BIOLOGI SEL DAN MOLEKULER

SEJARAH PERKEMBANGAN TEKNIK DIAGNOSTIK MOLEKULER

Disusun oleh

1. Alfiyyah Yasmiin (kelompok 10)

2. Ira Prabawati ( kelompok 10)
3. Sifa Ulpah ( kelompok 10)

JURUSAN ANALIS KESEHATAN

POLITEKNIK KESEHATAN KEMENKES BANTEN

2017
 Saat ini, perkembangan ilmu pengetahuan, khususnya dalam bidang
bioteknologi dan biologi molekuler berlangsung sangat pesat. Berawal dari
terungkapnya struktur dan fungsi DNA (Deoxyribonucleic acid) oleh Francis Crick pada
tahun 1958, kemudian disusul dengan ditemukannya enzim restriksi, pembuatan pustaka
gen berdasarkan situs restriksi, cloning sekuen DNA pada organisme prokaryot,
penggunaan berbagai macam penanda DNA (DNA marker) sampai akhirnya sintesis dan
penggandaan DNA secara in vitro serta sekuen genom dan analisisnya. Pada tahun
1985, Kary Mullis menemukan suatu teknik yang mampu mensintesis dan
menggandakan DNA secara in vitro dalam waktu relatif singkat dengan bantuan enzim
DNA polymerase dan beberapa bahan pokok lainnya. Teknik ini dinamakan Polymerase
Chain Reaction (PCR). Berkat karyanya tersebut, Kary Mullis mendapatkan hadiah
Nobel dalam bidang Kimia pada tahun 1993. Sintesis dan penggadaan DNA dengan
PCR ini berlangsung di luar sel organisme, tepatnya dalam suatu ”mesin PCR”. Pada
dasarnya prinsip yang terjadi dalam sintesis DNA tersebut sama dengan proses replikasi
DNA terjadi di dalam sel (in vivo).

Perkembangan sejarah bioteknologi molekuler.

Tahun Peristiwa
1917 Ereky memperkenalkan istilah bioteknologi.
1943 Penisilin diproduksi dalam skala industri.
1944 Avery, Macleod, McCarty mendemonstrasikan bahwa DNA adalah
bahan genetika.
1953 Watson dan Crick menentukan struktur DNA.
1961 Jurnal Biotechnology and Bioenginering ditetapkan.
1961-1966 Seluruh sandi genetika terungkapkan.
1970 Enzim retriksi endonuclease pertama kali diisolasi
1972 Khorana dan kawan – kawan berhasil mensintesis secara kimiawi
seluruh gen tRNA
1973 Boyer dan Cohen memaparkan teknologi DNA rekombinan
1975 Kohler dan Milstein menjabarkan produksi antibody monoclonal
1976 Perkembangan teknik – teknik untuk menentukan sekuen DNA
1978 Genentech menghasilkan insulin manusia dalam E. coli
 1980 Mikroorganisme hasil manipulasi genetika dapat dipatenkan (kasus
diamond vs Chak Raberti di Amerika Serikat)
1981 Untuk pertama kalinya automated DNA synthesizers dijual secara
komersial
1981 Untuk pertama kalinya Kit Diagnostik berdasar antibody disetujui
untuk dipakai di Amerika Serikat.
1982 Untuk pertama kalinya vaksin hewan hasil teknologi DNA
rekombinan disetujui pemakaiannya di Eropa
1983 Plasmidi hasil rekayasa genetika dipakai untuk transportasi tanaman
1988 US paten diberikan untuk mencit rentan kanker rekayasa Genetika.
1988 Metode Polimerase Chain Reaction dipublikasi.
1990 Percobaan terapi gen somatic pada manusia disetujui (Amerika)

Reaksi polimerase berantai atau dikenal sebagai polymerase chatau dikenal

sebagai polymerase chain reaction (PCR), merupakan suatu proses sintesis enzimatik
untuk mengamflikasikan nukleotida secara in vitro. Metode PCR dapat meningkatkan
jumlah urutan DNA sebanyak ribuan bahkan jutaan kali dari jumlah semula, sekitar 10 6
– 107 kali. Setiap urutan basa nukleotida yang diamplikasikan akan menjadi dua kali
jumlahnya. Pada setiap n siklus PCR akan di peroleh 2n kali banyaknya DNA target.
Kunci utama PCR adalah menemukan bagaimana cara amplifikasi hanya pada urutan
DNA target dan meminimalkan amplikasi urutan non-target.

Penggunaan PCR telah berkembang secara cepat seirama dengan perkembangan

biologi molekuler. PCR di gunakan untuk identifikasi penyakit genetik, infeksi oleh
virus, diagnosis dini penyakit seperti AIDS, profil genetic dalam forensik, aplikasi
dalam biodiversitas, evolusi biologi, mutasi gen secara langsung dan mengukur
kuantifikasi ekspresi mRNA di dalam sel ataupun jaringan. di dalam sel ataupun
jaringan. di dalam sel ataupun jaringan.
Teknik PCR pertama kali dikembangkan oleh Karry Mullis pada tahun 1985.
Teknik PCR dapat digunakan untuk mengamplifikasi segmen DNA dalam jumlah jutaan
kali hanya dalam beberapa jam. Awalnya amplifikasi dilakukan pada tubuh bakteri dan
memerlukan waktu beberapa minggu. Dengan menggunakan PCR, proses amplifikasi
dapat dilakukan dalam tabung dan hanya memerlukan waktu beberapa jam. PCR
menjadi sarana yang sensitif, selektif, dan sangat cermat untuk memperbanyak
rangkaian DNA yang diinginkan.

Spesifisitas ini berdasarkan pada penggunaan 2 primer oligonukleotida yang

berhibridisasi menjadi rangkaian komplementer pada untai DNA yang berlawanan.
Penemuan awal dari teknik PCR didasarkan pada tiga waterbaths yang mempunyai
temperatur yang berbeda. Thermal-cycler pertama kali dipublikasikan pada tahun 1986,
akan tetapi DNA polymerase awal yang digunakan masih belum thermostable, dan
harus ditambahkan disetiap siklusnya.

Kelemahan lain temperatur 37°C yang digunakan bisa dan menyebabkan non-specific
priming, sehingga menghasilkan produk yang tidak dikehendaki. Taq DNA polymerase
yang diisolasi dari bakteri Thermus aquaticus (Taq) dikembangkan pada tahun 1988.
Enzim ini tahan sampai temperature mendidih 100°C, dan aktifitas maksimal pada
temperatur 92-95°C. Dengan diketemukannya teknik PCR di samping juga teknik-
teknik lain seperti sekuensing DNA, telah merevolusi bidang sains dan teknologi
khususnya di bidang diagnosa penyakit genetik, kedokteran forensik dan evolusi
molekular.
Perkembangan Teknologi PCR
Teknologi PCR selalu mengalami inovasi mengikuti dan menjawab kebutuhan -
kebutuhan di bidang riset maupun diagnostik dan inovasi tersebut terjadi pada
komponen “software” yaitu enzim dan komponen kimia pendukungnya, komponen
“technique” yaitu metodologi PCR dan komponen “hardware” yaitu mesin PCR.isolasi,
kloning gen dan modifikasi dari enzim DNA polimerase. Sampai tahun 2013 saja sudah
diketahui ada 19 jenis DNA polimerase baik type A maupun B dengan karakteristik
unik hasil pengisolasiandari berbagai jenis thermotolerant bakteri (genus Themus,
Thermoccocus, dan Pyrococcus)

Metodologi PCR yang semula digunakan hanya untuk perbanyakaan DNA saja
sekarang sudah jauh mengalami perkembangan yang cukup memukau mengikuti
kebutuhan akan analisa berdasarkan kasus yang sedang terjadi. Inovasi terkait
technique” PCR yang kini berkembang memiliki peranan cukup signifikan pada hasil-
hasil penelitian dewasa ini terutama pada bidang kedokteran seperti prediksi suatu
penyakti atau mengukur efektivitas suatu obat melalui perhitungan jumlah kopi gen,
analisa keragaman gen pembawa penyakit atau analisa mutasi gen. Metode-metode itu
antara lain COLD (Coamplification at Low Denaturation Temperature)-PCR, PNAC
(Peptide Nucleic Acid clamp)PCR,Supression PCR dan TETRA ARMS (Amplification
Refractory Mutation System)-PCR
 Metode –Metode PCR terkini :

Metode Prinsip Fungsi Aplikasi

COLD PCR Denaturasi selektif mismatch Pengayaan 1. Pengayaan gen KRAS dan
/heterodupleks DNA fragmen DNA yang gen P53 yang emembawa
(campuran DNA tipe mengandung mutasi yang
mutan dengan tipe wild mutasi pada jumlahnya sedikit pada
nya) pada Tc (suhu critikal) populasi suatu sel kanker paru
sel dan deteksi 2. Deteksi mutasi DNA
mutasi gen BRAF dan K-ras pada
kolon kanker
3. meningkatkan akurasi
deteksi mutasi K-ras
dengan metode analisa
kurva leleh (melting curve)

PNAC PCR Penghambatan secara selektif Deteksi mutasi gen Deteksi mutasi KRAS
perbanyakan pada kanker kolon dengan
fragmen DNA tipe wild tingkat sensitivtas dan
menggunakan oligo peptida spesifitas yang cukup
tinggi
Suppression PCR Ampflifikasi spesifik pada Deteksi Keragaman Deteksi type alele gen
daerah SS loop dari hairpin Gen thrombin III, interleukin 1α,
DNA yang terbentuk dari insulin like growth factor II,
ikatan komplemetari yang aldolase B, alfa microglobulin,
kuat pada ujung-ujung linker Low Density Lipoprotein
menggunakan primer spesifik
gen
TETRA ARMS Amplifikasi fragmen Deteksi keragaman Deteksi mutasi gen
PCR gen spesifik menggunakan gen dan mutasi PI3KCA exon 9 dan 20
sepasang primer pengamit pada kanker payudara
(flanking
primer) dan sepasang primer
internal yang berposisi saling
berlawanan arah

Inovasi “hardware” PCR setidaknya pada saat ini terdapat empat jenis mesin PCR
yang sudah dikembangkan dan digunakan pada penelitian dan diagnostik yaitu:
1. mesin PCR konvensional.
2. mesin PCR konvensional dengan program gradient temperature
3. Real – Time PCR,dan
4. droplet digital PCR

Mesin PCR yang dilengkapi dengan gradient temperature memiliki fungsi utama
yaitu optimasi suhu annealing primer secara paralel pada pemakainya untuk
mendapatkan suhu annealing terbaik yang akan diterapkan pada perbanyakan DNA
selanjutnya. Pengguna tinggal memilih suhu annealing
yang diingikan yang mengacu pada nilai Tm (Melting Temperature) primer
dikurangi5oC
Real – Time PCR dengan teknologi komputerisasi yang handal dimana feature yang
tawarkan sudah sangat lengkap termasuk program gradient temperature. Real Time PCR
memiliki keunggulan dalam hal:
1. kemampuan dalam menghitung secara tepat jumlah DNA yang diperbanyak tiap
siklusnya yang memungkinkan material genetika yang terdapat pada sampel
dapat dihitung secara tepat pula.
2. perbanyakan DNA selama proses PCR berlangsung bisa diamati secara langsung
(Real- Time).
 3. menawakan beragam jenis deteksi seperti mutasi, genotyping perhitungan
jumlah sel dan ekspresi gendan
4. mengeliminasi keharusan analisa lebih lanjut seperti elektroforesis yang
merupakan keterbatasan dari PCR konvesional.

Real-Time PCR adalah suatu metode analisa yang dikembangkan dari reaksi PCR.
Real time ini juga dikenal sebagai quantitative real time polymerase chain reaction atau
Q-PCR. Teknik ini dapat digunakan untuk mengamplifikasi sekaligus menghitung
jumlah target molekul DNA hasil amplifikasi tersebut. Pada analisa PCR konvensional,
deteksi keberadaan DNA dilakukan pada akhir reaksi dan pengamatan masih harus
dilakukan dengan elektroforesis, namun analisa menggunakan Real-Time PCR
memungkinkan untuk dilakukan pengamatan pada saat reaksi berlangsung sehingga
tidak perlu dilakukan elektroforesis.

Teknologi terkini dari mesin PCR yaitu droplet digital PCR yang dikembangkan
oleh perusahaan ternama Bio – Rad - Ltd. Alih - alih proses amplifikasi DNA dilakukan
dalam sistem aquoes, dalam droplet digital PCR sintesis DNA dilakukan secara
enkapsulasi air yang teremulsi dalam minyak. Metode partisi ini menyebabkan
perhitungan atau analisa DNA dengan droplet digital PCR begitu tinggi ketepatannya.
PCR jenis ini memberikan keunggulan - keunggulan luar biasa untuk berbagai tujuan
penelitian maupun diagnostik seperti :
1. analisa keragaman jumlah kopi DNA
2. deteksi mutasi DNA yang langka
3. ekspresi gen dan analisa microRNA
4. aplikasinya dalam Next Generation Sequencing (NGS) dan
5. analisa aktivitas enzim dengan resolusi skala sel tunggal (single cell)

Teknologi terkini dari mesin PCR yaitu Droplet Digital PCR yang dikembangkan
oleh perusahaan ternama Bio-Rad Ltd. Alih-alih proses amplifikasi DNA dilakukan
dalam sistem aqueous, dalam droplet digital PCR sintesis DNA dilakukan secara
enkapsulasi air yang teremulsi dalam minyak. Metode partisi ini menyebabkan
perhitungan atau analisa DNA dengan droplet digital PCR memiliki ketepatan yang
sangat tinggi. Droplet digital PCR memiliki berbagai keunggulan luar biasa untuk
berbagai tujuan penelitian ataupun diagnostik seperti: (1) analisa keragaman jumlah
kopi DNA, (2) deteksi mutasi DNA yang langka, (3) ekspresi gen dan analisa
microRNA, (4) aplikasi dalam Next Generation Sequencing (NGS), dan (5) analisa
aktivitas enzim dengan resolusi skala sel tunggal (single sel). Tidak menutup
kemungkinan beberapa tahun lagi dari sekarang dengan semakin canggihnya teknologi
komputer dan berkembangnya ilmu material dan bioteknologi dapat terwujud mesin
portable PCR dengan dimensi fisik yang cukup kecil tetapi memiliki berbagai feature
canggih di dalamnya. Jenis mesin PCR tersebut akan sangat membantu para pengguna
yang dinamis seperti peneliti kepurbakalaan, petugas kesehatan, dan petugas konservasi
yang menghasruskan proses PCR dan olah data di lapangan sehingga data yang
didapatkan akan lebih cepat dan akurat.
 DAFTAR PUSTAKA

1. Budiarto, B.R. 2005. Polymerase Chain Reaction (PCR) : Perkembangan Dan

Perannya Dalam Diagnostik Kesehatan. Vol 6, No. 2 Dari website
(http://terbitan.biotek.lip.go.id/ondex.php/biotrebds/article/viewFile/129/134)
2. Fachiyah. Estri,L.A.Sri Widyarti. Rahayu Sri.2011 Biologi Molekuler – Prinsip
Dasar Analisis, Erlangga,Jakarta.
3. Suwanto Antonius. 1998. Bioteknologi Molekuler:Mengoptimalkan Manfaat
Keanekaan Hayati Melalui Teknologi DNA Rekombinan. Vol 5 Hal 27. Jurnal
Bioteknologi Molekuler. Kota Bogor.