udara nya

Ditandai dengan pensil/pulpen

Dibuat lubang dengan jarum penusuk

 Di inokulasi butir telur dengan jarum 1 ml

Inokulasi

Inokulot embrio telur

Gambar keterangan Keterangan
Telur ditandai dengan pulpen untuk tempat
penusukan

Di injeksi inokulum

Injeksi inokulum ke butir telur

 Di beri lilin ditempat penusukan

Cara membuka cangkang telur dengan gunting

Gambar Keterangan
Tempat bagian telur yang akan dibuka
dibersihkan dengan disinfektan

Dibersihkan dengan kapas api

Dibuka perlahan dengan gunting

Dikeluarkan embrio
PEMBAHASAN :
Pada praktikum kali ini dilakukan isolasi dan identifikasi Isolasi dan Idendifikasi

virus Newcastle Deases menggunakan spesimen paru – paru, limpa, otak dan usus. Organ

digerus dalam PBS hingga konsentrasi 10 – 20% untuk mengeluarkan virus dari sel inang.

Penggerusan harus dilakukan hingga jaringan benar – benar hancur. Kemudian dilanjutkan

dengan sentrifugasi yang bertujuan untuk mengendapkan sisa organ gerusan. Supernatan dari

gerusan diambil karena virus berada pada supernatan yang disebabkan oleh berat jenis virus

lebih kecil daripada air. Supernatan ditambahkan antibiotika penisilin-streptomisin untuk

membunuh bakteri yang mengkontaminasi, yang sebelumnya telah diinkubasikan pada 37

derajat C untuk mengaktifkan kerja antibiotika. Inokulum diinokulasikan pada TAB umur 9

hari melalui ruang alantois. Inokulasi bertujuan untuk mengisolasi dan memperbanyak virus.

Mengisolasi dimaksudkan untuk memisahkan virus dari agen lainnya melalui cara inokulasi

(Misalnya : virus ND dapat diinokulasi melalui ruang alantois sehingga tidak memungkinkan

untuk virus Pox tumbuh pada daerah tersebut karena sifat virus Pox adalah epiteliotrofik).

Virus ND memiliki sifat pantrofik sehingga dilakukan inokulasi pada ruang alantois. Virus

lain yang mungkin tumbuh pada ruang alantois adalah virus IB, AI dan Parvovirus.

Memperbanyak virus dimaksudkan untuk meningkatkan titer virus dengan cara

menumbuhkan virus pada sel hidup. Virus bersifat obligat intraseluler sehingga mutlak

membutuhkan sel hidup untuk proses replikasinya. Selain TAB perbanyakan virus dapat

dilakukan pada hewan percobaan (dalam hal ini unggas) dan biakan sel. TAB yang telah

diinokulasi diamati tiap hari dengan chandling untuk menentukan apakah TAB hidup ataukah

telah mati. Embrio dipanen pada hari ke-3 pascainokulasi dan dipanen cairan alantoisnya.

Cairan alantois yang telah dipanen digunakan untuk uji HA/HI (Mahardika et al., 2015).

KESIMPULAN :

Dari praktikum yang telah dilakukan dapat disimpulkan dari isolasi dan identifikasi

virus, kematian ayam didiagnosa terinfeksi virus Newcastle disease.

DAFTAR PUSTAKA :

Alexander, D.J. 2001.Newcastle disease: The Gordon Memorial Lecture. Br. Poult.Sci. 42:5-
22
Ghiamirad, M., A., Pourbakhsh, H., Keyvanfar, R., Momayez, S., Charkhkar., A. Ashtari,
2010. Isolation and characterization of Newcastle disease virus from ostriches in Iran.
A.J.M.R., 4(23): 2492-2497
Herrington CS, Coates PJ, Dupex WP. 2015. Viruses and Disease: Emerging Concepts for
Prevention, diagnosis and treatment. J Pathol 235: 149-152.
Hewajuli DA dan Dharmayanti NLPI. 2011. Patogenesitas Virus Newcastle Disease pada
Ayam. Wartazoa 21 (2) : 72 – 80.
Kencana, GAY. 2012. Penyakit Virus Unggas. Udayana University Press. Denpasar.
Knipe DM, Howley PM., editors (2001). Folds Virology. Philadelphia: Lippincott Williams
and Wilkins
Mac Lachlan NJ, Dubovi EJ, editor, 2011. Fenner’s . Veterinary Virology. 4 th ed. London.
Academic Press.
Mahardika I.G.N.K., Astawa I.N.M., Kencana G.A.Y., Suardana I.B.K., Sari T.K. 2015.
Teknik Lab Virus. Udayana Universuty Press. Denpasar.
Muslim D.A. 2002. Memelihara Ayam Kampung Sistem Baterai. Yogyakarta: Kanisius.
Naipospos TSP . 2004. Situasi terkini penyakit unggas di tanah air . Seminar Nasional
"Perdagangan Komoditi Peternakan dan upaya penanggulangan penyebaran penyakit
unggas" . Jakarta, 18 Mei 2004 . Poultry Indonesia. pp . 1-15
OIE 2008. Manual of Diagnostic Test and Vaccines for Terrestrial Animals. Paris: Office
international des Epizooties
Tabbu, C.R. 2000. Penyakit Ayam dan Penanggulangannya: Penyakit Bakterial, Mikal, dan
Viral. Kanisius, Yogyakarta.