PTK1 - 5 Spektrofotometri
PTK1 - 5 Spektrofotometri
Serapan cahaya oleh molekul dalam daerah spektrum ultraviolet dan visibel
tergantung pada struktur elektronik dari molekul. Spektra ultraviolet dan visibel dari
senyawa-senyawa organik berkaitan erat dengan transisi diantara tingkatan-tingkatan
1
tenaga elektronik. Oleh karena itu, maka serapan radiasi UV-Vis sering dikenal dengan
spektroskopi elektronik (Basset et al., 1994).
Ketika sinar melewati suatu senyawa, energi dari sinar digunakan untuk
mendorong perpindahan elektron dari orbital ikatan atau orbital non-ikatan ke salah satu
orbital anti-ikatan yang kosong (Clark, 2007). Perpindahan/lompatan elektron yang
mungkin terjadi akibat adanya sinar adalah:
Lompatan yang lebih besar membutuhkan energi yang lebih besar dan menyerap
sinar dengan panjang gelombang yang lebih pendek. Lompatan yang ditunjukan dengan
tanda panah abu-abu menyerap sinar UV dengan panjang gelombang yang lebih rendah
dari 200 nm (Clark, 2007).
Analisis kuantitatif zat tunggal atau SCA (Single Component Analysis) dilakukan
dengan pengukuran harga A pada panjang gelombang maksimum atau dilakukan
pengukuran %T pada panjang gelombang minimum. Pengukuran dilakukan pada
panjang gelombang tersebut karena perubahan absorban tiap satuan konsentrasi adalah
paling besar pada panjang gelombang maksimum, sehingga akan diperoleh kepekaan
analisis yang maksimal. Di samping itu, pita serapan di sekitar panjang gelombang
maksimum datar dan pengukuran ulang akan menghasilkan kesalahan terkecil.
Jika absorbsi suatu seri konsentrasi larutan diukur pada panjang gelombang, suhu,
kondisi pelarut yang sama; dan absorbansi masing-masing larutan diplotkan terhadap
konsentrasinya, maka suatu garis lurus akan teramati sesuai dengan persamaan A = ɛbc.
Grafik ini disebut dengan plot hukum Lambert-Beer dan jika garis yang dihasilkan
merupakan suatu garis lurus maka dapat dikatakan bahwa hukum Lambert-Beer
dipenuhi pada kisaran konsentrasi yang teramati. Cara lain untuk menetapkan kadar
sampel adalah dengan menggunakan perbandingan absorbansi sampel dengan
2
absorbansi baku atau dengan menggunakan persamaan regresi linier yang menyatakan
hubungan konsentrasi baku dengan absorbansinya (Gandjar dan Rohman, 2008).
Data spektra UV-Vis secara tersendiri tidak dapat digunakan untuk identifikasi
kualitatif obat atau metabolitnya. Sedangkan pada aspek kuantitatif, suatu berkas radiasi
dikenakan pada cuplikan (larutan sampel) dan intensitas sinar radiasi yang diteruskan
diukur besarnya. Radiasi yang diserap oleh cuplikan ditentukan dengan
membandingkan intensitas sinar yang diteruskan dengan intensitas sinar yang diserap
jika tidak ada spesies penyerap lainnya. Intensitas atau kekuatan radiasi cahaya
sebanding dengan jumlah foton yang melalui satu-satuan luas penampang per detik.
Besarnya intensitas energi REM yang diabsorbsi proporsional dengan jumlah
kromofornya (konsentrasinya), dan hubungan proporsional ini dirumuskan dalam
bentuk persamaan Hukum Lambert Beer :
A=ɛ bc
Keterangan :
A = Absorbansi
c = Konsentrasi (mg/mL)
b. Penyerapan terjadi dalam suatu volume yang mempunyai luas penampang yang sama.
c. Senyawa yang menyerap dalam larutan tersebut tidak tergantung terhadap yang lain
dalam larutan tersebut.
Dengan mengetahui nilai absorbansi dari larutan sampel, melalui kurva kalibrasi
dapat ditentukan konsentrasinya. Penetapan kadar parasetamol juga dapat ditentukan
melalui persamaan regresi linier :
y = bx + a
Apabila suatu REM dikenakan kepada suatu larutan dengan intensitas radiasi
semula (I0), maka sebagian radiasi tersebut akan diteruskan (It), dipantulkan (Ir) dan
diabsorbsi (Ia), sehingga :
3
I 0 = It + I r + I a
Ada beberapa hal yang harus diperhatikan dalam analisa dengan spektofotometri
UV-Vis, terutama untuk senyawa yang semula tidak berwarna yang akan dianalisis
dengan spektrofotometri visibel karena senyawa tersebut harus diubah terlebih dahulu
menjadi senyawa yang berwarna (Gandjar dan Rohman, 2008).
Hal ini perlu dilakukan jika senyawa yang dianalisis tidak menyerap pada daerah
tersebut. Cara yang digunakan adalah dengan merubah menjadi senyawa lain atau
direaksikan dengan pereaksi tertentu. Pereaksi yang digunakan harus memenuhi
beberapa persyaratan tertentu yaitu:
Cara ini biasa digunakan untuk pengukuran hasil reaksi atau pembentukan
warna. Tujuannya untuk mengetahui waktu pembentukan yang stabil. Waktu
operasional ditentukan dengan mengukur hubungan antara waktu pengukuran dengan
absorbansi larutan (Gandjar dan Rohman, 2008).
Pada saat awal terjadi reaksi, absorbansi senyawa yang berwarna ini meningkat
sampai waktu tertentu hingga diperoleh absorbansi yang stabil. Semakin lama waktu
pengukuran, maka ada kemungkinan senyawa yang berwarna tersebut menjadi rusak
atau terurai sehingga intensitas warnanya turun akibatnya absorbansinya juga turun.
Karena alasan inilah, maka untuk pengukuran senyawa berwarna (hasil suatu reaksi
kimia) harus dilakukan pada saat waktu operasional (Gandjar dan Rohman, 2008).
4
2. Di sekitar panjang gelombang maksimal, bentuk kurva absorbansi datar dan
pada kondisi tersebut hukum Lambert-Beer akan terpenuhi.
Dibuat seri larutan baku dari zat yang akan dianalisis dengan berbagai
konsentrasi. Masing-masing absorbansi larutan dengan berbagai konsentrasi diukur,
kemudian dibuat kurva yang merupakan hubungan antara absorbansi
A. Sistem Optik
SR→M→SK→D→A→VD
Keterangan :
SR : Sumber radiasi
M : Monokromator
SK : Sampel Kompartemen
D : Detektor
5
ketelitian dan ketepatan optimal, sehingga akan diperoleh hasil pengukuran dan
tingkat ketelitian dan ketepatan yang tinggi (Tim Penyusun, 2008).
B. Instrumentasi
1. Sumber radiasi
2. Monokromator
Sel atau kuvet merupakan wadah sampel yang akan dianalisis. Ditinjau dari
cara pemakaiannya dan dari bahan yang dipakai, kuvet dibedakan menjadi kuvet
permanen yang terbuat dari leburan silika (dipakai pada panjang gelombang 190-
1100 nm) atau gelas (dipakai pada panjang gelombang 380-1100 nm), dan kuvet
disposable satu kali pemakaian yang terbuat dari Teflon atau plastik. Disamping
itu ada kuvet yang bermulut lebar untuk mengukur kadar zat dalam pelarut yang
tidak mudah menguap dan kuvet bermulut sempit untuk mengukur kadar zat aktif
dalam pelarut yang mudah menguap (Tim Penyusun, 2008).
4. Detektor
Kepekaan yang tinggi terhadap radiasi yang diteriama, dengan derau yang
minimal.
6
Respon harus kuantitatif dan sinyal elektronik yang keluar berbanding lurus
dengan radiasi elektromagnetik yang diterima.
1. Detektor Fotosel
Detektor fotosel terdiri dari katoda sensitive tinggi dalam bentuk setengah
silinder logam yang dievakuasi. Anoda sepanjang sumbu fotosel tabung
lebih sensitif dibandingkan sel fotovoltatik.
Detektor yang terdiri atas suatu tatanan yang teratur (array) dari foto diode
aktif dalam jumlah yang sangat banyak (330 buah). Tiap fotodiode
memberikan respon spesifik terhadap radiasi dengan panjang gelombang
tertentu, sehingga radiasi elektromagnetik dengan rentang panjang
gelombang yang luas (UV-Vis) dapat diterima dengan serempak. Hal ini
mengakibatkan proses scanning dapat berlangsung dengan cepat.
Keunggulan detektor ini dibandingkan detektor lain adalah sumber
radiasinya tunggal, radiasi yang diukur polikromatis, sehingga sampel
kompartemen terbuka, wavelength reproducibility karena tidak ada gerakan
mekanis untuk mengatur panjang gelombang, dan kecepatan scanning
sangat tinggi (Tim Penyusun, 2008). Suatu diode array terdiri atas
serangkaian detektor fotodiode yang posisinya berdampingan dengan kristal
silikon. Susunan tersebut biasnya mengandung antara 200 dan 100 elemen
tergantung pada instumennya. Siklus pindah lebih kurang 100 mili detik.
Cahaya dilewatkan melalui suatu polikromator yang menghamburkannya
sehingga jatuh pada diode array, yang akan mengukur seluruh rentang
spectrum sekaligus.
7
Permasalah analisis dapat terjadi akibat adanya kesalahan pengukuran
pada detektor, antara lain disebabkan oleh:
2.3 Linearitas
Linearitas biasanya dinyatakan dalam istilah variansi sekitar arah garis regresi
yang dihitung berdasarkan persamaan matematik data yang diperoleh dari hasil uji
analit dalam sampel dengan berbagai konsentrasi analit. Perlakuan matematik dalam
pengujian linearitas adalah melalui persamaan garis lurus dengan metode kuadrat
terkecil antara hasil analisis terhadap konsentrasi analit. Dalam beberapa kasus, untuk
memperoleh hubungan proporsional antara hasil pengukuran dengan konsentrasi analit,
data yang diperoleh diolah melalui transformasi matematik dulu sebelum dibuat analisis
regresinya. Dalam praktek, digunakan satu seri larutan yang berbeda konsentrasinya
antara 50 – 150% kadar analit dalam sampel. Di dalam pustaka, sering ditemukan
rentang konsentrasi yang digunakan antara 0 – 200%. Jumlah sampel yang dianalisis
sekurang-kurangnya delapan buah sampel blanko. Sebagai parameter adanya hubungan
linier digunakan koefisien korelasi r pada analisis regresi linier Y = a + bX. Hubungan
linier yang ideal dicapai jika nilai b = 0 dan r = +1 atau –1 bergantung pada arah garis.
Sedangkan nilai a menunjukkan kepekaan analisis terutama instrumen yang digunakan.
Parameter lain yang harus dihitung adalah simpangan baku residual (Sy). Dengan
menggunakan kalkulator atau perangkat lunak komputer, semua perhitungan matematik
tersebut dapat diukur :
A. ALAT B. BAHAN
1. Instrumentasi spektrofometer 1. HCl 1 N
UV-VIS single beam 2. NH4OH 6 N
2. Cuvet 3. Larutan sampel Cu(II)
8
3. Neraca / timbangan 4. Larutan standar Cu(II) 1 M
4. Labu ukur 50 mL dan 100 mL 5. Aquadest
5. Pipet tetes
6. Buret 50 mL
7. Labu semprot
8. Bulb
9. Statif + klem
10. Gelas ukur 50 mL
11. Pipet ukur 10 mL
No Kadar Absorbansi
1 0,00 0,000
2 0,04 0,013
3 0,12 0,053
4 0,20 0,092
5 0,40 0,189
VIII. PERHITUNGAN
9
Menentukan berat standar Cu(II) :
G = L × N × BE = 0,1 L × 1 mol × 249,5
g = 24,95 gram CuSO4.5H2O
L mol
Menentukan volume deret standar larutan Cu (II) :
V Cu(II) . M Cu(II) = V deret Cu(II) . M Cu(II)
1. V Cu(II) . M Cu(II) = V deret Cu(II) . M Cu(II)
V Cu(II) . 1 M = 50 mL . 0,00 M
50 mL . 0,00 M
V Cu(II)
1M
V Cu(II) = 0,00 mL
10
IX. PEMBAHASAN
Praktikum kali ini dilakukan untuk menentukan kadar CuSO4 dalam sampel
Cu(II) dengan spektrofotometri UV-Vis menggunakan kurva kalibrasi dan
persamaan garis regresi linier. Pada analisis komponen tunggal, jika absorbsi suatu
seri konsentrasi larutan diukur pada panjang gelombang, suhu, kondisi pelarut yang
sama; dan absorbansi masing-masing larutan diplotkan terhadap konsentrasinya
maka akan diperoleh suatu garis lurus yang memenuhi persamaan A = ɛ.b.c. Grafik
ini disebut dengan plot hukum Lambert-Beer dan jika garis yang dihasilkan berupa
garis lurus maka dapat dikatakan bahwa hukum Lambert-Beer masih berlaku pada
kisaran konsentrasi yang teramati.
Pada percobaan ini, larutan Cu(II) akan dibaca absorbansinya pada panjang
gelombang maksimumnya. Larutan Cu(II) ini kemudian diukur pada panjang
gelombang 580 nm. Pengukuran pada rentang panjang gelombang ini karena
panjang gelombang maksimum parasetamol berada pada rentang tersebut, yaitu 610
nm. Tujuan penggunaan larutan blanko adalah untuk membuat konsentrasi pelarut
menjadi nol sehingga tidak akan terukur oleh detektor dan tidak menggangu
11
pembacaan absorbansi sampel dan dengan demikian dapat memperkecil kesalahan.
Pengukuran dilakukan pada panjang gelombang maksimum karena pada λ
maksimum sensitivitas alat menjadi maksimum, sehingga perubahan absorbsi
sampel per satuan konsentrasi adalah yang terbesar. Selain itu, pita absorbsi di
sekitar panjang gelombang rata, sehingga kepekaaan analisis menjadi lebih baik dan
pengaturan ulang panjang gelombang akan menghasilkan kesalahan analisis yang
kecil. Adapun nilai absorbansi larutan standar Cu(II) pada panjang gelombang 580
nm berturut-turut adalah 0,000; 0,013; 0,053; 0,092; dan 0,189.
X. KESIMPULAN
Dari hasil percobaan yang dilakukan, maka dapat disimpulkan bahwa konsentrasi
sampel CuSO4 ialah 0,1302 M.
XI. TUGAS
1. Apa perbedaan spektrofotometer single beam dan double beam?
Spektrofotometer single beam (berkas tunggal).
Pada spektrofotometer ini hanya terdapat satu berkas sinar yang dilewatkan
melalui kuvet, blanko, larutan standar dan contoh diperiksa secara bergantian.
Spektrofotometer double beam (berkas ganda)
Pada alat ini sinar dari sumber cahaya dibagi menjadi 2 berkas oleh cermin yang
berputar (chopper).
- Berkas pertama melalui kuvet berisi blanko.
- Berkas kedua melalui kuvet berisi standar atau contoh.
Blanko dan contoh diperiksa secara bersamaan. Blanko berguna untuk
menstabilkan absorbansi akibat perubahan voltase atau Io dari sumber cahaya.
Dengan adanya blanko dalam alat, tidak perlu lagi mengontrol titik nol-nya
pada waktu-waktu tertentu.
12
o Sumber radiasi
o Monokromator
Sel atau kuvet merupakan wadah sampel yang akan dianalisis. Ditinjau
dari cara pemakaiannya dan dari bahan yang dipakai, kuvet dibedakan menjadi
kuvet permanen yang terbuat dari leburan silika (dipakai pada panjang
gelombang 190-1100 nm) atau gelas (dipakai pada panjang gelombang 380-
1100 nm), dan kuvet disposable satu kali pemakaian yang terbuat dari Teflon
atau plastik.
o Detektor
13
diinginkan, buka fotosel dan lewatkan berkas cahaya pada blangko dan “nol”
galvanometer didapat dengan menekan tombol sensitivitas. Lewatkan berkas
cahaya pada larutan sampel yang akan dianalisis. Skala absorbansi menunjukkan
absorbansi larutan sampel. Kemudian konsentrasi sampel akan didapatkan
berdasarkan Hukum Lambert-Beer.
4. Tentukan konsentrasi sampel dari hasil analisis yang diperoleh menggunakan regresi
linear dan Hukum Lambert Beer!
Keterangan :
Ast : Absorban standar
Asp : Absorban sampel
Csp : Konsentrasi sampel
Cst : Konsentrasi standar
A : Intersep
B : Slope
R2 : Koefisien korelasi
14
15