EXPERIMENT MESELSON STAHL

ROLLING CIRCLE REPLICATION

REVERSE TRANSCRIPTION

REPLIKASI APARATUS PHAGE T4

RESUME

Disusun untuk memenuhi tugas matakuliah Genetika Lanjut

yang dibimbing oleh Prof. Dr. Siti Zubaidah, M.Pd

Oleh:
Kelompok 4 / Kelas B
Dewi Cahyaningrum (140341807059)

Ari Ashari (150341808373)

Frengky Neolaka (150341806355)

UNIVERSITAS NEGERI MALANG

PROGRAM PASCASARJANA
PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGI
FEBRUARI 2016
 EXPERIMENT MESELSON STAHL

Dasar Replikasi DNA secara in Vivo

Berdasarkan hasil penemun ahli genetika, pada manusia sintetis 1 untai DNA
baru terjadi kira-kira dengan kecepatan 3000 nukleotida per-menit. Sedangkan pada
sel bakteri sekitar 30.000 nukleotida yang ditambahkan pada untai DNA yang baru
dibentuk per-menitnya. Terdapat mekanisme seluler yang bertanggung jawab pada
proses replikasi DNA yang mengharuskan replikasi terjadi dengan cepat dan akurat.
Keakuratan replikasi DNA sangat menakjubkan, diperoleh rata-rata hanya terjadi 1
kesalahan 1 milyar pada saat penggabungan nukleotida yang terjadi setelah sintesis
dan pengoreksian kesalahan pada saat selama replikasi.Sintesis DNA seperti halnya
sintesis RNA, dan protein yang terjadi dalam 3 tahap yaitu: (1) Inisiasi, (2) Elongasi,
(3) Terminasi.

DNA merupakan molekul hidup karena mampu melakukan penggandaan diri

(replikasi). Fungsi ini disebut fungsi autokatalisis karena DNA mampu mensistesis
dirinya sendiri. Replikasi merupakan peristiwa sintesis DNA. Replikasi DNA dapat
terjadi dengan adanya sintesis rantai nukleotida baru dari rantai nukleotida lama.
Prosesnya dengan menggunakan komplementasi pasangan basa untuk menghasilkan
suatu molekul DNA baru yang sama dengan molekul DNA lama. Proses yang terjadi
tersebut dipengaruhi oleh enzim helikase, enzim polimerase, dan ligase. Ada tiga
kemungkinan terjadinya replikasi DNA, yaitu semikonservatif, konservatif, dan
dispersif.

Replikasi Semikonservatif

Ketika Watson dan Crick mempublikasikan mengenai DNA yang menyatakan

bahwa DNA memiliki struktur double helix mengusulkan bahwa dua rantai yang
komplemen pada double heliks membuka dan terpisah. tiap-tiap untainya membentuk
untai baru. Urutan basa tiap untai DNA “parent” digunakan sebagai template dan basa
akan berpasangan dengan komplemennya sehingga membentuk untai baru. Sebagai
contohnya Adenin yang terdapat pada untai DNA “parent” yang akan bertindak
sebagai template yang akan dihubungkan oleh ikatan hidrogen agar dapat berpasangan
dengan Timin yang terdapat pada untai DNA yang baru terbentuk. Mekanisme ini
disebut dengan replikasi semikonservatif (karena setengah molekul “induk/ parent”
masih tetap terjaga).

Gambar 1. Model replikasi semikonservatif DNA oleh Watson dan Crick

Pada replikasi konservatif, DNA indukan akan tetap terjaga/dipertahankan,

sedangkan untai baru dari DNA akan disintesis. Sedangkan pada model replikasi
dispersive, segmen dari kedua molekul untai DNA akan tetap dipertahankan dan
digunakan sebagai template untuk mensintesis segmen yang komplemen yang setelah
itu akan bergabung untuk menghasilkan keturunan untai DNA yang baru.

Gambar 2. Tiga model yang memungkinkan terjadi pada saat replikasi DNA yaitu (a)
semikonservatif, (b) konservatif, (c) dispersif
 Pada tahun 1958, Matthew Meselson dan Franklin Stahl mendemonstrasikan
sebuah replikasi semikonservatif pada kromosom Eschericia Coli. Kemudian pada
1962, John Cairns mendemonstasikan bahwa kromosom dari E. coli memiliki DNA
dengan untai ganda. Hasil presentasi dari Cairns, Meselson, dan Stahl bersama-sama
mereka ingin membuktikan bahwa sebenarnya DNA bereplikasi secara
semikonservatif pada E.coli.

Meselson dan Stahl menumbuhkan sel bakteri E.coli di dalam medium isotop
berat nitrogen (15N) yang telah disubstitusi menjadi normal, yaitu isotop ringan ( 14N)
sebagai penanda pada masing-masing medium. Basa purin dan pirimidin pada DNA
mengandung nitrogen. Kemudian DNA sel bakteri tumbuh pada medium yang
mengandung isotop (15N) dan memiliki kepadatan yang lebih tinggi (massa/unit
volume) dari pada DNA sel bakteri yang tumbuh pada medium yang mengandung
isotop (14N). Molekul DNA dengan kepadatan yang berbeda dapat dipisahkan oleh
equilibrium density-gradient centrifugation. Dengan menggunakan teknik inilah,
Meselson dan Stahl mampu membedakan diantara ketiga model replikasi DNA
melalui bentuk perubahan kepadatan pada DNA sel bakteri yang ditumbuhkan pada
medium (15N) dan medium (14N) yang disebut dengan eksperimen perpindahan
kepadatan.

Meselson dan Stahl mengambil sel-sel yang telah tumbuh pada medium yang
mengandung (15N) selama beberapa generasi (sehingga terkandung "berat" DNA),
kemudian sel-sel tersebut dicuci untuk menghapus medium yang mengandung ( 15N),
dan dipindahkan pada medium yang mengandung (14N). Selanjutnya sel dibiarkan
tumbuh pada medium (14N) pada periode waktu, kemudian DNA diekstraksi dan
dianalisis dalam CsCl untuk mencapai keseimbangan gradien kepadatan. Hasil
penelitian Meselson dan Stahl konsisten menunjukkan bahwa replikasi hanya dengan
replikasi semikonservatif. Semua DNA yang diisolasi dari sel setelah satu generasi
pertumbuhan pada medium yang mengandung (14N) memiliki setengah kerapatan
antara atau kerapatan antara. Kepadatan menengah ini biasanya disebut sebagai
kepadatan "hybrid". Setelah pertumbuhan dua generasi pada medium yang
mengandung (14N), setengah dari DNA merupakan kerapatan hybrid.
 Gambar 3. Meselson dan Stahl mendemonstrasikan replikasi DNA semikonservatif di E.
coli. Diagram tersebut menunjukkan bahwa hasil percobaan Meselson dan Stahl yang
diharapkan jika kromosom E. coli bereplikasi semikonservatif.

Salah satu dari generasi hasil replikasi semikonservatif dari helix ganda induk
yang mengandung 15N pada medium yang mengandung 14N hanya akan menghasilkan
15
dua keturunan heliks ganda, yang keduanya memiliki N dalam satu untai (strand
14
yang lama) dan N di untai lainnya (strand yang baru). Molekul tersebut akan
menjadi kepadatan hybrid.

Replikasi konservatif tidak menghasilkan molekul DNA dengan kepadatan

hybrid, karena setelah dihasilkan satu generasi DNA hasil dari replikasi konservatif
berat DNA dalam medium menjadi ringan, sehingga setengah dari DNA masih akan
memiliki berat yang lebih apabila dibandingkan dengan setengah lainnya yang akan
menjadi lebih ringan. Jika replikasi dispersif, Meselson dan Stahl mengamati
perubahan berat DNA terhadap cahaya dalam setiap generasi (yaitu dengan
mengamati setengah berat atau hybrid setelah satu generasi, kuartal berat setelah dua
generasi, dan sebagainya). Hasil dari percobaan Meselson dan Stahl memiliki
kemungkinan-kemungkinan yang tidak konsisten. Replikasi DNA selanjutnya terbukti
terjadi secara semikonservatif di beberapa mikroorganisme.
 Replikasi semikonservatif pada kromosom eukariotik pertama kali dibuktikan
pada tahun 1957 dengan hasil percobaan yang dilakukan oleh J. Herbert Taylor, Philip
Woods, dan Walter Hughes pada sel-sel ujung akar Vicia faba. Taylor dan rekannya
memberikan label pada kromosom Vicia faba yang diambil bagian pertumbuhan
ujung akarnya selama delapan jam (kurang dari satu generasi sel) pada medium yang
mengandung radioaktif 3H-timidin. Sel-sel pada ujung akar tersebut kemudian
dipindahkan dari medium yang mengandung radioaktif, dicuci, dan dipindahkan pada
medium non radioaktif yang mengandung alkaloid colchicine. Hal tersebut dilakukan
karena diketahui bahwa colchicine dapat mengikat mikrotubulus dan mencegah
pembentukan spindle fungsional. Akibatnya, kromosom keturunannya tidak
mengalami anafase normal. Dengan demikian, jumlah kromosom per inti akan
berlipat ganda per siklus sel apabila menggunakan colchicine. Hal tersebut
mengakibatkan jumlah kromosom dua kali lipat untuk setiap generasi sel. Taylor dan
rekan-rekannya menentukan berapa banyak DNA ulangan dari setiap sel yang telah
mengalami penggabungan tersebut dari timidin radioaktif. Pada metafase pertama di
colchicine (c-metafase), inti akan berisi 12 pasang kromatid (masih bergabung di
sentromer). Pada kedua c-metafase, inti akan berisi 24 pasang, dan sebagainya.

Taylor dan rekan-rekannya menggunakan teknik yang disebut autoradiografi

untuk memeriksa distribusi radioaktivitas dalam kromosom pada sel pada saat c-
metafase yang pertama, c-metafase kedua, dan sebagainya. Autoradiografi adalah
metode untuk mendeteksi dan lokalisasi radioaktif isotop dalam persiapan sitologi
atau makromolekul oleh pencahayaan fotografi terhadap emulsi yang sensitif terhadap
radiasi energi rendah. Emulsi tersebut mengandung halida perak yang menghasilkan
bintik-bintik hitam kecil disebut butir perak. Ketika butiran perak terkena partikel
bermuatan yang dipancarkan selama peluruhan isotop radioaktif. Autoradiografi
sangat berguna dalam mempelajari metabolisme DNA karena DNA dapat diberi label
khusus menurut sel yang tumbuh di 3H-timidin, adeoxyribonucleoside timin yang
berisi isotop radioaktif hydrogen (tritium).

Ketika Taylor dan rekannya menggunakan autoradiografi untuk memeriksa

distribusi radioaktivitas dalam kromosom Vicia faba pada saat pertama c-metafase,
kedua kromatid dari setiap pasangan merupakan radioaktif. Namun pada c-metafase
yang kedua, hanya salah satu kromatid dari setiap pasangan yang merupakan
radioaktif. Hasil tersebut merupakan yang diharapkan jika replikasi DNA adalah
 semikonservatif, memberikan molekul DNA satu per kromosom. Pada tahun 1957,
Taylor dan rekan-rekannya mampu menyimpulkan bahwa DNA kromosom pada Vicia
faba dipisahkan dalam semikonservatif. Kesimpulan bahwa double helix direplikasi
semikonservatif dalam kacang harus menunggu bukti selanjutnya menunjukkan
bahwa setiap kromosom mengandung molekul DNA. Percobaan annalog kemudian
dilakukan dengan beberapa eukariota lainnya, dan, dalam semua kasus, hasilnya
menunjukkan bahwa replikasi terjadi secara semikonservatif.

Gambar 4: Bukti replikasi semikonservatif kromosom pada kacang, Vicia faba. Hasil yang
diperoleh Taylor, Woods, dan Hughes (a, b) diprediksi oleh replikasi semikonservatif dari
DNA (c).

Point penting dari Replikasi DNA :

a. Model konservatif, yaitu dua rantai DNA lama tetap tidak berubah, berfungsi sebagai
cetakan untuk dua rantai DNA baru. Replikasi ini mempertahankan molekul dari
DNA lama dan membuat molekul DNA baru.
b. Model semikonservatif, yaitu dua rantai DNA lama terpisah dan rantai baru
disintesis dengan prinsip komplementasi pada masing-masing rantai DNA lama.
Akhirnya dihasilkan dua rantai DNA baru yang masing-masing mengandung satu
rantai cetakan molekul DNA lama dan satu rantai baru hasil sintesis.
c. c. Model dispersif, yaitu beberapa bagian dari kedua rantai DNA lama digunakan
sebagai cetakan untuk sintesis rantai DNA baru. Oleh karena itu, hasil akhirnya
diperoleh rantai DNA lama dan baru yang tersebar pada rantai DNA lama dan baru.
Replikasi ini menghasilkan dua molekul DNA lama dan DNA baru yang saling
berselang-seling pada setiap untai.
 ROLLING CIRCLE REPLICATION

Rolling circle replication adalah salah satu tipe dari replikasi DNA dan terjadi
dalam replikasi pada organisme virus, bakteri, dan amfibi. Mekanisme rolling circle
replication digunakan untuk :

1. menggandakan genom pada virus (menduplikasi genom mereka),

2. pada bakteri, mekanisme ini digunakan untuk mentransfer DNA dari sel donor ke sel
resipie (penerima) selama satu jenis pertukaran genetik dan
3. pada amfibi, mekanisme ini terjadi saat oogenesis dalam rangka mengamplifikasi
DNA ekstrakromosomal yang membawa kumpulan gen-gen RNA ribosomal.
Mekanisme rolling circle replication ini merupakan mekanisme replikasi
DNA yang berbentuk sirkuler. Hal yang unik dalam rolling circle replication adalah
bahwa DNA parental yang berbentuk sirkuler tetap utuh dan menggulung selama
replikasi berlangsung dan berputar (roll/spin) sehingga mekanisme ini dinamakan
demikian. DNA parental yang sirkuler ini menjadi template untuk sintesis unting
komplemennya.

Rolling circle replication dimulai ketika enzim endonuklease yang spesifik

terhadap sekuen tertentu memutus satu unting pada titik awal replikasi (origin).
Aktivitas enzim endonuklease ini menghasilkan ujung 3’-OH dan ujung 5’-phospat.
Ujung 5’-phospat kemudian dilepaskan dari lingkaran DNA, dan pada saat yang sama
unting yang dijadikan sebagai template berputar pada sumbunya. Pemanjangan DNA
terjadi pada ujung 3’-OH dari strand yang terputus.

Rolling circle replication dapat menghasilkan progeni (keturunan) DNA

unting tunggal maupun unting ganda. Progeni unting tunggal yang sirkuler dapat
dihasilkan melalui pemutusan spesifik tapak pada titik awal replikasi yang diikuti
dengan pembentukan kembali struktur melingkar. Sedangkan, untuk menghasilkan
molekul progeni yang terdiri dari unting ganda, DNA unting tunggal yang dihasilkan
berperan sebagai template untuk pembentukan unting komplementernya.
Pembentukan unting komplementer terjadi melalui pembentukan fragmen Okazaki
(sintesis diskontinyu) diikuti dengan pemutusan dan pembentukan struktur melingkar.
Proses terjadinya rolling circle replication dapat diilustrasikan pada gambar 1.
 DNA Parental Heliks
Ganda
Titik awal replikasi (origin)

Endonuklease yang spesifik pada sekuen tertentu

memotong salah satu unting DNA pada origin

Ujung 5’-phospat terlepas dan mulai terjadi

pemanjangan pada ujung 3’-OH

Strand template mulai mengalami perputaran, sedangkan ujung 3’-OH terus

mengalami pemanjangan

DNA progeni unting ganda terbentuk melalui sintesis

diskontinyu unting komplementer dengan salah satu
Progeni unting
unting tunggal sebagai templatenya. Proses tersebut
tunggal dibentuk
diikuti oleh pemutusan dan pembentukan struktur sirkuler
melalui pemutusan
dan pembentukan
kembali struktur
melingkar

Gambar 5. Mekanisme Rolling circle replication

(Sumber: Snustad dan Simmons, 2012)
 REVERSE TRANSCRIPTION
Pada semua sel eukariotik hampir ditemukan elemen atau komponen genetik,
yang dapat bertransposisi yang dikenal dengan transposon atau transposable elemen
dan mekanisme perpindahan elemen ini tergantung pada reverse transcriptions yang
mana merupakan perpindahan RNA menjadi DNA, siklus hidup beberapa virus
tergantung pada Reverse transcription. Sel virus itu sendiri terdiri atas untaian RNA
tunggal, ketika virus menginfeksi sel, untaian tunggal itu akan disalin ke dalam DNA
beruntai ganda, sehingga informasi perpindahan genetik ini disebut retroviruses.

Retrovirus dari beberapa penelitian menyelediki penyebab jenis tumor pada

ayam, kucing dan tikus. Pada setiap kasus produksi tumor selalu diakibatkan oleh
RNA virus. Pemahaman ini berkembang sejak tahun 1970 saat david Baltimore,
Howard Temin, dan Satoshi Mizutani menemukan sebuah reverse transcriptase yang
memungkinkan virus itu menyalin RNA menjadi DNA. Penelitian ini tentang
bagaimana proses transkripsi balik atau reverse transcription dimana urutan DNA
berasal dari transkripsi balik, sehingaa dikatakan bahwa reverse transcription
bertanggung jawab untuk mengisi gen dengan berbagai jenis urutan DNA termasuk
retrovirus.

Contoh salah satu retrovirus yang kita kenal pada manusia yaitu penyakit
AIDS yang sisebabkan oleh Human Immunodeficiency Virus (HIV). AIDS merupakan
penyakit yang secara bertahap merusak kekebalan tubuh manusia yang mana pada
tahap perkembangannya seseorang akan kehilangan kemampuan untuk melawan
infeksi pathogen sehingga jika dibiarkan tanpa pengobatan penderita ini akan mati.
AIDS ditularkan dari satu orang ke orang lain melalui cairan tubuh seperti darah atau
air mani yang telah terkontaminasi dengan HIV. Gejala-gejala awal penyakit ini
seperti terserang flu sehingga individu yang terinfeksi HIV akan mengalami nyeri,
demam dan kelelahan, setelah beberapa minggu gejala-gejala ini mereda dan
kesehatan tampaknya pulih, namun gejala-gejala ini dapat berlangsung selama
beberapa tahun, virus terus berkembangbiak dan akan menyebar keseluruh tubuh,
menargetkan sel-sel khusus yang mempunyai peranan menjaga homeostatis tubuh.
 Berikut ini akan dijelaskan mengenai siklus hidup HIV (Gambar 1)

Gambar 6. Siklus hidup virus

a. Tahap 1: HIV berikatan/terkait dengan sel target melalui interaksi antara protein
gp120 yang terdapat pada virus dan protein reseptor seluler CD4 pada sel target.
b. Tahap 2: terjadi fusi yang memungkinkan inti virus masuk ke dalam sel target.
c. Tahap 3: RNA yang terkait dengan protein dilepaskan dari inti virus.
d. Tahap 4: reverse transcriptase mengkatalisis sintesis double strand DNA virus dari
single strand RNA virus dalam sitoplasma.
e. Tahap 5: Integrase mengkatalisis penyisipan DNA virus ke dalam DNA sel target
dalam nukleus.
f. Tahap 6: RNA polimerase seluler mentranskripsi DNA virus menjadi RNA virus.
g. Tahap 7a: Beberapa RNA virus berfungsi sebagai mRNA untuk sintesis protein virus.
h. Tahap 7b: Beberapa RNA virus membentuk genom virus keturunan.
i. Tahap 8: Partikel virus keturunan dirakit di dekat membran sel.
j. Tahap 9: Partikel virus progeni dikeluarkan dari sel dengan membentuk budding.
k. Tahap 10: Partikel virus bebas untuk menginfeksi sel-sel lain.

HIV ini merupakan virus yang sangat mematikan sehingga menjadi fokus dari
banyak peneliti di dunia, salah satu hasil dari penelitian adalah pemahaman secara
rinci bagaimana siklus hidup HIV. HIV memasuki sel inang memalui interaksi dengan
protein receptor CD4 yang terletak di permukaan sel, interaksi ini dimediasi oleh
glikoprotein yang biasa disebut gp120. Protein ini tertanam dalam lipid yang
mengelilingi virus, sesudah gp120 berikatan dengan receptor CD4, akan terjadi fusi
virus dengan sel target. Di dalam sel, membran lipid dan mantel protein yang
mengelilingi partikel virus akan terlepas, dan bahan-bahan dalam inti virus dilepaskan
ke dalam sitoplasma sel. Inti ini berisi dua untai tunggal RNA-virus yang identik dan
sejumlah kecil protein yang memfasilitasi replikasi genom, termasuk dua molekul
reverse transcriptase dari virus, satu terikat untuk setiap untai RNA virus.

Reverse transcriptase HIV dan reverse transcriptase lain juga mengkonversi

single strand RNA menjadi double strand DNA. Double strand DNA yang dihasilkan
kemudian dimasukkan pada posisi acak dalam kromosom dari sel yang terinfeksi,
pada dasarnya untuk mengisi genom sel dengan banyak salinan genom virus. Salinan
ini kemudian disalin oleh RNA polimerase untuk menghasilkan sejumlah besar RNA
virus, yang berfungsi untuk memediasi sintesis protein virus dan juga menyediakan
RNA genomik untuk perakitan partikel virus baru. Partikel ini dikeluarkan dari sel
melalui proses budding melalui membran sel sehingga dapat menginfeksi sel-sel lain
melalui interaksi dengan reseptor CD4 pada permukaan sel target. Dengan cara ini,
materi genetik HIV direplikasi dan disebarkan melalui sel-sel yang rentan.

Genom HIV panjang lebih dari 10 kilobasa, didalamnya ada beberapa gen,
tiga gen disebut dengan gag, pol dan wnv, ditemukan di semua retrovirus lain, gen gag
mengkode protein, gel pol mengkodekan enzim reverse transcriptase dan enzim lain
yang disebut integrase yang mengkatalis penyisipan bentuk DNA genom HIV ke
dalam kromosom, gen env mengkodekan glikoprotein.
Gambar 7. Konversi RNA HIV kedalam DNA Beruntai Ganda

Proses replikasi genom HIV dikatalis oleh reverse transcriptase, dimulai

dengan mensintesis untaian DNA single komplemen ke RNA untai tunggal dari
genom virus, sintesis DNA dimulai dengan menggunakan tRNA sebagai primer yang
menempel pada sekuen primer binding site yang berada di sebelah kiri pusat RNA
HIV (Langkah 1) tRNA ini terbungkus terikat dengan PBS dalam inti HIV, setelah
reverse transcriptase mengkatalis sintesis dari ujung 3 DNA virus ribonuklease H
(RNase H) mendegradasi RNA genomik dalam duplex RNA-DNA (langkah 2).
Degradasi ini membolak-balikkan pengulangan sekuen (R) untai DNA baru bebas
untuk berhibridisasi dengan urutan R pada ujung 3 RNA HIV. Hasil akhirnya adalah
wilayah R dari untai DNA yang baru "melompat" dari 5 ujung RNA HIV ke ujung 3
dari RNA HIV (langkah 3). Reverse transcriptase selanjutnya memperluas salinan
DNA dengan menggunakan 5 wilayah RNA HIV sebagai template (langkah 4).

Pada langkah 5, RNaseH mendegradasi semua RNA dalam duplex RNA-DNA

kecuali daerah kecil yaitu Polypurine Track (PPT), yang sebagian besar terdiri dari
purin adenin dan guanin. Polypurine Track ini digunakan sebagai primer untuk
sintesis untai DNA yang kedua dari genom HIV (langkah 6). Setelah tRNA dan RNA
genom hadir dalam duplex RNA-DNA dihapus (langkah 7), DNA kedua "melompat"
terjadi selama PBS pada ujung 5 untai DNA kedua berhibridisasi dengan PBS
komplemen pada ujung 5 untai DNA pertama (langkah 8). 3 -hydroxyl termini dari
dua untai DNA yang kemudian digunakan sebagai primer sintesis DNA untuk
menyelesaikan sintesis untai ganda DNA HIV (langkah 9). Konversi RNA virus ke
DNA virus menghasilkan urutan tanda di kedua ujung molekul DNA. Urutan ini
disebut long terminal repeats (LTRs), diperlukan untuk integrasi genom virus ke
dalam DNA sel inang.
Gambar 8. Integrasi DNA HIV Beruntai Ganda ke dalam DNA Kromosom Sel Inang

Integrasi dari DNA virus dikatalisis oleh enzim integrase, yang memiliki
aktivitas endonuklease. Enzim integrase akan memotong DNA HIV di dekat ujung 3'
dari setiap untai atau pada kedua ujung LTRs (langkah 1). Ujung ini selanjutnya
digunakan untuk integrase-mengkatalis ikatan fosfodiester dalam sekuens target
dalam DNA sel inang. Proses ini menghasilkan formasi ikatan fosfodiester baru antara
ujung 3 DNA HIV dan 5 fosfat dalam DNA inang (langkah 2). Pada tahap akhir
integrasi, enzim seluler sepenuhnya mengintegrasikan DNA HIV ke dalam DNA
target, dan akan menciptakan situs duplikasi target (langkah 3). Genom HIV yang
terintegrasi kemudian menjadi bagian permanen dari genom sel inang, replikasi sama
seperti segmen lain dari DNA inang

FAG T4 MENYEDIAKAN APPARATUS REPLIKASI SENDIRI

 Ketika fag T4 mengambil alih sel E. coli, ia menyediakan beberapa fungsi
sendiri yang mengganti atau menambah fungsi inang. fag menempatkan sedikit
ketergantungan pada fungsi ekspresi inang. Degradasi DNA inang penting dalam
melepaskan nukleotida yang digunakan kembali dalam sintesis DNA fag. (DNA fag
berbeda dalam komposisi dasar dari DNA sel dalam menggunakan
hydroxymethylcytosine bukan sitosin adat.

Fungsi kode-fag yang bersangkutan dengan sintesis DNA dalam sel yang
terinfeksi dapat diidentifikasi dengan mutasi yang menghambat produksi fag matang.
fungsi fag penting diidentifikasi oleh mutasi yang mematikan bersyarat, yang jatuh ke
dalam tiga kelas fenotipik:

 Mereka di mana tidak ada sintesis DNA sama sekali mengidentifikasi gen yang
produknya baik adalah komponen dari apparatus replikasi atau terlibat dalam
penyediaan prekursor (terutama yang hydroxymethylcytosine).
 Mereka yang timbulnya sintesis DNA tertunda prihatin dengan inisiasi replikasi.
 Mereka yang sintesis DNA dimulai tapi kemudian ditangkap termasuk fungsi
regulasi, ligase DNA, dan beberapa enzim yang bersangkutan dengan degradasi DNA
inang.
 Ada juga gen yang tidak penting berkaitan dengan replikasi, termasuk mereka yang
terlibat dalam glikosilasi hydroxymethylcytosine dalam DNA.
Sintesis dari DNA T4 dikatalisis oleh agregat multienzim dirakit dari produk
dari sekelompok kecil gen penting.

Gen 32 protein (GP32) adalah protein yang mengikat yang sangat kooperatif
untai tunggal, yang dibutuhkan dalam jumlah stoikiometri. Ini adalah contoh pertama
dari jenisnya yang akan ditandai. Geometri dari cabang replikasi T4 dapat secara
khusus memerlukan protein fag-kode, karena E. coli SSB tidak dapat menggantikan.
GP32 yang membentuk kompleks dengan polimerase DNA T4; Interaksi ini bisa
menjadi penting dalam membangun cabang replikasi.

Sistem T4 menggunakan R A priming acara yang mirip dengan inangnya.

Dengan DNA T4 singlestranded sebagai template, produk gen 41 dan 61 bertindak
bersama-sama untuk mensintesis primer singkat. Perilaku mereka adalah analog
dengan DnaB dan DnaG di E. coli. Gen 41 protein adalah mitra untuk DnaB. Ini
adalah helikase hexameric yang menggunakan hidrolisis GTP untuk memberikan
energi untuk bersantai DNA. The P41 / P61 kompleks bergerak processively di 5'-3
'arah dalam sintesis untai tertinggal, secara berkala memulai fragmen Okazaki. protein
lain, produk dari gen 59, beban P41 / P61 kompleks ke DNA; itu diperlukan untuk
menggantikan protein P32 untuk memungkinkan helikase untuk berkumpul di DNA.

Gen 61 protein yang dibutuhkan dalam jumlah yang jauh lebih kecil daripada
kebanyakan protein replikasi T4. Ada sedikitnya sepuluh salinan gp61 per sel. (Ini
menghambat karakterisasinya. Hal ini diperlukan dalam jumlah kecil seperti yang
awalnya itu terjawab sebagai komponen penting, karena cukup hadir sebagai
kontaminan dari persiapan GP32!) Gene 61 protein memiliki aktivitas primase, yang
analog dengan DnaG dari E. coli. Primase mengakui urutan template yang 3'-TTG- 5
'dan mensintesis primer pentaribonucleotide yang memiliki urutan umum
pppApCpNpNpNp. Jika apparatus replikasi lengkap hadir, primer ini diperluas ke
dalam rantai DNA.

Gen 43 DNA polymerase memiliki aktivitas sintetis yang biasa 5'-3 '. yang
berhubungan dengan aktivitas proofreading 3'-5 'exonuclease. Ini mengkatalisis
sintesis DNA dan menghapus primer. Ketika T4 DNA polimerase menggunakan DNA
beruntai tunggal sebagai template, laju kemajuan tidak merata. enzim bergerak cepat
melalui daerah untai tunggal, tetapi hasil jauh lebih lambat melalui daerah yang
memiliki basis dipasangkan intrastrand struktur sekunder. Protein aksesori membantu
polimerase DNA dalam melewati rintangan tersebut dan mempertahankan kecepatan.

Tiga protein lainnya disebut sebagai "protein aksesori polimerase." Mereka

meningkatkan afinitas polimerase DNA untuk DNA. serta meningkatkan processivity
dan kecepatan. Produk gen 45 adalah trimer yang bertindak sebagai penjepit geser.
Struktur trimer yang mirip dengan yang ada pada E. coli dimer. dalam hal ini
membentuk lingkaran di sekitar DNA yang memegang subunit DNA polymerase lebih
erat pada template.

Produk gen 44 dan 62 membentuk kompleks ketat yang memiliki aktivitas

ATPase. Mereka adalah setara dengan kompleks loader y8 penjepit, dan peran mereka
adalah untuk memuat P45 ke DNA. Empat molekul ATP dihidrolisis dalam memuat
penjepit P45 dan P43 DNA polymerase pada DNA. Struktur keseluruhan replisome
adalah mirip dengan E. coli. Ini terdiri dari dua kompleks holoenzyme digabungkan,
salah satu mensintesis terkemuka untai dan lainnya sintesis untai tertinggal. Dalam hal
ini, dimerisasi yang melibatkan interaksi langsung antara subunit polimerase DNA
P43, dan P32 berperan dalam mengkoordinasikan tindakan dari dua unit DNA
polimerase.

Sejauh ini kita telah berurusan dengan replikasi DNA hanya dalam hal
perkembangan replikasi untuk Kebutuhan untuk fungsi lain ditunjukkan oleh DNA-
delay dan DNA-penangkapan mutan. Tiga dari empat gen mutan DNA delay adalah
39, 52, dan 60, yang kode untuk tiga subunit dari T4 topoisomerase II. suatu kegiatan
yang diperlukan untuk menghapus superkoil dalam template (lihat Bagian 19,13,
topoisomerase Relax atau Perkenalkan superkoil dalam DNA). Peran penting dari
enzim ini menunjukkan bahwa T4 DNA tidak tetap dalam bentuk linear, melainkan
menjadi topologi dibatasi selama beberapa tahap replikasi. topoisomerase yang bisa
diperlukan untuk memungkinkan rotasi DNA depan cabang replikasi.

Perbandingan apparatus T4 dengan apparatus E. coli menunjukkan bahwa

replikasi DNA menimbulkan serangkaian masalah yang diselesaikan dengan cara-cara
analog dalam sistem yang berbeda. sekarang kita bisa membandingkan enzimatik dan
kegiatan struktural ditemukan di cabang replikasi di E. coli, T4, dan HeLa (manusia)
sel. GAMBAR 18,26 merangkum fungsi dan memberikan mereka untuk protein
individu. Kita bisa menafsirkan sifat dikenal replikasi protein kompleks dalam hal
fungsi serupa yang melibatkan unwinding, priming, katalitik, dan reaksi penyegelan.
Komponen setiap sistem berinteraksi dengan cara yang terbatas, seperti yang
ditunjukkan oleh fakta bahwa fag T4 membutuhkan sendiri helikase, Primase,
penjepit, dan sebagainya, dan oleh fakta bahwa protein bakteri tidak dapat
menggantikan rekan-rekan fag mereka.
PERTANYAAN DAN JAWABAN
A. Dewi Cahyaningrum
1. Mengapa rolling circle replication hanya dapat terjadi pada replikasi DNA
yang berbentuk sirkuler? Jelaskan mekanismenya?
Jawaban:
Rolling circle replication merupakan mekanisme replikasi DNA yang umum
terjadi pada DNA dengan bentuk sirkuler. Hal ini dapat terjadi karena pada DNA
sirkuler saja lah yang dapat membentuk pemanjangan sembari DNA templatenya
tetap utuh dan memutar. Mekanisme rolling circle replication dapat ditemukan
pada replikasi genom virus, transfer DNA bakteri, dan amplifikasi gen-gen
pengkode RNA ribosomal selama oogenesis amfibi.
Mekanismenya Rolling circle replication, yaitu:
 Dalam replikasi DNA adalah kompleks, memerlukan partisipasi sejumlah
besar protein.
 Sintesis DNA adalah kontinyu pada untai keturunan yang sedang diperpanjang
di keseluruhan arah 5 '→ 3', tetapi terputus pada strand yang berkembang di
keseluruhan arah 3 '→ 5'.
 Rantai DNA baru adalah diprakarsai oleh RNA primer pendek yang disintesis
oleh DNA primase.
 Sintesis DNA dikatalisis oleh enzim yang disebut DNA polimerase.
 Semua DNA polimerase memerlukan untai primer, yang diperpanjang, dan
untai cetakan, yang disalin.
 Semua DNA polimerase memiliki syarat mutlak untuk 3'-OH bebas pada untai
primer, dan semua sintesis DNA terjadi pada arah 5 'ke 3'.
 Kegiatan 3'→ 5' exonuclease DNA polimerase mengoreksi untai baru yang
lahir seperti yang merka sintesis, menghapus setiap nukleotida mispaired di
ujung 3' untai primer.
 Enzim dan protein pengikat DNA yang terlibat dalam replikasi merakit
menjadi replisome pada setiap garpu replikasi dan bertindak dalam “konser”
sebagai garpu yang bergerak sepanjang molekul DNA induk.

2. Di dalam penembentukan rolling circle replication ada enzim yang berperan

dalam peristiwa tersebut. Enzim apakah yang bdrperan dalam peristiwa
tersebut dan jelaskan carakerja enzim tersebut dalam perannya di rolling
circle replication?
Jawaban :
Rolling circle replication dimulai ketika aktivitas spesifik enzim nuklease dari
virus ФX174 itu, protein membelah rantai positif dari rantai induk RF pada daerah
 ori dari replikasi. Aktifitas enzim ini sangat spesifik dengan memotong kromosom
hanya pada satu sisi pada daerah ori. Enzim tersebut membentuk ujung 3’OH dan
5’Fosfat pada sisi yang dipotong itu pada untai positif dan untai negatifnya tetap
utuh. Ujung 5’ dari untai positif tersebut terbuka dan terlepas sementara untai
negatifnya berputar disekitar daerah aksis (sehingga namanya disebut rolling
circle). Jadi enzim aktifasi yang pertama kali bekerja dan memiliki peran penting
dalam proses rolling circle replication adalah enzim nuklease.
B. Frengky Neolaka
1. Jelaskan pengertian reverse transcription, retrovirus, bagaimana
mekanismenya dan berikan salah satu contoh dari retrovirus!
Jawab :
Reverse transcription merupakan perpindahan RNA menjadi DNA pada sel
eukariotik salah satunya adalah virus, siklus hidup beberapa virus tergantung pada
Reverse transcription. Sel virus itu sendiri terdiri atas untaian RNA tunggal,
ketika virus menginfeksi sel, untaian tunggal itu akan disalin ke dalam DNA
beruntai ganda, sehingga informasi perpindahan genetik ini disebut retroviruses.
Salah satu penelitian yang dilakukan oleh Howard Temin, dan Satoshi Mizutani
tentang bagaimana proses transkripsi balik atau reverse transcription dimana
urutan DNA berasal dari transkripsi balik, sehingaa dikatakan bahwa reverse
transcription bertanggung jawab untuk mengisi gen dengan berbagai jenis urutan
DNA termasuk retrovirus.
Salah satu contoh retrovirus yang kita kenal pada manusia yaitu penyakit AIDS
yang sisebabkan oleh Human Immunodeficiency Virus (HIV). HIV memasuki sel
inang memalui interaksi dengan protein receptor CD4 yang terletak di permukaan
sel, interaksi ini dimediasi oleh glikoprotein yang biasa disebut gp120. Protein ini
tertanam dalam lipid yang mengelilingi virus, sesudah gp120 berikatan dengan
receptor CD4, akan terjadi fusi virus dengan sel target. Di dalam sel, membran
lipid dan mantel protein yang mengelilingi partikel virus akan terlepas, dan bahan-
bahan dalam inti virus dilepaskan ke dalam sitoplasma sel dan menyerang
beberapa sel imun sehingga mengakibatkan seseorang kehilangan kekebalan tubuh
dan mengakibatkan kematian.
2. Jelaskan perbedaan prinsip dari model replikasi semikonservatif,
konservatif, dan dispersif? Teknik eksperimen apakah dalam
pengamatannya?
Jawab:
  Replikasi semikonservatif: replikasi yang terdapat pada untai DNA “parent”
yang akan bertindak sebagai template yang akan dihubungkan oleh ikatan
hidrogen agar dapat berpasangan dengan untai DNA yang baru terbentuk.
Replikasi konservatif: replikasi yang terjadi dengan mempertahankan DNA
indukan, sedangkan untai baru dari DNA akan disintesis.
Replikasi dispersif: replikasi yang terjadi pada kedua segmen molekul untai DNA
akan tetap dipertahankan dan digunakan sebagai template untuk mensintesis
segmen yang komplemen yang setelah itu akan bergabung untuk menghasilkan
keturunan untai DNA yang baru.
 Molekul DNA dengan kepadatan yang berbeda dapat dipisahkan oleh equilibrium
density-gradient centrifugation. Dengan menggunakan teknik inilah, ketiga
model replikasi DNA melalui bentuk perubahan kepadatan pada DNA sel bakteri
yang ditumbuhkan pada medium (15N) dan medium (14N).
C. Ari Ashari
1. Pada proses sintesis dari DNA T4 ada beberapa jenis protein yang digunakan
salah satunya adalah “protein aksesori polimerase”. Deskripsikan secara
singkat tentang peran dari protein ini?
Jawab
Peran dari protein aksesori polimerasi adalah untuk meningkatkan afinitas
polimerase DNA untuk DNA. serta meningkatkan processivity dan kecepatan.
Kemudian produk gen 45 adalah trimer yang bertindak sebagai penjepit geser.
Struktur trimer yang mirip dengan yang ada pada E. coli dimer. dalam hal ini
membentuk lingkaran di sekitar DNA yang memegang subunit DNA polymerase
lebih erat pada template.
2. Pada proses replikasi bakteri FAG T4, Gen 43 DNA polymerase yang biasa
memiliki aktivitas sintetis 5'-3 ' yang mana ini berhubungan dengan aktivitas
proofreading 3'-5 'exonuclease. Peran dari Gen tersebut apa?
Jawab:
Peran dari Gen 43 DNA polymerase ini adalah mengkatalisis sintesis DNA dan
menghapus primer. Ketika DNA T4 polimerase menggunakan DNA beruntai
tunggal sebagai template, laju kemajuan tidak merata. enzim bergerak cepat
melalui daerah untai tunggal, tetapi hasil jauh lebih lambat melalui daerah yang
memiliki basis dipasangkan intrastrand struktur sekunder. Protein aksesori
membantu polimerase DNA dalam melewati rintangan tersebut dan
mempertahankan kecepatan
 DAFTAR RUJUKAN

Snustad, D. P. dan Simmons, M. J. 2012. Principles of Genetics Sixth Edition. New York:
John Wiley & Sons, Inc.

Densmore, L. 2007. Modes of Replication 2. (Online),

(http://www.faculty.biol.ttu.edu/densmore/MolBio/Mol%20Bio%2007/Molecular
%20lect%2011.07.pdf), diakses 17 February 2016.