Seminar Nasional Peternakan 3 tahun 2017

Universitas Hasanuddin Makassar, 18 September 2017

UJI PATHOGENITAS BAKTERI Pasteurella multocida ISOLAT LOKAL

MENGGUNAKAN POSTULAT KOCH
(Pathogenicity test of Pasteurella multocida local isolate using postulate koch)

Herliani1, Abrani Sulaiman1, dan M. Ilmi Hidayat2

1Fak. Pertanian Jurusan Peternakan Unlam, Banjarbaru,

Jl. Jenderal Ahmad Yani Km. 36 Banjarbaru 70714. Telp. 0511- 4781551
2Fak. Petanian Jurusan Agribisnis Uniska, Banjarmasin

Jl. Adhiyaksa No. 2, Kayu Tangi, Sungai Miai, Banjarmasin Utara,

Kota Banjarmasin, Kalimantan Selatan 70123 Telp. 0511- 3304352
Email. Herli4ni63@gmail.com

ABSTRAK

Penelitian bertujuan mengetahui apakah bakteri Pasteurella multocida yang

diisolasi dari kerbau rawa di HSU (Hulu Sungai Utara) merupakan penyebab
penyakit SE (Septicema Epizootica) pada kerbau rawa menggunakan Postulat Koch.
Sebanyak 10 ekor mencit Balb-C berumur 2 minggu diinfeksi dengan 100 µl
kultur yang mengandung 4 x 108 CFU (1,5 McFarland Scale) P. multocida secara
subcutan di daerah leher, dan diamati setiap 4 jam sampai hewan mati. Sampel
diambil dari limpa, paru-paru, dan jantung dengan waktu yang berbeda yaitu
kematian 15 jam, 35 jam, dan 59 jam dengan cotton swab steril. Sampel ditanam
pada media nutrient broth (NB), diinokulasi pada media trypticase soya agar
(TSA), dan diinkubasikan selama 24 jam dengan temperatur 37oC. Koloni
terpisah diwarnai dengan pewarnaan Gram dan pewarnaan spora. Koloni diuji
dengan uji katalase, biokimia, sulfit indol motility (SIM), gula-gula, dan ditanam
pada media Mac Conkey Agar. P. multocida diidentifikasi mengikuti metode
Carter menunjukkan sampel paru, limpa, dan jantung positif terinfeksi P.
multocida. Disimpulkan bahwa bakteri P. multocida yang diisolasi dari kerbau
rawa di HSU bersifat pathogen dan dapat menyebabkan penyakit SE.
Kata kunci : Pasteurella multocida, Postulat Koch, SE (Septicemia epizootica) dan
subcutan

ABSTRACT

The study was aimed to find out whether Pasteurella multocida bacteria
isolated from swamp buffalo in HSU (Hulu Sungai Utara) is the cause of
septicema epizootica (SE) disease in swamp buffaloes using Koch Postulates.
Total of 10 Balb-C mice aged 2 weeks were infected with 100 μl culture
containing 4 x 108 CFU (1.5 McFarland Scale) P. multocida subcutaneously in the
neck, and observed every 4 hours until the animal died. Samples were taken
from the spleen, lungs, and heart with different times of death within 15 hours,
35 hours, and 59 hours with sterile swab cotton. Samples were grown on a
nutrient broth medium (NB), inoculated on a soy trypticase agar (TSA), and
incubated for 24 hours at 37 °C. Separate colonies were stained with Gram and
spore staining. The colonies were tested by catalase, biochemical, indol motility
(SIM) sulfite, confectionary, and planted on Mac Conkey Agar media. P.
multocida was identified following Carter's method of showing lung, spleen, and

29
 Herliani, dkk

positively infected P. multocida samples. It was concluded that P. multocida

bacteria isolated from buffalo in HSU are pathogenic and can cause SE disease.
Key words: Pasteurella multocida, Koch postulates, SE (Septicemia epizootica) and
subcutaneous

PENDAHULUAN

Peternak kerbau rawa masih sering menghadapai berbagai macam

penyakit, salah satu diantaranya adalah penyakit menular pasteurellosis yang
disebabkan oleh kuman Pasteurella multocida. Organisme ini dapat menginfeksi
banyak spesies hewan piaraan maupun liar. Pasteurella multocida menyebabkan
penyakit infeksi serius seperti Kolera pada (unggas), Septikemia hemoragik
(kerbau) dan Rhinitis atrofi (babi), Masa inkubasi SH berkisar 2 – 5 hari. Pada
kasus yang akut penyakit ini umumnya diikuti kematian, tanpa adanya gejala
klinis yang nyata. Hal ini disebabkan karena multiplikasi bakteri yang sangat
cepat setelah masuk ke dalam tubuh penderita. Pencegahan dan pengendalian
penyakit dapat dilakukan dengan cara pemeliharan hewan yang baik, pemberian
antibiotik dan program vaksinasi. Penelitian tentang vaksin terus dilakukan
tetapi belum ada vaksin yang lama bertahan pemakaiannya. hal ini mungkin
disebabkan vaksin yang diberikan tidak bersifat protektif, yaitu karena adanya
perbedaan sifat antigenik antara isolat yang dipakai dengan isolat di lapangan
(yang menginfeksi ternak) .
Sebelum isolat bisa dibuat vaksin terlebih dahulu dilakukan uji untuk
mengetahui apakah isolat tersebut bersifat antigenik dengan uji Postulat Koch. .
Kriteria Postulat Koch mrnyatakan suatu organisme disebut sebagai penyebab
penyakit, maka organism tersebut harus memenuhi sejumlah syarat. Pertama,
ditemukan pada semua kasus dari penyakit yang telah diperiksa. Kedua, telah
diolah dan dipelihara dalam kultur murni (pure culture). Ketiga, mampu
membuat infeksi asli (original infection), meskipun sudah beberapa generasi
berada dalam kultur. Keempat, dapat diperoleh kembali dari hewan yang telah
diinokulasi dan dapat di kulturkan kembali.
Berdasarkan permasalahan tersebut penelitian ini perlu dilakukan. Tujuan
dari penelitian ini menguji bakteri Pasteurella multocida yang di isolat dari kerbau
rawa di HSU bersifat pathogen dan menyebabkan penyakit SE (Septicemia
Epizootica). Dan Isolat lokal Pasteurella multocida terpilih dapat dijadikan sebagai
kandidat vaksin.

MATERI DAN METODE

Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi Fak. Pertanian

Unlam Banjarbaru Kalimantan Selatan. Mulai bulan April sampai Juni 2015.
Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah Isolat bakteri Pasteurella
multocida yang diisolasi dari kerbau rawa di Hulu Sungai Utara Kalimantan
Selatan, yang disimpan di laboratorium Mikrobiologi Fakultas Pertanian
UNLAM. 10 ekor mencit Balb-C yang masing-masing berumur 2 minggu
diinfeksi dengan 100 µl ( 0,1 ml ) kultur yang mengandung 4 x 108 CFU ( 1,5
McFarland Scale ) P. multocida secara sub cutan di daerah leher, mencit diamati
setiap 4 jam sampai mati. Mencit yang mati dilakukan nekropsi dan diamati

30
 Seminar Nasional Peternakan 3 tahun 2017
Universitas Hasanuddin Makassar, 18 September 2017

perubahan – perubahan patologis yang terjadi. Pada saat pemeriksaan post

mortem, diambil juga berbagai sampel seperti paru – paru, lymfoglandula
prescapularis dan submandibularis, cairan oedema, tonsil, sumsum tulang, limpa,
cairan pericardium, cairan ruang perut dan darah jantung. Sesudah pemeriksaan
post mortem, bangkai mencit disimpan pada suhu kamar (tanpa pengawet) dan
sampel serupa seperti diatas diambil kembali pada saat 15 jam setelah kematian.
Sampel paru-paru, tensil, sumsum tulan, limpa, darah jantung kembali diambil
dari bangkai mencit pada waktu 35 dan 59 jam setelah kematian.

Uji Patogenitas pada mencit

Isolat yang sudah diidentifikasi kemudian diinkubasikan pada suhu 370C
selama satu malam. Dengan ose koloni disentuh, bakteri diinokulasikan pada
media cair brain hearth infusion serum (BHI) cair volume 10 ml diinkubasi pada
suhu 370C selama satu jam, ambil 10 ml campur dengan BHI cair baru
diinkubasi 3 jam sebelum diinjeksikan pada mencit 0,1 ml pada intramuscular
didaerah dada, pengukuran suhu dilakukan 4 jam sekali sampai mencit mati.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Setelah diinfeksi mencit mengalami kenaikan suhu tubuh mencapai

puncaknya pada 8 jam setelah infeksi dengan suhu 390C. Gejala yang terlihat
mata kemerah-merahan dan keluarnya cairan hidung, mencit mengalami
kematian pada 24 jam setelah infeksi Hasil pemantauan gejala klinis setelah
infeksi dapat dilihat pada Tabel 1.

Table 1. Pemantauan gejala klinis setelah di infeksi

Waktu Suhu Tubuh Gejala Klinis
Paska M1 M2 M3 M4 M1 M2 M3 M4
Infeksi (Kontrol) (Kontrol)
0 Jam 350C 360C 360C 350C N N N N
4 Jam 350C 370C 370C 350C N N N N
8 Jam 370C 380C 370C 360C N N N N
12 Jam 370C 380C 370C 350C N N N N
16 Jam 370C 38 C
0 37 C
0 360C N N N N
20 Jam 370C 380C 380C 360C N N N N
24 Jam 370C 380C 380C 360C Mata Mata Mata N
Merah Merah Merah
Keluar Keluar Keluar
Cairan Cairan Cairan
dihidung dihidun dihidung
28 Jam 370C 380C 380C 360C Gejala Gejala Gejala N
Di atas Di atas Di atas
Semakin Semakin Semakin
Parah Parah Parah dan
dan dan kematian
kematian kematian pada
pada pada mencit
mencit mencit
Keterangan:
 Data hasil penelitian dilakukan di laboratorium mikrobiologi UNLAM tanggal 27 April
2015
 N = Normal

31
 Herliani, dkk

Perubahan patologi yang terjadi pada organ mencit seperti paru, limpa,
dan jantung adalah warna ketiga organ tersebut sudah tidak seperti warna
normal yang berwarna merah segar tetapi sudah berwarna hitam dan organ juga
hancur saat akan diambil.
Hasil reisolasi bakteri Pasteurella multocida dari penelitian untuk uji
postulat Koch seperti pada Tabel 2 dibawah ini.
Tabel 2. Hasil Uji Postulat Koch
Sesudah Kematian
Organ 15 jam 35 jam 59 jam
Isolasi Isolasi Isolasi
Paru-paru + + +
Jantung + + +
Limpa + + +

Dari hasil pemeriksaan sampel paru, limpa, dan jantung hasil isolasi
ditemukan tiga sampel tersebut positif bakteri P. multocida. Hasil pewarnaan
Gram dan pemeriksaan mikroskopis, bakteri berbentuk coccobacillus (batang
pendek), bersifat Gram negatif, berantai pendek dan koloni berbentuk bulat
dengan permukaan cembung. Hal ini sesuai dengan pernyataan Kuhnert et al.
(2000) bahwa P. multocida merupakan bakteri Gram-negatif bentuk batang
pendek yang secara normal hidup di nasofaring. Sampel tidak tumbuh pada
media SIM, Simmon’s Citrat, laktosa, manitol, dan Mac Conkey akan tetapi
positif pada uji katalase. Rimler dan Rhoades (1989), menyatakan bahwa P.
multocida tidak tumbuh pada media Mac Conkey, memfermentasi glukosa,
positif terhadap tes katalase, oksidase, dan indol. Bakteri P. multocida biasanya
tidak memfermentasi laktosa
Hasil pewarnaan Gram setiap organ pada penelitian ini dapat dilihat
pada Gambar 1 (organ paru–paru), Gambar 2 (organ jantung), dan Gambar 3
(organ limpa).

Gambar 1. Pewarnaan Gram Bakteri P. multocida pada organ

paru–paru pembesaran 100x di bawah mikroskop.

32
 Seminar Nasional Peternakan 3 tahun 2017
Universitas Hasanuddin Makassar, 18 September 2017

Gambar 2. Pewarnaan Gram Bakteri P. multocida pada organ

jantung pembesaran 100x di bawah mikroskop.

Gambar 3. Pewaranaan Gram bakteri P. multocida pada organ

limpa pembesaran 100x di bawah mikroskop.

Hasil pewarnaan Gram di atas dapat dilihat bahwa bentuk koloni bakteri
bermacam – macam, hal ini sesuai dengan pernyataan Priadi & Natalia (2000)
bahwa koloni P. multocida tidak selalu seragam, tergantung beberapa faktor,
misalnya media yang digunakan, umur bakteri dalam penyimpanan, frekuensi
pemindahan bakteri, dan sebagainya. Koloni bakteri yang baru diisolasi dari
penderita atau hewan percobaan biasanya berbentuk mukoid (berlendir) dan
semakin lama menjadi bentuk smouth (halus) atau rough (kasar). Bakteri P.
multocida menimbulkan gas yang berbau.
Setelah pewarnaan Gram dilakukan maka dilanjutkan dengan pewarnaan
spora dari koloni terpisah yang telah diketahui Gram negatif. P. multocida
merupakan bakteri yang tidak memiliki spora. Spora terbentuk dalam sel
sehingga seringkali disebut sebagai endospora, dalam sel bakteri hanya terdapat
satu spora. Endospora tidak mudah ditembus zat warna sehingga tidak dapat
diwarnai dengan cara yang lazim. Pewarnaan spora memerlukan pemanasan
agar zat warna dapat meresap ke dalam spora. Zat warna pertama mengandung
hijau malakit (malachite green) yang akan mewarnai endospora menjadi hijau dan

33
 Herliani, dkk

safranin sebagai zat warna kedua akan mewarnai sel vegetatif menjadi merah.
Zat warna ini tidak berikatan erat dengan dinding sel dan sitoplasma sehingga
mudah terlepas sewaktu pencucian dengan air. Sebaliknya, air tidak dapat
menembus dinding endospora sehingga spora tetap bewarna hijau sewaktu
pencucian dengan air (Sunatmo, 2007). Hasil pewarnaan Spora pada penelitian
ini dapat dilihat pada Gambar 4 (organ paru – paru). Hasil uji yang diperoleh
dari sampel mencit yaitu disajikan pada Tabel 3.

Gambar 4. Pewarnaan Sporan bakteri P.multocida pada organ paru–

paru pembesaran 100 x di bawah mikroskop

Hasil uji yang tertera pada Tabel 3 menunjukkan hasil uji ini sesuai
dengan P. multocida menurut Cowan yang disitasi oleh Chotiah (1996), dimana
dikatakan bahwa P. multocida positif uji katalase, indol, MR, manitol, glukosa,
sukrosa, dan laktosa sedangkan pada uji VP, Simmon's Citrate, SIM, TSIA, dan
penanaman pada media Mac Conkey menunjukan hasil negatif

KESIMPULAN

Berdasarkan hasil penelitian uji pathogenitas bakteri Pasteurella multocida

isolat lokal menggunakan Postulat Koch. Menunjukkan bahwa bakteri
Pasteurella multocida yang di isolat dari kerbau rawa di HSU bersifat pathogen
dan dapat menyebabkan penyakit SE (Septicemia epizootica).

DAFTAR PUSTAKA

Brain, R.S. dan Jones, R.F. 1965. Studies on Haemorhagic septicamia of Cattle, 111. British
Veterinary Journal. III. 30-34.
Chotiah, S. 1996. Isolasi, Identifikasi dan penentuan serotip isolat Pasteurella multocida
dari lesi pneumonik paru-paru babi dan kepekaannya terhadap beberapa macam
antibiotika. JITV 3(2):198-203.
Esslinger.,J., Seleimn RS Herrmann G. and Blobel, (1994) Adhesin of P. multocide to Hela
Cells and to macrophages of different animal pecies Rev. Med Vet . 145: (1) 49 : 53 .

34
 Seminar Nasional Peternakan 3 tahun 2017
Universitas Hasanuddin Makassar, 18 September 2017

Kuhnert, P., P. Boerlin, S. Emler, M. Krawinkler, and J. Frey. 2000. Phylogenetic analysis
of Pasteurella multocida subspecies and molecular identification of feline P.
multocida subsp. septica by 16S RNA gene sequencing. Int. J. Med. Microbiol.
290:599-604
Priadi, A dan L. Natalia. 2000. Patogenesis Septicaemia epizoqtica (SE) pada sapi dan
kerbau. Gejala klinis, perubahan patologis, reisolasi, deteksi P. multocida dengan
media kultur dan Polymerase Chain Reaction (PCR). JITV. 5(1):65-71.
Rimler, R.B., and K.R. Rhoades. 1987. Serogroup OF, a new capsule serogroup of . J. Clin.
Microbiol. 30(2):46-52
Seleim, R.S. (1996): Study virulence factors of P. multocida isolated from different sources
New Egypt. JH. Med 14: (6), 60-64
Seleim RS (1997): Hyaluronic acid mediated adhesion of P. multocida to different lost
cells. New Egypt I Med 17(5): 440 – 444 .
Sunatmo TI. 2007. Eksperimen Mikrobiologi Dalam Laboratorium. Penerbit Ardy
Agency, Bogor

35
 Herliani, dkk

Tabel 3. Hasil identifikasi morfologi, sifat pewarnaan Gram, dan sifat biokimia
bakteri Pasteurella multocida

Hasil
Plate 1 Plate 3
Identifikasi Plate 2 Keterangan
(organ (organ paru-
(organ limpa)
jantung) paru)
Bakteri terlihat berwarna
1 Sifat Gram Negatif Negatif Negatif
merah
Bentuk Bakteri terlihat seperti batang
2 (Morfologi Coccobacillus Coccobacillus coccobacillus pendek dan kedua ujungnya
koloni dan sel) membulat
Media agar darah tidak terjadi
Hemolisis
3 Negatif Negatif Negatif pemudaran warna merah
Blood Agar
( lisis )
Bakteri hanya tumbuh pada
4 Motilitas Negatif Negatif Negatif
bekas tusukan
Bakteri berbentuk batang
pendek dengan ujung
membulat, ukuran kecil,
5 Mac Conkey Negatif Negatif Negatif warna merah muda,
permukaan smouth (lembut)
dan sifatnya laktosa
parlementer
Terjadi perubahan warna
6 O/F Positif Positif Positif media dari hijau menjadi
kekuningan
Terjadi perubahan warna
7 Glukosa Positif Positif Positif media dari merah menjadi
kuning
Terjadi perubahan warna
8 Laktosa Positif Positif Positif media dari merah menjadi
kuning (waktu lama)
Terjadi perubahan warna
9 Monnitol Positif Positif Positif media dari merah menjadi
kuning (waktu lama)
Terbentuk cincin berwarna
10 Indole Positif Positif Positif
merah
Tidak terjadi perubahan
11 Urease Negatif Negatif Negatif
warna pada media
warna pada stik oksidasi
12 Oksidase Positif Positif Positif
berubah berwarna biru
Terlihat gelembung pada
13 Katalase Positif Positif Positif media setelah ditambahkan
larutan H 2O2

36