Eksperimen Meselson Stahl
Eksperimen Meselson Stahl
REVERSE TRANSCRIPTION
RESUME
Oleh:
Kelompok 4 / Kelas B
Dewi Cahyaningrum (140341807059)
Berdasarkan hasil penemun ahli genetika, pada manusia sintetis 1 untai DNA
baru terjadi kira-kira dengan kecepatan 3000 nukleotida per-menit. Sedangkan pada
sel bakteri sekitar 30.000 nukleotida yang ditambahkan pada untai DNA yang baru
dibentuk per-menitnya. Terdapat mekanisme seluler yang bertanggung jawab pada
proses replikasi DNA yang mengharuskan replikasi terjadi dengan cepat dan akurat.
Keakuratan replikasi DNA sangat menakjubkan, diperoleh rata-rata hanya terjadi 1
kesalahan 1 milyar pada saat penggabungan nukleotida yang terjadi setelah sintesis
dan pengoreksian kesalahan pada saat selama replikasi.Sintesis DNA seperti halnya
sintesis RNA, dan protein yang terjadi dalam 3 tahap yaitu: (1) Inisiasi, (2) Elongasi,
(3) Terminasi.
Replikasi Semikonservatif
Gambar 2. Tiga model yang memungkinkan terjadi pada saat replikasi DNA yaitu (a)
semikonservatif, (b) konservatif, (c) dispersif
Pada tahun 1958, Matthew Meselson dan Franklin Stahl mendemonstrasikan
sebuah replikasi semikonservatif pada kromosom Eschericia Coli. Kemudian pada
1962, John Cairns mendemonstasikan bahwa kromosom dari E. coli memiliki DNA
dengan untai ganda. Hasil presentasi dari Cairns, Meselson, dan Stahl bersama-sama
mereka ingin membuktikan bahwa sebenarnya DNA bereplikasi secara
semikonservatif pada E.coli.
Meselson dan Stahl menumbuhkan sel bakteri E.coli di dalam medium isotop
berat nitrogen (15N) yang telah disubstitusi menjadi normal, yaitu isotop ringan ( 14N)
sebagai penanda pada masing-masing medium. Basa purin dan pirimidin pada DNA
mengandung nitrogen. Kemudian DNA sel bakteri tumbuh pada medium yang
mengandung isotop (15N) dan memiliki kepadatan yang lebih tinggi (massa/unit
volume) dari pada DNA sel bakteri yang tumbuh pada medium yang mengandung
isotop (14N). Molekul DNA dengan kepadatan yang berbeda dapat dipisahkan oleh
equilibrium density-gradient centrifugation. Dengan menggunakan teknik inilah,
Meselson dan Stahl mampu membedakan diantara ketiga model replikasi DNA
melalui bentuk perubahan kepadatan pada DNA sel bakteri yang ditumbuhkan pada
medium (15N) dan medium (14N) yang disebut dengan eksperimen perpindahan
kepadatan.
Meselson dan Stahl mengambil sel-sel yang telah tumbuh pada medium yang
mengandung (15N) selama beberapa generasi (sehingga terkandung "berat" DNA),
kemudian sel-sel tersebut dicuci untuk menghapus medium yang mengandung ( 15N),
dan dipindahkan pada medium yang mengandung (14N). Selanjutnya sel dibiarkan
tumbuh pada medium (14N) pada periode waktu, kemudian DNA diekstraksi dan
dianalisis dalam CsCl untuk mencapai keseimbangan gradien kepadatan. Hasil
penelitian Meselson dan Stahl konsisten menunjukkan bahwa replikasi hanya dengan
replikasi semikonservatif. Semua DNA yang diisolasi dari sel setelah satu generasi
pertumbuhan pada medium yang mengandung (14N) memiliki setengah kerapatan
antara atau kerapatan antara. Kepadatan menengah ini biasanya disebut sebagai
kepadatan "hybrid". Setelah pertumbuhan dua generasi pada medium yang
mengandung (14N), setengah dari DNA merupakan kerapatan hybrid.
Gambar 3. Meselson dan Stahl mendemonstrasikan replikasi DNA semikonservatif di E.
coli. Diagram tersebut menunjukkan bahwa hasil percobaan Meselson dan Stahl yang
diharapkan jika kromosom E. coli bereplikasi semikonservatif.
Salah satu dari generasi hasil replikasi semikonservatif dari helix ganda induk
yang mengandung 15N pada medium yang mengandung 14N hanya akan menghasilkan
15
dua keturunan heliks ganda, yang keduanya memiliki N dalam satu untai (strand
14
yang lama) dan N di untai lainnya (strand yang baru). Molekul tersebut akan
menjadi kepadatan hybrid.
Gambar 4: Bukti replikasi semikonservatif kromosom pada kacang, Vicia faba. Hasil yang
diperoleh Taylor, Woods, dan Hughes (a, b) diprediksi oleh replikasi semikonservatif dari
DNA (c).
a. Model konservatif, yaitu dua rantai DNA lama tetap tidak berubah, berfungsi sebagai
cetakan untuk dua rantai DNA baru. Replikasi ini mempertahankan molekul dari
DNA lama dan membuat molekul DNA baru.
b. Model semikonservatif, yaitu dua rantai DNA lama terpisah dan rantai baru
disintesis dengan prinsip komplementasi pada masing-masing rantai DNA lama.
Akhirnya dihasilkan dua rantai DNA baru yang masing-masing mengandung satu
rantai cetakan molekul DNA lama dan satu rantai baru hasil sintesis.
c. c. Model dispersif, yaitu beberapa bagian dari kedua rantai DNA lama digunakan
sebagai cetakan untuk sintesis rantai DNA baru. Oleh karena itu, hasil akhirnya
diperoleh rantai DNA lama dan baru yang tersebar pada rantai DNA lama dan baru.
Replikasi ini menghasilkan dua molekul DNA lama dan DNA baru yang saling
berselang-seling pada setiap untai.
ROLLING CIRCLE REPLICATION
Rolling circle replication adalah salah satu tipe dari replikasi DNA dan terjadi
dalam replikasi pada organisme virus, bakteri, dan amfibi. Mekanisme rolling circle
replication digunakan untuk :
Contoh salah satu retrovirus yang kita kenal pada manusia yaitu penyakit
AIDS yang sisebabkan oleh Human Immunodeficiency Virus (HIV). AIDS merupakan
penyakit yang secara bertahap merusak kekebalan tubuh manusia yang mana pada
tahap perkembangannya seseorang akan kehilangan kemampuan untuk melawan
infeksi pathogen sehingga jika dibiarkan tanpa pengobatan penderita ini akan mati.
AIDS ditularkan dari satu orang ke orang lain melalui cairan tubuh seperti darah atau
air mani yang telah terkontaminasi dengan HIV. Gejala-gejala awal penyakit ini
seperti terserang flu sehingga individu yang terinfeksi HIV akan mengalami nyeri,
demam dan kelelahan, setelah beberapa minggu gejala-gejala ini mereda dan
kesehatan tampaknya pulih, namun gejala-gejala ini dapat berlangsung selama
beberapa tahun, virus terus berkembangbiak dan akan menyebar keseluruh tubuh,
menargetkan sel-sel khusus yang mempunyai peranan menjaga homeostatis tubuh.
Berikut ini akan dijelaskan mengenai siklus hidup HIV (Gambar 1)
a. Tahap 1: HIV berikatan/terkait dengan sel target melalui interaksi antara protein
gp120 yang terdapat pada virus dan protein reseptor seluler CD4 pada sel target.
b. Tahap 2: terjadi fusi yang memungkinkan inti virus masuk ke dalam sel target.
c. Tahap 3: RNA yang terkait dengan protein dilepaskan dari inti virus.
d. Tahap 4: reverse transcriptase mengkatalisis sintesis double strand DNA virus dari
single strand RNA virus dalam sitoplasma.
e. Tahap 5: Integrase mengkatalisis penyisipan DNA virus ke dalam DNA sel target
dalam nukleus.
f. Tahap 6: RNA polimerase seluler mentranskripsi DNA virus menjadi RNA virus.
g. Tahap 7a: Beberapa RNA virus berfungsi sebagai mRNA untuk sintesis protein virus.
h. Tahap 7b: Beberapa RNA virus membentuk genom virus keturunan.
i. Tahap 8: Partikel virus keturunan dirakit di dekat membran sel.
j. Tahap 9: Partikel virus progeni dikeluarkan dari sel dengan membentuk budding.
k. Tahap 10: Partikel virus bebas untuk menginfeksi sel-sel lain.
HIV ini merupakan virus yang sangat mematikan sehingga menjadi fokus dari
banyak peneliti di dunia, salah satu hasil dari penelitian adalah pemahaman secara
rinci bagaimana siklus hidup HIV. HIV memasuki sel inang memalui interaksi dengan
protein receptor CD4 yang terletak di permukaan sel, interaksi ini dimediasi oleh
glikoprotein yang biasa disebut gp120. Protein ini tertanam dalam lipid yang
mengelilingi virus, sesudah gp120 berikatan dengan receptor CD4, akan terjadi fusi
virus dengan sel target. Di dalam sel, membran lipid dan mantel protein yang
mengelilingi partikel virus akan terlepas, dan bahan-bahan dalam inti virus dilepaskan
ke dalam sitoplasma sel. Inti ini berisi dua untai tunggal RNA-virus yang identik dan
sejumlah kecil protein yang memfasilitasi replikasi genom, termasuk dua molekul
reverse transcriptase dari virus, satu terikat untuk setiap untai RNA virus.
Genom HIV panjang lebih dari 10 kilobasa, didalamnya ada beberapa gen,
tiga gen disebut dengan gag, pol dan wnv, ditemukan di semua retrovirus lain, gen gag
mengkode protein, gel pol mengkodekan enzim reverse transcriptase dan enzim lain
yang disebut integrase yang mengkatalis penyisipan bentuk DNA genom HIV ke
dalam kromosom, gen env mengkodekan glikoprotein.
Gambar 7. Konversi RNA HIV kedalam DNA Beruntai Ganda
Integrasi dari DNA virus dikatalisis oleh enzim integrase, yang memiliki
aktivitas endonuklease. Enzim integrase akan memotong DNA HIV di dekat ujung 3'
dari setiap untai atau pada kedua ujung LTRs (langkah 1). Ujung ini selanjutnya
digunakan untuk integrase-mengkatalis ikatan fosfodiester dalam sekuens target
dalam DNA sel inang. Proses ini menghasilkan formasi ikatan fosfodiester baru antara
ujung 3 DNA HIV dan 5 fosfat dalam DNA inang (langkah 2). Pada tahap akhir
integrasi, enzim seluler sepenuhnya mengintegrasikan DNA HIV ke dalam DNA
target, dan akan menciptakan situs duplikasi target (langkah 3). Genom HIV yang
terintegrasi kemudian menjadi bagian permanen dari genom sel inang, replikasi sama
seperti segmen lain dari DNA inang
Fungsi kode-fag yang bersangkutan dengan sintesis DNA dalam sel yang
terinfeksi dapat diidentifikasi dengan mutasi yang menghambat produksi fag matang.
fungsi fag penting diidentifikasi oleh mutasi yang mematikan bersyarat, yang jatuh ke
dalam tiga kelas fenotipik:
Mereka di mana tidak ada sintesis DNA sama sekali mengidentifikasi gen yang
produknya baik adalah komponen dari apparatus replikasi atau terlibat dalam
penyediaan prekursor (terutama yang hydroxymethylcytosine).
Mereka yang timbulnya sintesis DNA tertunda prihatin dengan inisiasi replikasi.
Mereka yang sintesis DNA dimulai tapi kemudian ditangkap termasuk fungsi
regulasi, ligase DNA, dan beberapa enzim yang bersangkutan dengan degradasi DNA
inang.
Ada juga gen yang tidak penting berkaitan dengan replikasi, termasuk mereka yang
terlibat dalam glikosilasi hydroxymethylcytosine dalam DNA.
Sintesis dari DNA T4 dikatalisis oleh agregat multienzim dirakit dari produk
dari sekelompok kecil gen penting.
Gen 32 protein (GP32) adalah protein yang mengikat yang sangat kooperatif
untai tunggal, yang dibutuhkan dalam jumlah stoikiometri. Ini adalah contoh pertama
dari jenisnya yang akan ditandai. Geometri dari cabang replikasi T4 dapat secara
khusus memerlukan protein fag-kode, karena E. coli SSB tidak dapat menggantikan.
GP32 yang membentuk kompleks dengan polimerase DNA T4; Interaksi ini bisa
menjadi penting dalam membangun cabang replikasi.
Gen 61 protein yang dibutuhkan dalam jumlah yang jauh lebih kecil daripada
kebanyakan protein replikasi T4. Ada sedikitnya sepuluh salinan gp61 per sel. (Ini
menghambat karakterisasinya. Hal ini diperlukan dalam jumlah kecil seperti yang
awalnya itu terjawab sebagai komponen penting, karena cukup hadir sebagai
kontaminan dari persiapan GP32!) Gene 61 protein memiliki aktivitas primase, yang
analog dengan DnaG dari E. coli. Primase mengakui urutan template yang 3'-TTG- 5
'dan mensintesis primer pentaribonucleotide yang memiliki urutan umum
pppApCpNpNpNp. Jika apparatus replikasi lengkap hadir, primer ini diperluas ke
dalam rantai DNA.
Gen 43 DNA polymerase memiliki aktivitas sintetis yang biasa 5'-3 '. yang
berhubungan dengan aktivitas proofreading 3'-5 'exonuclease. Ini mengkatalisis
sintesis DNA dan menghapus primer. Ketika T4 DNA polimerase menggunakan DNA
beruntai tunggal sebagai template, laju kemajuan tidak merata. enzim bergerak cepat
melalui daerah untai tunggal, tetapi hasil jauh lebih lambat melalui daerah yang
memiliki basis dipasangkan intrastrand struktur sekunder. Protein aksesori membantu
polimerase DNA dalam melewati rintangan tersebut dan mempertahankan kecepatan.
Sejauh ini kita telah berurusan dengan replikasi DNA hanya dalam hal
perkembangan replikasi untuk Kebutuhan untuk fungsi lain ditunjukkan oleh DNA-
delay dan DNA-penangkapan mutan. Tiga dari empat gen mutan DNA delay adalah
39, 52, dan 60, yang kode untuk tiga subunit dari T4 topoisomerase II. suatu kegiatan
yang diperlukan untuk menghapus superkoil dalam template (lihat Bagian 19,13,
topoisomerase Relax atau Perkenalkan superkoil dalam DNA). Peran penting dari
enzim ini menunjukkan bahwa T4 DNA tidak tetap dalam bentuk linear, melainkan
menjadi topologi dibatasi selama beberapa tahap replikasi. topoisomerase yang bisa
diperlukan untuk memungkinkan rotasi DNA depan cabang replikasi.
Snustad, D. P. dan Simmons, M. J. 2012. Principles of Genetics Sixth Edition. New York:
John Wiley & Sons, Inc.