KROMATOGRAFI

LAPIS TIPIS

Teti Estiasih - Magister S2 THP FTP 1

UB
• Cara pemisahan dengan adsorbsi pada
lapisan tipis adsorben
• Merupakan kromatografi adsorpsi dan
partisi
• Fase stasioner: adsorben
• Fase mobil: pelarut
• Biasanya untuk analisis kualitatif

Teti Estiasih - Magister S2 THP FTP 2

UB
 KELEBIHAN
Dibandingkan kromatografi kertas:
• Pemisahan lebih sempurna
• Kepekaan lebih tinggi
• Waktu lebih singkat

Teti Estiasih - Magister S2 THP FTP 3

UB
 JENIS TLC
• TLC mikro: untuk mengecek kesempurnaan
pemisahan, bersifat kualitatif, ukuran kecil
• TLC makro: ukuran plat besar
• TLC preparatif: menyiapkan sampel dari
komponen yang terpisah untuk dianalisis
lebih lanjut
• TLC kuantitatif: untuk menentukan
kuantitas suatu zat

Teti Estiasih - Magister S2 THP FTP 4

UB
TEKNIK PEMISAHAN
DENGAN TLC

Teti Estiasih - Magister S2 THP FTP 5

UB
 1. JENIS ADSORBEN
Yang umum dipakai:
1. Silika gel (asam silikat)
2. Alumina (aluminium oksida)
3. Kieselguhr (diatomeous earth)

Teti Estiasih - Magister S2 THP FTP 6

UB
 Silika Gel
• Yang paling banyak dipakai:
a. Silika Gel G: mengandung perekat asam sulfat
13%
b. Silka Gel H: tidak mengandung perekat. Dipakai
untuk pemisahan yang bersifat spesifik terutama
lipid netral
c. Silika Gel PF: dapat berfluoresensi. Visualisasi
dapat dilakukan dengan meletakkan plat pada
ruang gelap
Teti Estiasih - Magister S2 THP FTP 7
UB
 Alumina
• Tidak mengandung zat perekat
• Bersifat netral
• Dapat digunakan dengan atau tanpa aktivasi
• Dapat memisahkan berbagai senyawa
seperti terpena, alkaloid, steroid, senyawa
alisiklik, alifatik, serta aromatik

Teti Estiasih - Magister S2 THP FTP 8

UB
 Kieselguhr
• Lebih lemah dari silika dan alumina
• Cocok untuk memisahkan senyawa-
senyawa polar

Teti Estiasih - Magister S2 THP FTP 9

UB
 Sifat-sifat dasar beberapa
adsorben
Adsorben Keasaman Aktivitas Senyawa yang dapat
dipisahkan
Silika Gel Asam Aktif Semua senyawa
Alumina Basa Aktif Steroid, senyawa bersifat
basis
Magnesium - Lemah Karotenoid dan tokoferol
trisilikat
Kalsium - Lemah Asam lemak, gliserida
sulfat
Kieselguhr Netral Inaktif Gula, farmasetika
Teti Estiasih - Magister S2 THP FTP 10
UB
 2. PEMBENTUKAN LAPISAN
ADSORBEN

• Pelapisan lapisan tipis adsorben pada

permukaan kaca atau aluminium foil
• Ukuran bervariasi: 5X20 cm, 10X20 cm,
atau 20X20 cm
• Ketebalan lapisan bervariasi tergantung
penggunaan, misal 0,25; 0,5; atau 2 mm

Teti Estiasih - Magister S2 THP FTP 11

UB
PLAT TLC (20X20 cm)

Teti Estiasih - Magister S2 THP FTP 12

UB
Plat TLC 5X20 cm

Teti Estiasih - Magister S2 THP FTP 13

UB
 Plat TLC
• Dapat dibuat sendiri atau dibeli
• Plat TLC komersial lebih seragam sehingga
daya ulang (reproducibility) lebih baik
• Jika dibuat sendiri, larutan adsorben harus
disiapkan

Teti Estiasih - Magister S2 THP FTP 14

UB
 TLC Mikro
• Adsorben silika gel G 35 g dilarutkan dalam
100 ml pelarut kloroform:metanol (2:1 v/v)
• Plat kaca yang sudah bersih dicelupkan
pada larutan tersebut
• Kemudian pelarut diuapkan pada suhu
ruang selama 5 menit

Teti Estiasih - Magister S2 THP FTP 15

UB
 TLC Makro
• Suspensi adsorben dibuat dengan mencampur
adsorben tertentu dengan air
• Konsentrasi adsorben tergantung pada jenis
adsorben
• Sebelum plat digunakan harus dilakukan aktivasi
pada suhu 110C selama minimum 1 jam
• Aktivasi silakukan setelah plat didiamkan sekitar
30 menit pada suhu ruang

Teti Estiasih - Magister S2 THP FTP 16

UB
 Air yang dibutuhkan untuk membuat
suspensi adsorben
Jenis Adsorben Adosrben/air (g/ml)
Silika Gel G 30/60-65
Silka Gel H 30/60-79
Silka Gel P 30/70
Alumina G 30/40
Alumina H 30/80-90
Alumina P 30/30
Selulosa P 1/6
Selulosa MX 1/4.5
Kiselguhr 30/60-65
Teti Estiasih - Magister S2 THP FTP 17
UB
TLC Applicator/Coater

Teti Estiasih - Magister S2 THP FTP 18

UB
 3. PENETESAN SAMPEL ATAU
SPOTTING
• Sampel yang akan dipisahkan dilarutkan dalam pelarut yang
mudah menguap seperti kloroform
• Campuran sampel yang telah dipreparasi diteteskan pada plat
TLC yang telah dilapisi adsorben
• Jarak penetesan kira-kira 1,5-2 cm dari sisi bawah plat makro,
dan 8-10 mm untuk plat mikro
• Jumlah yang diteteskan bervariasi tergantung tujuan analisa.
TLC preparatif lebih banyak dibandingkan TLC kuantitatif atau
kualitatif
• Jumlah untuk kuantitatif/analitik berkisar 1-20 l atau berat
sampel 5-100 g dari larutan 0,1%, untuk TLC preparatif 50-250
mg
Teti Estiasih - Magister S2 THP FTP 19
UB
 Spotting

Teti Estiasih - Magister S2 THP FTP 20

UB
 4. PENGEMBANGAN
• Pengembangan dilakukan dengan memasukkan plat
TLC yang telah ditetesi sampel pada wadah
pengembangan
• Wadah pengembangan berisi pelarut (biasanya
campuran dengan perbandingan tertentu)
• Sebelum pengembangan, wadah harus jenuh dnegan
pelarut
• Spot harus berada di atas pelarut
• Lama pengembangan tergantung dari jenis sampel
tetapi biasanya dihentikan ketika pelarut telah mencapai
¾ tinggi adsorbenTetiatau 15-16 cm untuk plat makro 21
Estiasih - Magister S2 THP FTP
UB
PENGEMBANGAN

Teti Estiasih - Magister S2 THP FTP 22

UB
 METODE PENGEMBANGAN

• Pengembangan satu dimensi: satu arah

dengan satu macam sistem pelarut
• Pengembangan dua dimensi: dua arah. Satu
dimensi, dikeringkan, Plat diputar 90C
kemudian dikembangkan kembali.
• Pengembangan ganda: pengembangan satu
arah dengan beberapa tahap yang
menggunakan sistem pelarut yang berbeda

Teti Estiasih - Magister S2 THP FTP 23

UB
Pengembangan satu dimensi

Teti Estiasih - Magister S2 THP FTP 24

UB
Figure. Schematic TLC separation of
simple lipids on a silica gel G layer.
Hexane-diethyl ether-formic acid
(80:20:2 by volume) was the developing
solvent.

Teti Estiasih - Magister S2 THP FTP 25

UB
Pengembangan dua dimensi

Teti Estiasih - Magister S2 THP FTP 26

UB
Figure. Schematic representation of two-dimensional TLC
separation of complex lipids from A. thaliana. Abbreviations,
MGDG, monogalactosyldiacylglycerols; DGDG,
digalactosyldiacylglycerol; SQDG,
sulfoquinovosyldiacylglycerol; DPG, diphosphatidylglycerol;
PG, phosphatidylglycerol; PE, phosphatidylethanolamine; PI,
phosphatidylinositol; PS, phosphatidylserine; and PC,
phosphatidylcholine.

Teti Estiasih - Magister S2 THP FTP 27

UB
Pengembangan Ganda

Teti Estiasih - Magister S2 THP FTP 28

UB
Figure. Schematic separation of simple lipids and
phospholipids of plasma by high-performance TLC (1); two
developments as far as "X" with chloroform-methanol-water
(60:30:5 by volume), and a third development to "Y" with
hexane-diethyl ether-acetic acid (80:20:1.5 by volume).
Abbreviations: CE, cholesterol esters; TG, triacylglycerols;
FFA, free fatty acids; C, cholesterol; PE,
phosphatidylethanolamine; PC, phosphatidylcholine; SPH,
sphingomyelin; LPC, lysophosphatidylcholine.

Teti Estiasih - Magister S2 THP FTP 29

UB
 5. VISUALISASI
• Bertujuan untuk melihat spot sampel yang telah
terpisah
• Cara:
• menyemprotkan senyawa tertentu seperti iodin
• dilakukan penyemprotan dengan asam kuat
dilanjutkan pemanasan suhu tinggi
• Penyinaran dengan sinar uv
• Visualisasi: destruktif dan non destruktif
• Non destruktif: untuk TLC preparatif
Teti Estiasih - Magister S2 THP FTP 30
UB
VISUALISASI DENGAN IODIN

Teti Estiasih - Magister S2 THP FTP 31

UB
VISUALISASI DENGAN
CHARING

Teti Estiasih - Magister S2 THP FTP 32

UB
Visualisai dengan UV

Teti Estiasih - Magister S2 THP FTP 33

UB
Reagensia Umum untuk Visualisasi

• H2SO4 pekat
• H2SO4-Na2Cr2O7 Dengan pemanasan,
senyawa organik terlihat
• H2SO4-K2Cr2O7
sebagai bercak
• H2SO4-HNO3 berwarma hitam
• HClO4
• Iodium: bercak berwarna coklat, tanpa
pemanasan
Teti Estiasih - Magister S2 THP FTP 34
UB
 Reagensia Khusus untuk Visualisasi
Jenis Senyawa yang Jenis Senyawa yang
Divisualisasi Divisualisasi
Anilin ptalat Gula reduksi 2,4 DNPH Aldehid atau keton
berbagai macam berwarna kuning sampai
warna merah
Anisaldehida dalam Karbohidrat Reagensia Alkaloid dan basa organik
H2SO4 atau asam berwarna biru Dragendorf berwarna oranye
asetat
Antimon triklorida Steroid, steroid Ferriklorida Fenol menunjukkan
dalam CHCl3 glikosida, lipid berbagai macam warna
alifatik dan
vitamin A
Bromokersol jambon Halogen berwana Fluorescein-Br2 Untuk senyawa-senyawa
kuning atau jingga organik tidak jenuh
Bromokresol hijau Asam karboksilat Ninhidrin Asam amino akan
berwarna hijau
Teti Estiasih - Magister S2 THP FTP
berwarna biru 35
atau kuning UB
 6. IDENTIFIKASI
• Membandingkan dengan standar
berdasarkan Rf atau posisi spot

7. KUANTIFIKASI
• Dengan mengukur kepekatan warna spot
• Alat yang digunakan TLC Scanner/
densitometer
Teti Estiasih - Magister S2 THP FTP 36
UB
Perhitungan Rf

Teti Estiasih - Magister S2 THP FTP 37

UB
Densitogram dari TLC Scanner

Teti Estiasih - Magister S2 THP FTP 38

UB
LATIHAN SOAL

Teti Estiasih - Magister S2 THP FTP 39

UB
1. Fosfolipida (PL) terdiri dari fosfatidilkolin (PC),
fosfatiodiletanolamin (PE), dan fosfatidilinositol
(PI). Analisis dilakukan dengan TLC dengan
adsorben silika yang bersifat polar. Pelarut yang
digunakan sebagai pengembang adalah
kloroform:metanol:air 75:25:5 yang bersifat non
polar. Urutan polaritas PL dari yang paling non
polar adalah PE:PC:PI.

a. Urutkan posisi spot masing-masing jenis PL dari

yang bergerak paling jauh setelah pengembangan.
b. Jelaskan alasannya.

Teti Estiasih - Magister S2 THP FTP 40

UB
1. Fosfolipida (PL) terdiri dari fosfatidilkolin (PC),
fosfatiodiletanolamin (PE), dan fosfatidilinositol
(PI). Analisis dilakukan dengan TLC dengan
adsorben silika yang bersifat polar. Pelarut yang
digunakan sebagai pengembang adalah
kloroform:metanol:air 75:25:5 yang bersifat non
polar. Urutan polaritas PL dari yang paling non
polar adalah PE:PC:PI.

a. Urutkan posisi spot masing-masing jenis PL dari

yang bergerak paling jauh setelah pengembangan.
b. Jelaskan alasannya.

Teti Estiasih - Magister S2 THP FTP 41

UB
2. Analisis monogliserida, digliserida dan
trigliserida dalam minyak biji jarak
dilakukan dengan TLC dengan adsorben
silika dan pengembang kloroform:metanol:
air 70:25:5.

a. Urutkan letak spot dari pergerakannya paling

lambat setelah pengembangan
b. Jelaskan alasannya

Teti Estiasih - Magister S2 THP FTP 42

UB
3. Pada penelitian reaksi gliserolisis enzimatis antara
asam lemak -3 dengan gliserol, analisis profil
gliserida dilakukan dengan plat TLC silika gel G60
sebagai berikut:
• Sampel dilarutkan dalam kloroform pada konsentrasi
1 mg/ml.
• Sebanyak 20 l sampel diteteskanpada plat TLC
kemudian dilakukan pengembangan dengan pelarut
Petroleum eter/dietil eter/asam asetat 80:20:0,5 (v/v).
• Identifikasi dilakukan dengan membandingkan Rf
yang sesuai dengan standar eksternal
• Kuantifikasi dilakukan dengan mengukur absorbansi
masing-masing spot dengan menggunakan TLC
scanner Teti Estiasih - Magister S2 THP FTP 43
UB
• Standar eksternal disiapkan sebagai berikut:
standar gliserol, monogliserida, digliserida,
dan trigliserida dilarutkan dalam etanol,
aseton, kloroform, heksana secara berurutan
dengan konsentrasi masing-masing 1
mg/ml.
• Spotting masing-masing standar eksternal
dilakukan sebanyak 20 l.
• Pengembangan dilakukan seperti sampel
dan kuantifikasi dilakukan menggunakan
TLC scanner dengan mengukur luas area
Teti Estiasih - Magister S2 THP FTP 44
UB
 • Jika standar eksternal mempunyai Rf dan
absorbansi sebagai berikut

Standar Eksternal Rf Luas Area

Gliserol 0.24 121000

Monogliserida 0.45 104000
Digliseria 0.68 98000
Trigliserida 0.85 108000

Teti Estiasih - Magister S2 THP FTP 45

UB
• Berapa kadar masing-masing komponen (%) dalam produk
hasil gliserolis jika hasil analisis terhadap sampel dengan
TLC dan TLC scanner adalah sebagai berikut

Rf Luas Area
0.26 14000
0.47 68000
0.69 23000
0.84 11000

Teti Estiasih - Magister S2 THP FTP 46

UB
4. Profil fosfatidilkolin hasil reaksi asidolisis
enzimatis antara asam lemak -3 dengan
fosfatidilkolin kuning telur dianalisis
dengan TLC menggunakan adsorben silika
gel G60 sebagai berikut:
• Sampel dengan konsentrasi 2 mg/ml
dispotkan sebanyak 10 l pada plat TLC.
• Solven yang digunakan pada proses
pengembangan adalah
kloroform:metanol:air 65:35:5 (v/v)

Teti Estiasih - Magister S2 THP FTP 47

UB
• Standar yang digunakan adalah fosfogliserida,
lisofasfatidilkolin, dan fofatidilkolin dengan konsentrasi
standar, volume spotting, dan luas area yang
dikuantifikasi dengan TLC scanner sebagai berikut:

Standar Konsentrasi Volume Rf Luas Area

Eksternal (mg/ml) Injeksi (l)
PG 2,5 10 0.28 24000
LPC 1,0 20 0.66 21000
PC 2,0 10 0.90 19800

Teti Estiasih - Magister S2 THP FTP 48

UB
• Berapa konsentrasi (%) masing-masing komponen
dalam fosfatidilkolin terstruktur yang dihasilkan jika
hasil analisis sebagai berikut:

Rf Luas Area
0.28 1200
0.66 2800

0.90 12000

Teti Estiasih - Magister S2 THP FTP 49

UB