Caesalpinia Ferrea

USULAN PENELITIAN
PENAPISAN FITOKIMIA DAN UJI PENGHAMBATAN ENZIM

ARGINASE PADA EKSTRAK KULIT BATANG
Caesalpinia ferrea C. Mart
DEVI INDRIANI
1306377423
UNIVERSITAS INDONESIA
FAKULTAS FARMASI
PROGRAM STUDI SARJANA FARMASI
DEPOK
OKTOBER 2016
USULAN PENELITIAN
PENAPISAN FITOKIMIA DAN UJI PENGHAMBATAN ENZIM

ARGINASE PADA EKSTRAK KULIT BATANG
Caesalpinia ferrea C. Mart
Diajukan sebagai salah satu syarat untuk mengikuti seminar proposal
DEVI INDRIANI
1306377423
UNIVERSITAS INDONESIA
FAKULTAS FARMASI
PROGRAM STUDI SARJANA FARMASI
DEPOK
OKTOBER 2016
i
HALAMAN PENGESAHAN
Usulan ini diajukan oleh
Nama : Devi Indriani
NPM : 1306377423
Program Studi : Sarjana Farmasi
Judul Usulan Penelitian : Penapisan Fitokimia dan Uji Penghambatan Enzim Arginase
pada Ekstrak Kulit Batang Caesalpinia ferrea C. Mart
Pembimbing I : Prof. Dr. Dra. Berna Elya, Apt., M.Si ( )
Pembimbing II : Arikadia Noviani, M. Farm., Apt ( )
ii
DAFTAR ISI
Halaman Judul ........................................................................................................................ i

Halaman Pengesahan .............................................................................................................. ii
Daftar Isi ................................................................................................................................. iii
Daftar Gambar ........................................................................................................................ v
Daftar Tabel ............................................................................................................................ vi
BAB 1 PENDAHULUAN ..................................................................................................... 1

1.1 Latar Belakang ............................................................................................................ 1
1.2 Rumusan Masalah ....................................................................................................... 2
1.3 Jenis Penelitian dan Metode yang digunakan ............................................................. 2
1.4 Tujuan Penelitian ........................................................................................................ 3
1.5 Hipotesis Penelitian .................................................................................................... 3
BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA ........................................................................................... 4

2.1 Caesalpinia ferrea ...................................................................................................... 4
2.2.1 Klasifikasi Caesalpinia ferrea C. Mart .............................................................. 4
2.2.2 Deskripsi Tanaman ............................................................................................ 4
2.2.3 Kandungan Kimia .............................................................................................. 5
2.2.4 Aktivitas Biologis Caesalpinia ferrea ............................................................... 10
2.2 Ekstraksi ...................................................................................................................... 15
2.3.1 Definisi Ekstraksi ............................................................................................... 15
2.3.2 Metode Ekstraksi ............................................................................................... 15
2.3 Penapisan Fitokimia dan Identifikasi Senyawa........................................................... 17
2.4.1 Definisi Penapisan Fitokimia ............................................................................. 17
2.4.2 Identifikasi Senyawa .......................................................................................... 17
2.4 Enzim .......................................................................................................................... 19
2.4.1 Definisi Enzim ................................................................................................... 19
2.4.2 Klasifikasi Enzim ............................................................................................... 19
2.4.3 Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Laju Enzim................................................ 20
2.4.4 Kinetika Enzim................................................................................................... 21
2.4.5 Tipe Penghambatan Enzim ................................................................................ 23
2.5 Enzim Arginase ........................................................................................................... 25
2.5.1 Arginase ............................................................................................................. 25
2.5.2 Metabolisme L-Arginin oleh Sel Vaskular ........................................................ 26
2.5.3 Kaitan Enzim Arginase dan Aterosklerosis ....................................................... 28
2.5.4 Inhibitor Enzim Arginase .................................................................................. 29
2.6 Spektrofotometri Uv-Vis ............................................................................................. 30
iii
BAB 3 METODE PENELITIAN......................................................................................... 32
3.1 Lokasi dan Waktu Penelitian ...................................................................................... 32
3.2 Alat .............................................................................................................................. 32
3.3 Bahan .......................................................................................................................... 32
3.3.1 Bahan Uji ........................................................................................................... 32
3.3.2 Bahan Baku Pembanding ................................................................................... 32
3.3.3 Bahan Kimia ...................................................................................................... 32
3.4 Cara Kerja ................................................................................................................... 33
3.4.1 Penyiapan Simplisia ........................................................................................... 33
3.4.2 Ekstraksi ............................................................................................................. 33
3.4.3 Penapisan Fitokimia (Identifikasi Senyawa) ..................................................... 33
3.4.3.1 Alkaloid.................................................................................................. 33
3.4.3.2 Tanin ...................................................................................................... 34
3.4.3.3 Saponin .................................................................................................. 34
3.4.3.4 Flavonoid ............................................................................................... 34
3.4.3.5 Terpenoid ............................................................................................... 35
3.4.3.6 Antrakuinon ........................................................................................... 35
3.4.3.7 Glikosida ................................................................................................ 35
3.4.4 Uji Penghambatan Enzim Arginase secara In Vitro .......................................... 36
3.4.4.1 Penyiapan Bahan Kimia ......................................................................... 36
3.4.4.2 Uji Pendahuluan Optimasi Konsentrasi Substrat dan Enzim ................. 38
3.4.4.3 Uji Aktivitas Penghambatan Enzim Arginase secara In Vitro oleh
Kontrol Positif........................................................................................ 39
Sampel Uji ............................................................................................. 40
3.4.4.5 Perhitungan Persentase Penghambatan (% Inhibisi) dan Inhibition
Concentration (IC50) .............................................................................. 42
3.4.4.6 Penentuan Kinetika Penghambatan Enzim Arginase ............................. 42
BAB 4 RENCANA PENELITIAN .......................................................................... 43

DAFTAR ACUAN .................................................................................................... 44
iv
DAFTAR GAMBAR
Gambar 2.1 (1. Batang; 2. Pohon; 3. Cabang; 4. Ranting; 5. Buah; 6. Biji)

Caesalpinia ferrea .............................................................................................. 5
Gambar 2.2 Pengaruh konsentrasi substrat pada kecepatan reaksi enzim .............................. 21
Gambar 2.3 Plot Lineweaver- Burk ........................................................................................ 23
Gambar 2.4 Plot Lineweaver- Burk untuk inhibitor kompetitif .............................................. 24
Gambar 2.5 Plot Lineweaver- Burk untuk inhibitor nonkompetitif ........................................ 24
Gambar 2.6 Plot Lineweaver- Burk untuk inhibitor unkompetitif .......................................... 25
Gambar 2.7 Regulasi metabolisme L-arginine oleh sel vaskular ........................................... 27
Gambar 2.8 Regulasi metabolisme L-arginine oleh sel vaskular ........................................... 28
v
DAFTAR TABEL
Tabel 2.1 Senyawa-senyawa yang tedapat pada Caesalpinia ferrea ...................................... 7

Tabel 2.2 Studi intervensi inhibitor enzim arginase dalam studi eksperimental dan
klinis....................................................................................................................... 30
Tabel 3.1 Prosedur uji aktivitas penghambatan enzim arginase ............................................. 41
Tabel 4.1 Tabel Rencana Penelitian........................................................................................ 43
vi
BAB 1
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang

Penyakit kardiovaskular salah satunya aterosklerosis merupakan masalah
kesehatan yang pada saat ini banyak terjadi terutama di negara-negara maju dan
negara-negara yang sedang menuju ke arah negara industri (Pratanu S, 1995). Pada
tahun 2020 aterosklerosis diramalkan menjadi penyebab utama morbiditas dan
mortalitas di masyarakat yang sedang berkembang dikarenakan adanya perubahan
pola hidup yang tidah sehat (Libby P, 2005). Faktor risiko aterosklerosis dibedakan
menjadi faktor mayor dan faktor minor. Faktor mayor diantaranya umur, jenis
kelamin, keturunan (ras), merokok, kurangnya aktivitas fisik dan penyakit-penyakit
penyebabnya seperti tinggi kolesterol dalam darah, hipertensi, diabetes mellitus,
dan obesitas. Sedangkan yang termasuk faktor minor adalah stress, alkohol, diet
dan nutrisi (AHA, 2011).
Studi klinis dan eksperimental pada enzim arginase menunjukkan adanya
pengaruh perubahan struktur pada pembuluh darah setelah cedera arteri dan paru,
hipertensi, dan aterosklerosis. Secara signifikan, farmakologi penghambatan
terhadap enzim arginase dapat memperbaiki struktur pembuluh darah dan fungsi
semua patologis pada pembuluh darah. Dampak negatif dari arginase yaitu
penurunan proliferasi sel endotel dan sintesis kolagen dari sintesis poliamina dan l-
prolin. Selain itu juga mengakibatkan terjadinya inflamasi akibat penurunan
produksi nitrit oksida (NO) karena persaingan arginase merubah substrat l-arginine
menjadi ornitine dan urea. Pendekatan farmakologis menargetkan penghambatan
isoform spesifik arginase merupakan strategi yang menjanjikan dalam mengobati
penyakit pembuluh darah fibroproliferative obstruktif (Durante, 2013).
Caesalpinia ferrea C. Mart atau yang dikenal sebagai Pau-ferro atau Juca
merupakan tanaman yang tumbuh subur di Brazil. Beberapa aktivitas farmakologi
yang telah diketahui dari ekstrak Caesalpinia ferrea diantaranya antiulcer (Bachi et
al, 1995), anti-inflamasi (Carvalho et al, 1996), antimikroba (Sampaio et al, 2009),
kanker kemopreventif (Nakamura et al, 2002), antiaritmia, dan vasoleraksan (Igor
et al, 2007). Di Brazil, teh dari kulit batang C.Ferrea telah umum digunakan untuk
1
2
pengobatan diabetes mellitus. Sifat hipoglikemik ekstrak air dari kulit batang C.
Ferrea telah diteliti dengan mekanisme mengurangi kadar glukosa darah
(Vasconcelos et.al, 2011). Skrining fitokimia dari ekstrak alkohol kulit batang dan
daun menunjukkan adanya flavonoid, saponin, tanin, kumarin, steroid dan senyawa
fenolik (Igor et al, 2007).
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan mengenai aktivitas
penghambatan enzim arginase pada ekstrak n-heksan, etil asetat dan metanol
Caesalpinia sappan Lignum menggunakan standar nor-NOHA, menunjukkan
persentase inhibisi berturut-turut sebesar 5,53% ; 46,95% dan 40,46%. Hasil dari
ekstrak teraktif pada ekstrak etil asetat dan metanol dilakukan perhitungan IC50
dengan nilai berturut-turut sebesar 98,7 µg/ mL dan 132,02 µg/ mL pada
konsentrasi uji yang berbeda-beda (Noviani, 2015).
Mengingat bahwa studi farmakologi tanaman Caesalpinia ferrea memiliki
aktivitas pada sistem kardiovaskular dan telah dilakukannya penelitian terhadap
ekstrak Caesalpinia sappan Lignum yang memiliki aktivitas penghambatan enzim
arginase, penulis akan melakukan penelitian uji penghambatan enzim arginase dari
spesies lain yaitu Caesalpinia ferrea serta melakukan skrining fitokimia.
1.2 Rumusan Masalah

a. Apakah ekstrak n-heksan, etil asetat, dan metanol kulit batang Caesalpinia
ferrea C. Mart memiliki efek penghambatan terhadap enzim arginase ?
b. Berapa nilai IC50 pada ekstrak kulit batang Caesalpinia ferrea C. Mart
terhadap enzim arginase ?
1.3 Jenis Penelitian dan Metode yang digunakan

Jenis penelitian yang dilakukan adalah penelitian eksperimental. Metode
yang digunakan dalam penelitian ini adalah uji penghambatan enzim arginase
dengan cara membandingkan nilai inhibisi (IC50) antara sampel ekstrak kulit batang
Caesalpinia ferrea dan kontrol positif nor-NOHA dengan metode kalorimetri
menggunakan prinsip spektrofotometri Uv-Vis pada microplate reader.
Universitas Indonesia
3
1.4 Tujuan Penelitian

a. Memperoleh data efek penghambatan enzim arginase pada ekstrak n-heksan,
etil asetat, dan metanol kulit batang Caesalpinia ferrea C. Mart.
b. Memperoleh nilai IC50 tertinggi pada ekstrak kulit batang Caesalpinia ferrea
C. Mart terhadap enzim arginase.
1.5 Hipotesis Penelitian

Ekstrak kulit batang Caesalpinia ferrea C. Mart dapat menghambat enzim
arginase.
BAB 2
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Caesalpinia ferrea

2.1.1 Klasifikasi Caesalpinia ferrea C. Mart
Caesalpinia ferrea C. Mart memiliki klasifikasi tanaman sebagai berikut
(Integrated Taxonomic Information System, 2011) :
Kerajaan : Plantae
Divisi : Tracheophyta
Kelas : Magnoliopsida
Bangsa : Fabales
Suku : Fabaceae
Marga : Caesalpinia
Jenis : Caesalpinia ferrea
2.1.2 Deskrisi Tanaman

Dalam Journal of Medical Plant Research, Libidibia Ferrea (Mart. Ex Tul.)
L. P. Queiroz var. Ferrea memiliki family fabaceae disebut juga dengan
Caesalpinia Ferrea, dikenal sebagai Juca atau pau ferro (Lorenzi, 2002; Matos,
2007). Sehubungan dengan etimologi, Caesalpinia berasal dari kata Caesalpinio
(seorang ahli botani Italia); dan Ferrea, yang berarti besi, disebabkan stuktur
kayunya yang padat (Embrapa, 2014). Spesies ini dianggap sebagai tanaman asli
dari Brasil dan endemik utara dan daerah Northeastern (Alagoas, Bahia, Ceara,
Paraiba dan Pernambuco), terutama di wilayah geografis didominasi oleh Caatinga
(savana Brasil). Selain itu, spesies tersebut dibudidayakan untuk penghijauan jalan
dan taman dan juga sering dikenal kayu ulin Brasil (Matos, 2007).
C. ferrea merupakan tanaman yang memiliki ketinggian antara 10 sampai
15 m di atas permukaan tanah dan memiliki batang yang kecil dengan diameter 40
sampai 60 cm. Daun merupakan jenis komposit bipinnate dengan panjang 15
sampai 19 cm, dengan arah berlawanan 5 sampai 11 serta memiliki selebaran 8
4
5
sampai 24 pinnas. Buah tidak merekah atau pecah dan memiliki pod keras dan
berwarna coklat tua (Lorenzi, 2002).
[Sumber : Journal of Medicinal Plant Research Volume 9 Number 5, 2015]

Gambar 2.1 (1. Batang; 2. Pohon; 3. Cabang; 4. Ranting; 5. Buah; 6. Biji)
Caesalpinia ferrea
2.1.3 Kandungan Kimia

Dalam Journal of Medical Plant Research, kandungan kimia pada
Caesalpinia ferrea terdiri atas asam lemak dan terpenoid, senyawa fenolik, dan
polisakarida. Dalam penelitian yang telah dilakukan, C. ferrea memiliki kandungan
asam lemak yang terdapat pada buahnya setelah diekstraksi menggunakan
Supercritical Fluid Extraction (SFE) menggunakan gas CO2. Analisis dengan
kromatografi gas memberikan hasil adanya senyawa asam lemak tak jenuh dan
terpenoid, asam linoleat, asam palmitat, asam elaidat, gamma-sitosterol, asam
6
stearat dan lupenone. Selain itu juga diidentifikasi adanya senyawa 3,4-
dimethylbenzadehyde dan di-2-ethylhexylphthalate (Dias et al, 2013). Asam lemak
yang terdapat pada C. ferrea diantaranya asam linoleat, palmitat, oleat, stearat,
palmitoleat, dan asam kaprat (Sawada et al, 2014).
Kandungan lain yang terdapat pada C. ferrea yaitu senyawa fenolik. Studi
fitokimia dengan kromatografi lapis tipis (TLC) mengungkapkan adanya coumarin,
flavonoid, saponin, steroid dan tanin (Gonzalez et al, 2004;Vasconcelos et al, 2011;
Araujo et al, 2014). Studi lain menyatakan adanya senyawa asam ellagic dan 2-
(2,3,6-trihidroksi-4-carboxyphenyl) asam ellagic dari hasil isolasi yang dilakukan
pada buahnya (Ueda et al, 2002). Hasil isolasi dari buah C. ferrea juga mengandung
asam galat dan metil galat (Nakamura et al, 2002). Juga dalam buahnya, kandungan
fenolik dari ekstrak hydroalcoholic diperoleh 460 mg/g asam galat (Silva et al,
2011).
Dalam ekstrak metanol, dengan metode prussian blue diperkirakan terdapat
7,3% polifenol (Sampaio et al, 2009). Selain itu, analisis menggunakan
kromatografi cair (HPLC) mengungkapkan adanya asam galat, katekin, epikatekin
dan asam ellagic (Vasconcelos et al, 2011; Araujo et al, 2014). Adanya asam galat
dan kuersetin dalam ekstrak metanol daun C. ferrea juga telah dilaporkan (Port's et
al, 2013). Dalam ekstrak daun, kandungan polifenol dihitung dengan Folin-
Ciocalteu dan adanya asam galat diidentifikasi dan diukur dengan HPLC (Silva et
al, 2014). Kalkon juga merupakan zat yang terdapat dalam spesies ini, literatur
melaporkan keberadaan senyawa ini diisolasi dari batang C. ferrea, juga adanya
pauferrol A (Nozaki et al, 2007), pauferrol B dan C (Ohira et al, 2013).
Ekstrak hidrokoloid diisolasi dari biji yang mengandung 75% total
karbohidrat dan 9% protein. 1D/2D NMR menunjukkan adanya galactomannan
dengan (1 → 4) -linked-β-D-mannopyranose. Pemisahan peak 13C pada unit 4-O-
Mannopyranose menunjukkan unit α-D-Galpyranose (Souza et al, 2010). Studi lain
menunjukkan adanya polisakarida dalam ekstrak air dari biji. Analisis oleh 13C, 1H
NMR dan FT-IR menunjukkan adanya monosakarida D-galaktosa dan D-Mannosa
(Lopes et al, 2013). Adanya galactomannan dalam biji juga telah dibuktikan
(Gallao et al, 2013), peneliti menunjukkan adanya galactomannan terletak di
endosperm. Senyawa-senyawa tersebut ditunjukkan pada tabel sebagai berikut :
7
Tabel 2.1 Senyawa-senyawa yang terdapat pada Caesalpinia ferrea
8
9
10
[Sumber : Journal of Medicinal Plant Research Volume 9 Number 5, 2015]
2.1.4 Aktivitas Biologis Caesalpinia ferrea

Dalam Journal of Medical Plant Research, sejak tahun 1960, spesies
tumbuhan tersebut telah dipelajari untuk mengetahui aktivitas biologis dan
sebagian besar penelitian tersebut dilakukan untuk mengetahui informasi tentang
indikasi, dosis penggunaan, dan bagian tanaman yang digunakan. Beberapa
aktivitas biologis Caesalpinia ferrea diantaranya :
11
a. Obat tradisional
Penelitian ethnopharmacological sebelumnya menunjukkan bahwa C.
ferrea digunakan di Brasil untuk pengobatan sejumlah penyakit. Biji dan kulit C.
ferrea telah digunakan dalam pengobatan tradisional dalam bentuk teh dan ramuan
untuk menurunkan berat badan dan untuk membersihkan luka. Buahnya digunakan
untuk pengobatan anemia, penyakit paru-paru (batuk yang diikuti dengan
perdarahan) dan diabetes. Beberapa kegiatan terapeutik telah dijelaskan dalam
literatur ilmiah. Penelitian lain juga menunjukkan bahwa infusa kulit batang C.
ferrea telah digunakan untuk mengobati enterocolitis dan diare.
Dalam buku “Plantas do Nordeste, Especialmente do Ceara" edisi ketiga
melaporkan beberapa sifat terapeutik, yaitu untuk pengobatan asma, memar, batuk
kronis, luka, antipiretik dan antidiabetes. Menurut Lewis akar C. ferrea digunakan
sebagai antipiretik dan antidiare dan rebusan kayunya menunjukkan adanya
aktivitas biologis antisekretori, serta ekstrak air dari akar C. ferrea memiliki sifat
antiinflamasi dan analgesik. Beberapa percobaan pada hewan coba juga telah
menunjukkan adanya efek analgesik, antiinflamasi dan antiulkus pada ekstrak buah
dan kulit batang spesies tersebut (Bacchi dan Sertie, 1994; Bacchi et al, 1995;
Carvalho et al, 1996).
b. Anti-inflamasi, analgesik dan efek antinosiseptive

Penelitian awal tentang aktivitas antiinflamasi dan analgesik dari ekstrak air
dari buah C. ferrea diperoleh dengan metode maserasi (Carvalho et al,1996). Crude
ekstrak (CE) menunjukkan penghambatan dalam pembentukan edema. Uji lain
dilakukan injeksi intraperitoneal dengan asam asetat pada tikus, ketika diobati
dengan 10 mg/kgBB dan 20mg/kgBB CE, jumlah geliat berkurang. Ekstrak alkohol
95% dari polong (kulit dan biji) C. ferrea dinilai memiliki aktivitas antiinflamasi
dan analgesik. Ekstrak dengan dosis 50 mg/kgBB menunjukkan penghambatan
pada telinga edema dan permeabilitas vaskuler. Ekstrak tersebut juga mampu
mengurangi migrasi sel ke rongga peritoneum. Selain itu, ekstrak pada dosis 12,5;
25 dan 50 mg/kgBB dapat mengurangi jumlah reaksi balik badan setelah diinduksi
asam asetat (Lima et al, 2012).
12
Penelitian terhadap buah C. ferrea juga telah dilakukan dengan metode

ekstraksi fluida superkritis (SFE) menggunakan CO2 yang digunakan untuk
pembalut luka. Kemudian dilakukan tes cytocompatibility dan evaluasi aktivitas
antiinflamasi (Dias et al, 2013). Ekstrak dan sebagian lipid dari biji C. ferrea
mempunyai efek antiinflamasi dan analgesik. Peneliti menunjukkan bahwa lipid
dari C. ferrea memberikan efek antinosiseptive. Selain itu, senyawa dari lipid
tersebut menghambat resptor opioid, reseptor kolinergik dan COX-2 (Sawada et al,
2014).
c. Antimikroba dan aktivitas antijamur

Aktivitas antimikroba terdapat pada ekstrak metanol 80% dengan metode
maserasi dari buah C. ferrea dengan nilai Konsentrasi Hambat Minimal (MIC)
sebesar 25,0-100,00 ug/mL menggunakan American Type Culture Collection
(ATCC) strain Candida albicans, Streptococcus mutans, Streptococcus salivarius,
Streptococcus oralis dan Lactobacillus casei (Sampaio et al, 2009). Ekstrak air
yang diperoleh dari biji juga menunjukkan adanya aktivitas antibakteri yang
diamati pada strain Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Enterobacter
aerogenes, Salmonella choleraensis, Klebsiella pneumoniae dan Pseudomonas
aeruginosa, serta aktivitas antijamur diamati pada Aspergillus niger,
Colletotrichium lindemuthianum, Colletotrichum truncatum, Fusarium oxysporum,
Fusarium solani, Fusarium pallidoroseum, Mucor sp., Neurospora sp., Penicillium
herguei, Phomopsis sp., Phytiumoli Gandrum, Rhizoctonia solani dan Thricoderma
viridae(Cavalheiro et al, 2009).
Penelitian lain juga menunjukkan crude ekstrak dari kulit C. ferrea
menunjukkan aktivitas antijamur, menghambat pertumbuhan ATCC ragi Candida
spp (Ferreira et a., 2013). Kadar hambat minimum yang diperoleh pada C. albicans
dan Candida krusei lebih efektif pada CE yang diperoleh dengan etanol-air atau
aseton-air, hasilnya tidak berbeda signifikan dengan yang diuji menggunakan
Cronobacter dublinensis dan Candida glabrata. Studi lain menunjukkan bahwa
kombinasi antara eritromisin dengan ekstrak alkohol 70% dari buah C. ferrea
memiliki potensi antimikroba yang sinergis terhadap S. aureus, dan memperbaiki
kerusakan struktural DNA Staphylococcus (Silva et al, 2013). Uji lain mengenai
13
efek antijamur pada ekstrak etanol menunjukkan aktivitas terhadap Aspergillus

parasiticus dan ekstrak tersebut efektif dalam mengendalikan pertumbuhan dan
produksi aflatoksin adalah A. parasiticus (Martins et al, 2014).
Dari evaluasi aktivitas antibakteri ekstrak kulit batang C. ferrea terhadap
strain gram positif (S.aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis
dan isolat klinis methicillin-resistant S.aureus) dan strain gram negatif (E. coli ,
Salmonella enteritidis, Shigella flexneri dan K.pneumoniae), CE aseton: air (7: 3)
menunjukkan penghambatan yang lebih besar terhadap sebagian besar bakteri,
sedangkan CE air menunjukkan aktivitas antibakteri yang lebih besar terhadap S.
epidermidis, E. faecalis dan Shigella flexineri. Hasil MIC, menunjukkan bahwa CE
aseton: air memberikan hasil yang lebih baik dibandingkan dengan ekstrak air.
Disamping itu, bakteri gram negatif yang paling resisten terhadap ekstrak yaitu E.
Coli (Araujo et al, 2014).
d. Antidiabetes
Pemberian ekstrak alkohol 80% dari buah C. ferrea menunjukkan aktivitas
penghambatan terhadap aldose reduktase (Ueda et al, 2002). Pada pengujian
redutase aldose in vitro asam ellagic dan 2- (2,3,6-trihidroksi-4-carboxyphenyl)
asam ellagic dari buah C. ferrea, diverifikasi bahwa kedua senyawa tersebut
menghambat akumulasi sorbitol dalam eritrosit, lensa dan saraf siatik saat
diinkubasi in vitro dengan glukosa (Ueda et al, 2004). Di sisi lain menunjukkan
bahwa ekstrak air buah C. ferrea bila digunakan dalam pengobatan kronis pada
reaktivitas vaskular dari tikus diabetes diinduksi aloksan, tidak dapat mengubah
kontraksi atau relaksasi (Carvalho et al, 2010).
Evaluasi sifat hipoglikemia dan mekanisme pengurangan kadar glukosa
dalam darah tikus diabetes melalui protein kinase B (PKB/ Akt), AMP-activated
protein kinase (AMPK) dan acetyl CoA karboksilase (ACC) dilakukan pada crude
ekstrak kulit batang C. ferrea (Vasconcelos et al, 2011). Para peneliti memverifikasi
bahwa CE mengurangi kadar glukosa darah dan meningkatkan metabolisme pada
hewan. P-Akt meningkat dan P-ACC berkurang dalam hati dan otot rangka hewan
perlakukan, P-AMPK hanya terdapat di otot rangka. Parameter biokimia pada dosis
14
450 mg/kgBB/hari CE kulit batang C. ferrea memperlihatkan penurunan kadar

urea, asam urat, AST dan ALT.
e. Antioksidan
Dalam studi yang dilakukan pada ekstrak etanol dari buah C. ferrea
menunjukkan aktivitas antioksidan yang kuat pada uji in vitro dan menunjukkan
korelasi yang signifikan dan linear antara konten fenolik dan aktivitas antioksidan
dengan alat uji phosphomolibdenium sebagai aktivitas antioksidan superoksida
(Silva et al, 2011). Studi yang menunjukkan kapasitas antioksidan dengan metode
diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) telah dilakukan dan menunjukkan aktivitas
moderat. Ketika dianalisis dengan β-Carotene atau sistem asam linoleat, hasilnya
menunjukkan nilai aktivitas antioksidan yang tinggi (Port's et al, 2013).
f. Antitumor
Asam galat dan metil galat yang diisolasi dari buah C. ferrea diuji in vitro
pada antigen virus Epstein-Barr dan diamati secara signifikan terjadi pengurangan
jumlah rata-rata papiloma pada pembentukan tumor kulit pada tikus (Nakamura et
al, 2002). Pada tahun 2003, aktivitas kemopreventif kanker 2- (2,3,6-trihidroksi-4-
carboxyphenyl) asam ellagic dari buah C. ferrea dievaluasi pada tikus yang
diinduksi papiloma, hasilnya senyawa tersebut dapat menghambat pertumbuhan
tumor (Inada et al, 2003).
g. Aktivitas biologis lainnya

Aktivitas lain dari ekstrak C. ferrea menunjukkan penghambatan terhadap
replikasi virus herpes simplex virus (HSV) dan polio-virus (PV) pada tahap setelah
penetrasi dan sintesis protein virus (Lopes et al, 2013).
Uji lain menunjukkan adanya aktivitas pada kardiovaskular yang dilakukan
pada tikus normotensi yang diinduksi hipotensi dan takikardia yang diberikan crude
ekstrak air kulit batang C. ferrea. Pada dosis 40 mg/kgBB dapat menginduksi
bradiaritmia sementara. Efek vasodilatasi pada arteri mesenterika tikus yang
dimediasi oleh channel ATP-sensitif K+ yang terbuka juga telah dilaporkan
(Menezes et al, 2007). Senyawa Pauferrol A, B dan C ekstrak kulit batang C. ferrea
15
menunjukkan aktivitas penghambatan terhadap topoisomerase II dan proliferasi sel

melalui induksi apoptosis pada sel leukemia HL 60 (Nozaki et al, 2007). Pengujian
inhibitor tripsin pada ekstrak biji C. ferrea terhadap jamur Colletotrichum
guaranicola, Corynespora cassiicola, Fusarium oxysporum dan Sclerotium rolfsii
juga telah dilakukan (Bariani et al, 2012).
2.2 Ekstraksi
2.2.1 Definisi Ekstraksi
Ekstraksi adalah kegiatan penarikan kandungan kimia dengan
menggunakan pelarut tertentu. Senyawa aktif yang terdapat dalam berbagai
simplisia dapat digolongkan kedalam golongan minyak atsiri, alkaloida,
flavonoida, dll. Dengan diketahuinya senyawa aktif yang dikandung simplisia akan
mempermudah pemilihan pelarut dan cara ekstraksi yang tepat (Ditjen POM, 2000).
2.2.2 Metode Ekstraksi

a. Maserasi
Maserasi adalah metode ekstraksi dengan cara merendam simplisia dengan
pelarut pada suhu kamar dengan beberapa kali pengocokan atau pengadukan hingga
diperoleh konsentrasi pada keadaan seimbang. Sedang kan remaserasi adalah
pengulangan maserasi dengan menambahkan pelarut setelah dilakukan
penyaringan maserat pertama dan seterusnya. Remaserasi dilakukan hingga tidak
ada lagi kandungan kimia yang dapat disari oleh pelarut yang digunakan. Hasil yang
diperoleh dari maserasi yaitu maserat atau ekstrak cair, yang selanjutnya pelarut
diuapkan kembali sehingga diperoleh ekstrak kental atau ekstrak kering (Ditjen
POM, 2000).
Maserasi dapat dilakukan dengan satu macam pelarut, atau modifikasi
dengan beberapa pelarut yang mempunyai tingkat kepolaran yang berbeda atau
sering disebut dengan maserasi bertingkat. Tujuan dari maserasi bertingkat adalah
untuk memisahkan kandungan kimia yang terdapat dalam tanaman dari mulai
dilakukannya ekstraksi. Maserasi bertingkat dimulai dari pelarut yang paling non
polar hingga pelarut yang sangat polar. Penggantian pelarut ditentukan dengan
melihat intensitas warna pelarut atau dengan KLT untuk memastikan bahwa
16
maserat pada tingkatan pelarut tertentu sudah tidak lagi mengandung metabolit
sekunder yang dimaksud (Ditjen POM, 2000).
b. Perkolasi
Perkolasi adalah ekstraksi yang dilakukan dengan mengalirkan pelarut
melalui serbuk simplisia yang telah dibasahi. Prosesnya terdiri dari tahap
pengembangan dan perkolasi sebenarnya secara terus-menerus sampai diperoleh
ekstrak (perkolat) yang jumlahnya 1-5 kali bahan (Ditjen POM, 2000).
c. Refluks
Prinsip dari metode refluks adalah ekstraksi dengan pelarut pada temperatur
titik didihnya, selama waktu tertentu dengan jumlah pelarut terbatas yang relatif
konstan dengan adanya pendingin balik. Umumnya dilakukan pengulangan 3-5 kali
pada residu pertama untuk memperoleh ekstrak yang yang sempurna. Pelarut dan
simplisia diletakkan didalam labu destilasi atau erlenmeyer, kemudian dipanaskan
pada temperatur titik didih pelarut yang digunakan. Pelarut akan menyari
kandungan kimia pada simplisia. Setelah proses refluks selesai, dilakukan
penyaringan (Ditjen POM, 2000).
d. Sokhlet
Sokhlet merupakan ekstraksi dengan menggunakan pelarut yang selalu baru
yang dilakukan dengan alat sokhlet sehingga terjadi ekstraksi kontinu dengan
jumlah pelarut relatif konstan karena adanya pendingin balik. Pelarut yang
digunakan untuk ekstraksi diletakkan diatas pemanas yang telah diatur suhunya
sesuai dengan titik didih pelarut, kemudian pelarut akan menguap dan didinginkan
melalui kondensor dan pelarut akan turun ke bagian tabung sampel. Pelarut akan
kontak dan menyari kandungan kimia pada simplisia. Setelah pelarutnya penuh
pada batas atas tabung sampel, pelarut dengan kandungan kimia yang terlarut akan
turun kedalam labu pelarut. Proses tersebut akan berulang kembali sampai beberapa
kali siklus (Ditjen POM, 2000).
17
2.3 Penapisan Fitokimia dan Identifikasi Senyawa

2.3.1 Definisi Penapisan Fitokimia
Skrining fitokimia merupakan analisis kualitatif terhadap senyawa-senyawa
metabolit sekunder. Ekstrak dari bahan kimia terdiri dari berbagai macam senyawa
metabolit sekunder yang berperan untuk aktivitas biologi. Senyawa-senyawa
tersebut diidentifikasi dengan pereaksi-pereaksi yang mampu memberikan ciri khas
dari setiap golongan dari metabolit sekunder (Harborne, 1987).
2.3.2 Identifikasi Senyawa

a. Alkaloid
Alkaloid merupakan senyawa metabolit yang bersifat basa, mengandung
satu atau lebih atom nitrogen yang berbentuk siklik. Sebagian besar alkaloid
berbentuk kristal dan sebagian kecil berupa cairan pada suhu kamar, terasa pahit,
dan biasanya berwarna putih. Alkaloid dialam berbentuk basa dan juga dalam
bentuk garam. Sehingga untuk ekstraksinya dibasakan terlebih dahulu dengan
amonia kemudian ditarik dengan pelarut non polar seperti heksana, kloroform, dan
diklorometana. Alkaloid dengan bentuk garam dapat ditarik dengan air dalam
kondisi asam. Penapisan fitokimia alkaloid dapat dilakukan dengan beberapa
pereaksi seperti mayer, dragendorf, dan bouchardat (Harborne, 1987).
b. Tanin
Tanin merupakan senyawa yang mempunyai gugus fenol, rasa sepat, dan
memiliki kemampuan menyamak kulit. Secara kimia, terdapat dua golongan tanin,
yaitu tanin terkondensasi dan tanin terhidrolisis. Tanin terkondensasi secara
biosintesis terbentuk dengan cara kondensasi katekin tunggal atau galokatekin yang
membentuk senyawa dimer dan kemudian oligamer yang lebih tinggi. Sedangkan
tanin terhidrolisis mengandung ikatan ester yang terhidrolisis jika didihkan dalam
asam klorida encer (Harborne, 1987).
c. Saponin
Saponin merupakan glikosida triterpen yang sifatnya menyerupai sabun.
Senyawa tersebut dapat menimbulkan busa jika dikocok dengan air, dapat
18
menurunkan tegangan permukaan dan pada konsentrasi rendah dapat menyebabkan

hemolisis pada sel darak merah. Saponin dalam bentuk aglikon, terdiri dari
sapogenin dan saponin steroid atau saraponin (Harborne, 1987).
d. Flavonoid
Flavonoid adalah senyawa polifenol yang dapat menghambat banyak reaksi
oksidasi baik secra enzimatis maupun non enzimatis. Senyawa tersebut
mengandung sistem aromatik yang terkonjugasi, oleh karena itu dapat
menunjukkan pita serapan kuat pada daerah spektrum UV dan spektrum tampak.
Flavonoid yang terdapat pada tumbuhan sebagai glikosida dan aglikon flavonoid.
Untuk menganalisis flavonoid, yang diperiksa adalah aglikon dalam ekstrak
tumbuhan yang sudah dihidrolisis (Harborne, 1987).
e. Terpenoid
Terpen adalah senyawa yang tersusun atas isopren dan kerangka karbonnya
dibentuk oleh penyambungan dua atau lebih satuan isopren. Terpenoid terdiri dari
beberapa macam senyawa yaitu monoterpen seskuiterpen yang mudah menguap,
diterpen yang sukar menguap serta triperpen dan sterol yang tidak menguap.
Berdasarkan pada strukturnya, terpenoid akan memberikan warna yang
karakteristik dengan pereaksi Liberman-Bouchardat yang ditandai oleh
terbentuknya warna hijau atau violet biru (Harborne, 1987).
f. Antrakuinon
Senyawa kuinon terdapat pada sejumlah besar pigmen dalam tanaman.
Kuinon alam biasanya terdapat dalam bentuk terhidroksi sebagai fenol. Kuinon
alam dikelompokkan menjadi antrakuinon, naftokinon, dan benzokinon.
Antrakuinon seperti aloin dan emodin memiliki khasiat farmakologi sebagai
laksatif. Pada umumnya kuinon berwarna merah, kuning, atau coklat. Tetapi dalam
bentuk basa hidroksi kuinon warnanya berubah menjadi ungu, biru, atau hijau
(Harborne, 1987).
19
g. Glikosida
Glikosida adalah senyawa yang apabila dihidrolisis akan terurai menjadi
gula (glikon) dan aglikon. Umumnya glikon berupa glukosa, fruktosa, laktosa,
galaktosa, dan manosa. Aglikon (genin) biasanya mempunyai gugus -OH dalam
bentuk alkohol atau fenol. Kegunaan glikosida pada tanaman adalah untuk
cadangan gula sementara (Harborne, 1987).
2.4 Enzim
2.4.1 Definisi Enzim
Enzim adalah polimer biologik yang mengkatalisis reaksi kimia yang
berlangsung di dalam tubuh dengan kecepatan reaksi 106 kali tanpa mengubah
konstanta kesetimbangan reaksi. Enzim bersifat selektif dan spesifik terhadap
reaksi dan substrat yang akan dikatalisis sehingga dapat memberikan kemampuan
pada sel untuk mengontrol suatu proses kimiawi (Murray, Granner dan Rodwell,
2006).
Struktur enzim terdiri dari komponen protein (apoenzim) dan komponen
non protein (gugus prostetik) yang terdiri dari kofaktor dan koenzim. Gugus
prostetik adalah suatu molekul/ion yang terkandung didalam enzim dan juga ikut
serta secara langsung dalam katalisis atau pengikatan substrat. Gugus protetik yang
berupa senyawa organik disebut dengan koenzim, sedangkan gugus prostetik yang
berupa senyawa anorganik disebut dengan kofaktor. Contoh koenzim diantaranya
tiamin pirofosfat, koenzim A, piridoksal fosfat, dll. Contoh kofaktor diantaranya
logam Fe, Mg, Mn, Cu, Zn, dll. Enzim juga mempunyai sisi aktif (active site) yang
merupakan tempat menempelnya substrat (Murray, Granner dan Rodwell, 2006).
2.4.2 Klasifikasi Enzim

Berdasarkan jenis reaksi yang dikatalisis, enzim digolongkan menjadi enam
golongan utama, yaitu (Murray, 2006) :
a. Oksidoreduktase adalah enzim yang mengatalisis reaksi oksidasi-reduksi.
b. Transferase adalah enzim yang mengatalisis pemindahan gugus fungsional dari
suatu senyawa ke senyawa lainnya.
c. Hidrolase adalah enzim yang mengatalisis reaksi hidrolisis.
20
d. Liase adalah enzim yang mengatalisis reaksi pembentukan atau pemecahan

ikatan rangkap.
e. Isomerase adalah enzim yang mengatalisis perubahan konformasi molekul
(isomerisasi)
f. Ligase adalah enzim yang mengatalisis pembentukan ikatan kovalen.
2.4.3 Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Laju Enzim

a. Suhu
Peningkatan suhu akan meningkatkan laju reaksi yang dikatalisis oleh
enzim. Kecepatan reaksi akan meningkat seiring dengan peningkatan suhu akibat
peningkatan energi kinetik pada molekul-molekul yang bereaksi. Suhu optimum
enzim umumnya 37o C. Setiap kenaikan suhu 10o C kecepatan laju reaksi atau
energi kinetik akan menjadi dua kali lipat sampai batas tertentu. Jika peningkatan
energi kinetik melampaui batas akan mengakibatkan terputusnya ikatan hidrogen
dan hidrofobik yang mempertahankan struktur enzim, hal tersebut dapat
menyebabkan denaturasi enzim atau hilangnya aktivitas litik pada enzim (Murray,
Granner dan Rodwell, 2006).
b. pH
Perubahan pH lingkungan akan berpengaruh pada efektivitas bagian aktif
enzim. Dengan adanya perubahan pH yang cukup drastis dapat menyebabkan
denaturasi sehingga menurunkan efektivitas enzim (Murray, Granner dan Rodwell,
2006).
c. Konsentrasi substrat
Ikatan substrat dengan enzim dalam bentuk kompleks enzim-substrat akan
dihasilkan suatu produk. Peningkatan atau penurunan konsentrasi substrat akan
mempengaruhi jumlah kompleks enzim-substrat yang akan mempengaruhi jumlah
produk yang dihasilkan. Kecepatan reaksi akan meningkat seiring dengan
peningkatan konsentrasi substrat hingga tercapai kecepatan maksimal. Jika
kecepatan maksimal telah tercapai adanya peningkatan konsentrasi substrat tidak
dapat meningkatkan kecepatan reaksi. Hal tersebut terjadi karena enzim telah jenuh
21
substrat karena jumlah substrat telah melampaui konsentrasi enzim (Murray,

Granner dan Rodwell, 2006).
2.4.4 Kinetika Enzim

a. Persamaan Michaelis- Menten
Persamaan tersebut memperlihatkan hubungan antara kecepatan awal reaksi
(Vi) dan konsentrasi substrat (S) (Murray, Granner dan Rodwell, 2006).
Keterangan :
Vi : kecepatan awal reaksi
Km : konstanta Michaelis (konsentrasi substrat dengan Vi adalah separuh dari
kecepatan maksimal (Vmax/2) yang dapat dicapai pada konsentrasi tertentu
enzim.
Vmax : kecepatan maksimum
S : konsentrasi substrat
[Sumber : Murray, Granner dan Rodwell, 2006]

Gambar 2.2 Pengaruh konsentrasi substrat pada kecepatan reaksi
enzim
Dilihat dari definisi konstanta Michaelis, Km memiliki besaran konsentrasi
substrat. Ketergantungan kecepatan reaksi awal pada [S] dam Km dapat
22
diilustrasikan dengan mengevaluasi persamaan Michaelis-Menten dalam tiga

kondisi.
(1) Jika (S) < Km ( Gambar A) , maka Km + (S) = Km. Substitusi pada
persamaan sehingga
Vmaks dan Km bernilai konstan, maka Vi = k(S).

(2) Jika (S) > Km (Gambar C), maka Km + (S) = (S). Substitusi pada persamaan
sehingga
maka Vi = Vmaks dan tidak dipengaruhi oleh peningkatan lebih lanjut k(S).
(3) Jika (S) = Km ( Gambar B) , maka Km + (S) = Km. Substitusi pada
persamaan sehingga
Maka V1 = separuh Vmaks, sehingga Km dapat ditentukan secara

ekperimental dari k(S) saat V1 = separuh Vmaks.
b. Plot lineweaver-burk
Plot lineweaver-burk atau plot timbal balik ganda adalah plot yang dibentuk
dari persamaan linear Michaelis-Menten.
Plot tersebut digunakan untuk :
- Menentukan atau mengevaluasi Km dan Vmax
- Membedakan inhibitor kompetitif dan nonkompetititf serta mempermudah
evaluasi konstanta inhibisi
23

Gambar 2.3 Plot Lineweaver- Burk
2.4.5 Tipe Penghambatan Enzim

Penghambat enzim atau inhibitor adalah suatu senyawa yang dapat
menghambat atau mengurangi aktivitas katalitik enzim baik secara reversibel
maupun irreversibel. Penghambatan reaksi enzim dapat digunakan untuk strategi
dalam merancang obat. Hal tersebut dapat terjadi karena sifat enzim yang selektif
dan spesifik terhadap reaksi dan substratnya sehingga dapat digunakan untuk
merancang suatu penghambat enzim yang dapat menghalangi ikatan enzim dan
substrat (Sharma, 2012).
a. Inhibisi kompetitif
Inhibisi kompetitif terjadi ketika inhibitor berkompetisi dengan substrat
untuk berikatan pada situs aktif enzim yang sama. Struktur inhibitor yang sama
dengan substrat dapat berikatan secara reversibel pada enzin membentuk kompleks
enzim-inhibitor yang tidak dapat menghasilkan produk dan menghalangi substrat
untuk berikatan dengan situs aktif membentuk kompleks enzim-substrat. Pada plot
Lineweaver- Burk untuk inhibitor kompetitif dapat meningkatkan nilai Km atau
konsentrasi substrat (Murray, Granner dan Rodwell, 2006).
24

Gambar 2.4 Plot Lineweaver- Burk untuk inhibitor kompetitif
b. Inhibisi nonkompetitif
Inhibisi nonkompetitif terjadi apabila inhibitor berikatan di luar sisi aktif
enzim yang telah berikatan dengan substrat sehingga membentuk kompleks enzim-
substrat-inhibitor yang dapat memperlambat reaksi pembentukan produk dan
adanya perubahan pada konformasi situs aktif sehingga afinitas substrat dengan
permukaan katalik menurun. Struktur inhibitor nonkompetitif biasanya tidak atau
sedikit mirip dengan struktur substrat. Pada plot Lineweaver- Burk untuk inhibitor
nonkompetitif menunjukkan penurunan kecepatan reaksi maksimum (Vmaks)
namun konsentrasi substrat (Km) tetap (Murray, Granner dan Rodwell, 2006).

Gambar 2.5 Plot Lineweaver- Burk untuk inhibitor nonkompetitif
25
c. Inhibisi unkompetitif
Inhibisi unkompetitif terjadi karena inhibitor mengikat enzim bebas atau
kompleks enzim-substrat yang membuka sisi ikatan inhibitor. Inhibitor
unkompetitif tidak memiliki struktur yang sama dengan substrat dan ikatannya jauh
dari sisi aktif enzim akan tetapi dapat mengganggu struktur aktif dan bagian
alosterik dari kompleks enzim menginaktifkan katalisis sehingga terjadi penurunan
konsentrasi substrat (Km) dan kecepatan reaksi (Murray, Granner dan Rodwell,
2006).

Gambar 2.6 Plot Lineweaver- Burk untuk inhibitor unkompetitif
d. Inhibisi campuran
Inhibisi tersebut terjadi karena inhibitor mengikat sisi aktif enzim yang
berbeda dengan substrat normal pada enzim, sehingga substrat masih bisa berikatan
dengan sisi aktif enzim. Inhibitor tipe ini dapat berikatan dengan enzim bebas
maupun enzim yang telah berikatan dengan substrat. Ikatan enzim-inhibitor-
substrat dapat menyebabkan perubahan konformasi pada sisi aktif enzim sehingga
ikatan antara enzim dengan substrat tidak optimum dan terjadi penurunan kecepatan
reaksi dalam pembentukan produk (Murray, Granner dan Rodwell, 2006).
2.5 Enzim Arginase

2.5.1 Arginase
Arginase (L-arginine ureahydrolase, atau amidinohydrolase, EC 3.5.3.1)
adalah enzim hidrolitik yang mengkatalisis perubahan L-arginin menjadi ornithine
26
dan urea. Arginase merupakan metalloenzyme mangan yang menghidrolisis L-

arginin untuk dijadikan urea dan L-ornithine. Arginase ada dalam dua isoform yang
berbeda, arginase I dan II (Ash, 2000). Arginase I adalah enzim sitosolik yang
banyak ditemukan di hati sebagai komponen dari siklus urea. Enzim tersebut
memiliki peran penting aktivitas arginase dalam tubuh dan memiliki peran penting
dalam proses reduksi nitrogen dan metabolisme nukleotida melalui siklus urea.
Arginase II adalah enzim mitokondria dengan distribusi yang luas dalam ginjal,
prostat, saluran pencernaan, dan pembuluh darah. Peran arginase II adalah terlibat
dalam regulasi homeostasis L-arginin dan produksi L-ornithine untuk poliamina
dan sintesis prolin untuk proliferasi sel dan metabolisme NO (Morris, 2005).
2.5.2 Metabolisme L-Arginin oleh Sel Vaskular

L-Arginin adalah asam amino semi-esensial yang terlibat dalam berbagai
proses fisiologis. L-Arginin adalah prekursor yang diperlukan untuk biosintesis
protein dan kreatinin dan memiliki peran dalam modulasi keseimbangan nitrogen.
Studi di akhir 1980-an, menemukan bahwa L-arginin dioksidasi menjadi NO dan
L-citrulline oleh oksida nitrat sintase (NOS) (Hibbs et al, 1988; Palmer et al, 1988).
L-citrulline selanjutnya didaur ulang kembali ke L-arginin oleh tindakan berturut-
turut sintetase argininosuccinate dan lyase argininosuccinate (Hecker et al, 1990).
Ada tiga isoform yang berbeda dari NOS; neuronal NOS (nNOS atau NOS-
1), endotel NOS (eNOS atau NOS-3), dan inducible NOS (iNOS atau NOS-2)
(Forstermann dan Sessa, 2012). Isozymes ini menampilkan perbedaan dalam
jaringan distribusi, lokalisasi intraseluler, regulasi molekul, dan kinetika enzim.
Pelepasan NO oleh sel-sel pembuluh darah memainkan peran penting homeostasis
dalam sirkulasi dengan menghambat tonus pembuluh darah, agregasi platelet,
adhesi leukosit dan infiltrasi ke dalam dinding pembuluh darah, serta proliferasi dan
migrasi dari sel otot polos pembuluh darah (Durante, 2001; Forstermann dan Sessa,
2012).
Studi pada 1990-an mengungkapkan bahwa enzim arginase yang
mengkatalisis hidrolisis L-arginin menjadi L-ornithine dan urea (Buga et al, 1996;
Durante et al, 1997). Produk arginase L-ornithine selanjutnya dimetabolisme oleh
sitosol enzim ornithine dekarboksilase ke putresin poliamina yang membentuk
27
poliamina berturut-turut, spermine, dan spermidine (Tabor dan Tabor, 1984).

Proliferasi sel otot pembuluh darah dan sel endotel didahului oleh peningkatan
sintesis poliamina (Morrison dan Seidel, 1995; Durante et al, 1998). L-Ornithine
juga dikatabolisme oleh enzim ornithine aminotransferase mitokondria menjadi
pyrroline-5-karboksilat, yang selanjutnya dimetabolisme untuk membentuk L-
prolin oleh enzim pyrroline 5-karboksilat reduktase. L-Proline diperlukan untuk
sintesis banyak protein struktural, termasuk kolagen (Durante et al, 2001). L-arginin
juga dapat dimetabolisme oleh enzim arginin dekarboksilase menjadi agmatine,
yang memunculkan dampak anti-proliferasi (Regunathan et al, 1996). Namun,
temuan terakhir perlu pembuktian lebih lanjut.
[Sumber : Durante, William, 2013]

Gambar 2.7 Regulasi metabolisme L-arginine oleh sel vaskular
28
[Sumber : Pernow, John, et.al., 2013]

Gambar 2.8 Regulasi metabolisme L-arginine oleh sel vaskular
2.5.3 Kaitan Enzim Arginase dan Aterosklerosis

Bukti penelitian menunjukkan bahwa arginase juga memberikan kontribusi
untuk perkembangan lesi aterosklerosis. Aktivitas arginase II secara signifikan
meningkatkan defisiensi apolipoprotein E (apoE) tikus hiperkolesterolemia yang
diberi diet kolesterol tinggi (Ryoo et al, 2008). Secara farmakologis, blokade
arginase dapat mengurangi beban plak sekitar 50% dan secara nyata mengurangi
ketebalan rata-rata dinding aorta pada hewan defisiensi apoE. Demikian pula,
penghambatan arginase II pada tikus kekurangan apoE tinggi lemak, lesi arteri
menjadi lebih kecil. Selain itu, ukuran core nekrotik juga berkurang (Ming et al,
2012). Sebaliknya, tikus transgenik defisiensi apoE dengan adanya aktivitas
arginase II menunjukkan peningkatan pengembangan lesi aorta tanpa perubahan
lipid plasma (Vaisman et al, 2012). Studi ini menunjukkan bahwa peningkatan
aktivitas arginase II di endotel mengakibatkan kekakuan arteri dan perkembangan
lesi aterosklerosis.
Ada beberapa mekanisme potensial dimana arginase II memberikan efek
aterogeniknya. Gangguan disfungsi endotel dan berkurangnya pelepasan NO
memainkan peran penting dalam pengembangan dan perkembangan aterosklerosis
(Lerman dan Zeiher, 2005). Penghambatan arginase untuk memperbaiki disfungsi
29
endotel sangat signifikan. Penghambatan arginase II meningkatkan produksi NO

dan fungsi endotel pada hewan kekurangan apoE (Ryoo et al, 2008). Penghambatan
arginase baru-baru ini telah ditunjukkan untuk meningkatkan fungsi endotel pada
pasien dengan penyakit arteri koroner (Shemyakin et al, 2012). Efek
menguntungkan dari inhibitor arginase sangat tergantung pada peningkatan
bioavailabilitas NO. Kesimpulannya arginase II menginduksi disfungsi endotel dan
hipertensi pada tikus, enzim ini merugikan dalam sistem kardiovaskular (Vaisman
et al, 2012).
Arginase II juga dapat mengakibatkan aterosklerosis dengan meningkatkan
respon inflamasi leukosit. Monosit dan makrofag pada aterosklerosis berperan
penting dalam inisiasi, perkembangan, dan pecahnya plak aterosklerotik (Libby,
2002; Mantovani et al, 2009; Shibata dan Glass, 2009). Monosit mudah menyusup
lesi vaskular, berdiferensiasi menjadi makrofag, menelan partikel lipoprotein, dan
menimbulkan sel busa. Makrofag merupakan kontributor selular utama pada
pembentukan lesi dan plak dengan mengeluarkan sitokin inflamasi dan oksigen
reaktif. Diketahui arginase mempengaruhi polarisasi sel-sel tersebut. Secara
khusus, arginase II dan fenotip M1 makrofag meningkatkan pelepasan mediator
inflamasi dan protease, dan berhubungan dengan lesi aterosklerosis (Khallou-
Laschet et al, 2010; Ming et al, 2012).
Peran proinflamasi arginase II juga diamati secara in vivo. Arginase II
menyebabkan infiltrasi makrofag dan meningkatkan ekspresi sitokin inflamasi di
jaringan adiposa tikus yang diberi diet tinggi lemak (Ming et al, 2012). Defisiensi
arginase II juga mengurangi infiltrasi makrofag dan ekspresi sitokin dalam plak
aterosklerosis tikus defisiensi apoE. Selain itu, percobaan lain menyatakan bahwa
defisiensi arginase II mengakibatkan berkurangnya pelepasan monosit. Dengan
demikian, arginase II dapat memperburuk pembentukan lesi arteri dengan
mempromosikan disfungsi endotel dan potensi proinflamasi monosit dan makrofag.
2.5.4 Inhibitor Enzim Arginase

Berdasarkan studi klinis dan eksperimen yang telah dilakukan, beberapa
inhibitor enzim arginase yang digunakan pada penelitian mengenai perkembangan
penyakit kardiovaskular terdapat pada tabel berikut ini.
30
Tabel 2.2 Studi intervensi inhibitor enzim arginase dalam studi eksperimental dan
klinis
[Sumber : Cardiovascular Research (2013) 98, 334–343]
2.6 Spektrofotometri Uv-Vis

Spektrum Uv-Vis adalah hasil interaksi antara radiasi elektromagnetik
(REM) berupa cahaya tampak, sinar X, dan sinar UV dengan suatu molekul. Sinar
UV mempunyai panjang gelombang 400-800 nm. Senyawa yang dapat memberikan
31
serapan pada instrumen tersebut adalah senyawa yang memiliki gugus kromofor,
yaitu gugus fungsional yang dapat mengabsorbsi sinar UV dan tampak jika
berkonjugasi dengan senyawa-senyawa bukan pengabsorbsi (auksokrom).
Spektrofotometer UV-Vis digunakan untuk mengukur besarnya energi yang
diabsorbsi. Analisis kuantitatif dilakukukan pada panjang gelombang maksimum (λ
maks) karena pada λ maks akan diperoleh serapan maksimum, dimana perubahan
serapan karena konsentrasi juga maksimum sehingga kepekaan dan keakuratan
lebih tinggi. Selain itu λ maks memiliki daya serap yang relatif konstan sehingga
dapat diperoleh kurva kalibrasi yang linear (Harmita, 2006).
BAB 3
METODE PENELITIAN
3.1 Lokasi dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia dan
Laboratorium Kimia Kuantitatif Fakultas Farmasi Universitas Indonesia dari bulan
Desember 2016 hingga Mei 2017.
3.2 Alat
Peralatan yang digunakan dalam penelitian antara lain seperangkat alat
gelas dan kaca yang terdapat pada laboratorium, labu maserasi (Pyrex, Indonesia),
penguap putar vakum (Buchi), penangas air (Daihan, China), pipet mikro
(Finnpipette, Amerika), micropalate reader (Epoch, Amerika), microplate 96
sumuran (MicroWell, Inggris), timbangan analitik (Sartorius 7), pH meter (Eutech
Instrument, Perancis), tabung reaksi (Pyrex, Indonesia), rak tabung reaksi, dan
spektrofotometri Uv-Vis (Nunc, Denmark).
3.3 Bahan
3.3.1 Bahan Uji
Penelitian menggunakan ekstrak n-heksan, etil asetat, dan metanol kulit
batang Caesalpinia ferrea yang diperoleh dari Laboratorium Farmakognosi dan
Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas Indonesia.
3.3.2 Bahan Baku Pembanding

Nor-NOHA (Cayman, AS) sebagai standar pada uji penghambatan aktivitas
arginase.
3.3.3 Bahan Kimia

Arginase (Sigma, AS), L-arginine (Sigma, AS), asam maleat, mangan sulfat
(Sigma, AS), kit uji kadar urea (Quantichrom®, Bioassay AS), dimetil sulfoksida
(Merck, Jerman), n-heksan, etil asetat, dan metanol pro analisis (Merck, Jerman),
dan bahan uji identifikasi lainnya.
32
33
3.4 Cara Kerja

3.4.1 Penyiapan Simplisia
Simplisia Caesalpinia ferrea Cortex diperoleh dari pusat konservasi
tumbuhan, Kebun Raya Bogor. Tanaman ini telah dideterminasi di Lembaga Ilmu
Pengetahuan Indonesia (LIPI), Bogor.
3.4.2 Ekstraksi
Metode ekstraksi yang digunakan adalah maserasi bertingkat dengan
dengan menggunakan pelarut secara berturut-turut n-heksana, etil asetat, dan
metanol.
Sebanyak 300 gram simplisia dimaserasi dengan pelarut n-heksana
sebanyak 1,2 liter (1:4) dengan menggunakan shaker dengan kecepatan 100-120
rpm selama 2 jam secara berulang hingga kepekatan warnanya berkurang
(dilakukan secara triplo). Selanjutnya residu dimaserasi kembali secara berturut-
turut dengan pelarut etil asetat dan metanol dengan perbandingan simplisia dan
pelarut yang sama (1:4) dengan cara yang sama. Masing-masing filtrat dari pelarut
dilakukan pemekatan dengan rotary evaporator dan penguapan sisa pelarut dengan
melektakkan pada waterbath atau penangas air hingga diperoleh ekstrak kental.
3.4.3 Penapisan Fitokimia (Identifikasi Senyawa)

3.4.3.1 Alkaloid
a. Sebanyak 20 mg ekstrak kental dimasukkan ke dalam tabung reaksi,
ditambahkan 1 mL HCl 2N dan 9 mL air
b. Larutan dimasukkan ke dalam beaker glass berisis air panas, kemudian
dipanaskan dipenangas air selama 2 menit, didinginkan.
c. Larutan disaring dan ditampung filtratnya. Filtrat tersebut digunakan sebagai
larutan uji
- 1 mL filtrat, diteteskan diatas kaca arloji, ditambahkan 2 tetes pereaksi
bouchardat, terbentuk endapan coklat/hitam (positif alkaloid).
- 1 mL filtrat, diteteskan diatas kaca arloji, ditambahkan 2 tetes pereaksi mayer,
terbentuk endapan menggumpal putih atau kuning yang larut dalam metanol
(positif alkaloid).
34
- 1 mL filtrat, diteteskan diatas kaca arloji, ditambahkan 2 tetes pereaksi

dragendorff, terbentuk endapan jingga coklat (positif alkaloid).
3.4.3.2 Tanin
a. Sebanyak 20 mg ekstrak kental dilarutkan dalam 15 mL air suling panas dan
diaduk.Setelah dingin kemudian disaring.
b. Filtrat sebanyak masing-masing 1 mL dikerjakan sebagai berikut,
- Ditambahkan 3 mL larutan gelatin 10% dan diperhatikan adanya endapat
putih.
- Ditambahkan 2 tetes larutan FeCl3 3% dan diperhatikan terjadinya perubahan
warna menjadi hiaju violet.
- Ditambahkan 3 mL larutan NaCl-gelatin dan diperhatikan adanya endapan
putih
3.4.3.3 Saponin
a. Sebanyak 15 mg ekstrak kental ditambahkan 10 mL air panas, didinginkan
kemudian dikocok kuat-kuat selama 5 detik, lalu didiamkan selama 5 menit.
Terbentuk buih yang mantap setinggi 1 hingga 10 cm.
b. Pada penambahan 1 tetes HCl 2N buih tidak hilang.
3.4.3.4 Flavonoid
a. Sebanyak 50 mg ekstrak kental dilarutkan dalam 3 mL etanol 95%, kemudian
ditambahkan 100 mg serbuk Zn dan 2 mL HCl 2N dan didiamkan selama 1
menit. Kemudian ditambahkan 10 tetes HCl pekat P, jikan dalam waktu 2
sampai 5 menit terjadi warna merah intensif, menunjukkan adanya flavonoid
b. Sebanyak 50 mg ekstrak kental dilarutkan dalam 3 mL etanol 95%, kemudian
ditambahkan 100 mg serbuk Mg dan 10 tetes asam HCl pekat. Jika terjadi
warna merah jingga sampai merah ungu menunjukkan adanya flavonoid. Jika
warna kuning jingga menunjukkan adanya flavon, kalkon, dan auron.
c. Sebanyak 50 mg ekstrak kental dilarutkan dalam 3 mL aseton, ditambahkan 50
mg asam oksalat dan 50 mg asam borat, diaduk kemudian diamkan hingga
mengering. Lalu tambahkan 3 mL dietil eter, diaduk kemudian diamkan hingga
35
mengering lalu lihat dibawah sinar UV 366 nm akan berfluoresensi kuning

kehijauan.
d. Sebanyak 20 mg ekstrak kental dilarutkan dalam 3 mL etanol 95%, diteteskan
di atas kertas saring, lalu disemprotkan dengan AlCl3. Dilihat di bawah sinar
UV 366 nm akan berfluoresensi kuning.
3.4.3.5 Terpenoid
Sebanyak 100 mg ekstrak kental diencerkan dengan 3 mL etil asetat,
ditambahkan pereaksi Lieberman-Bouchard (campuran asam asetat anhidrat dan
asam sulfat pekat (2:1)). Hasil positif ditandai dengan terbentuknya warna merah
hijau atau violet biru.
3.4.3.6 Antrakuinon
a. Sebanyak 20 mg ekstrak kental dilarutkan dengan 5 mL asam sulfat 2N,
dipanaskan sebentar kemudian didinginkan.
b. Ditambahkan 10 mL benzen P, lalu kocok, kemudian didiamkan.
c. Lapisan benzen dipisahkan, kemudian disaring. Filtrat berwarna kuning
menunjukkan adanya antrakuinon.
d. Lapisan benzen dikocok dengan 1 mL - 2 mL NaOH 2N, diamkan. Akan
terbentuk lapisan air berwarna merah intensif dan lapisan benzen tidak
berwarna.
3.4.3.7 Glikosida
a. Sebanyak 300 mg ekstrak kental ditambahkan 3 mL HCl 10%. Selanjutnya,
dipanaskan hingga mendidih, dinginkan kemudian saring.
b. Filtrat dicuci dengan 10 mL eter, lakukan sebanyak 3 kali.
c. Filtrat dikumpulkan dan ditambahkan natrium sulfat anhidrat, kemudian
saring.
d. Pada larutan filtrat ditambahkan 2 mL metanol P dan larutan ini digunakan
sebagai larutan percobaan yang selanjutnya dilakukan dengan cara sebagai
berikut :
36
- Larutan percobaan sebanyak 1 mL hingga kering , sisanya ditambahkan 20

tetes asam asetat anhidrat P dan 1 tetes asam sulfat P. Hasil positif terbentuknya
warna biru atau hijau.
- Larutan percobaan sebanyak 1 mL diuapkan hingga kering, sisanya dilarutkan
dengan 2 mL air dan 5 tetes molish LP. Kemudian ditambahkan dengan hati-
hati 2 mL asam sulfat P. Hasil positif terbentuknya cincin berwarna ungu pada
batas cairan.
3.4.4 Uji Penghambatan Enzim Arginase secara In Vitro

Metode uji penghambatan enzim arginase pada ekstrak n-heksana, etil
asetat, dan metanol Caesalpinia ferrea mengacu pada penelitian yang telah
dilakukan oleh Noviani (2015).
3.4.4.1 Penyiapan Bahan Kimia

Bahan kimia yang disiapkan adalah larutan dapar mangan (II) maleat 50
mM (pH 7,0), larutan induk substrat L-arginin 10 mM dan 2000 mM (pH 9,5),
larutan induk enzim arginase, larutan induk sampel, dan campuran reagen A dan B
dari kit kadar urea.
a. Pembuatan larutan dapar mangan (II) maleat 50 mM (pH 7,0)
Larutan dapar mangan (II) maleat 50 mM (pH 7,0) disiapkan dari 2
komponen yang terpisah yaitu larutan mangan sulfat 100 mM dan larutan asam
maleat 125 mM (pH 8,0).
1) Larutan mangan sulfat 100 mM
Larutan mangan sulfat dibuat dengan melarutkan 1,69 g mangan sulfat
monohidrat (BM mangan sulfat = 151,02 g/mol, BM mangan sulfat monohidrat =
169,02 g/mol) dalam aqua bidestilata hingga volume 100 mL.
2) Larutan asam maleat 125 mM (pH 8,0)
Larutan asam maleat dibuat dengan melarutkan 1,16 g asam maleat (BM
= 116,07 g/mol) dalam aqua bidestilata hingga volume 80 mL. pH-nya disesuaikan
hingga 8,0 menggunakan NaOH 2 M.
37
Kedua larutan tersebut dicampurkan kemudian disesuaikan pH-nya hingga

7,0 menggunakan HCl 0,1 M. Setelah itu, larutan diencerkan hingga volume akhir
200 mL.
b. Pembuatan larutan induk substrat L-arginin (pH 9,5)

Larutan induk substrat L-arginin (pH 9,5) dibuat dengan konsentrasi 10
mM dan 2000 mM (untuk optimasi konsentrasi substrat bagian I dan II).
1) Pembuatan larutan induk substrat L-arginin 10 mM (pH 9,5)
Larutan substrat dibuat dengan cara melarutkan 87,1 mg L-arginin (BM =
174,2 g/mol) dalam 40 mL aqua bidestilata kemudian disesuaikan pH-nya hingga
9,5 menggunakan HCl 5 M. Kemudian ditambahkan aqua bidestilata hingga
volume 50 mL sehingga diperoleh konsentrasi substrat 10 mM. Larutan substrat 10
mM tersebut kemudian diencerkan hingga mencapai konsentrasi 1, 3, 5, 7 mM.
2) Pembuatan larutan induk substrat L-arginin 2000 mM (pH 9,5)
Larutan substrat dibuat dengan cara melarutkan 17,42 g L-arginin (BM =
174,2 g/mol) dalam 40 mL aqua bidestilata kemudian disesuaikan pH-nya hingga
9,5 menggunakan HCl 5 M. Arginin akan terlarut dengan penambahan HCl.
Kemudian ditambahkan aqua bidestilata hingga volume 50 mL sehingga diperoleh
konsentrasi substrat 2000 mM. Larutan 2000 mM tersebut kemudian diencerkan
hingga mencapai seri konsentrasi 100, 300, 570, 800, 1200 mM dan seri konsentrasi
70, 100, 130, 160, 200, 300 mM.
c. Pembuatan larutan induk enzim arginase

Larutan induk enzim arginase dibuat dengan melarutkan 0,4 mg serbuk
enzim (kandungan protein dalam serbuk enzim = 88% dan kandungan enzim dalam
protein = 119 U/mg protein) ke dalam 838 µL dapar mangan (II) maleat sehingga
diperoleh konsentrasi enzim 50 U/mL yang kemudian diaktivasi dengan inkubasi
pada 37º C selama 4 jam. Larutan enzim tersebut diencerkan hingga mencapai
konsenttrasi 0,1 U/mL dan 1 U/mL.
38
d. Pembuatan larutan induk sampel

Larutan induk sampel dibuat dengan melarutkan 1 - 10 mg sampel ekstrak,
kemudian melarutkannya dalam DMSO (Dimetilsulfoksida) sehingga didapat
larutan induk sampel 10.000 µg/mL.
e. Penyiapan campuran reagen A dan B dari kit uji kadar urea

Reagen A dan reagen B dari kit uji kadar urea dikeluarkan dari penyimpanan
di lemari es dan didiamkan suhunya mencapai suhu ruang. Pencampuran dilakukan
sesaat sebelum digunakan. Reagen A dan reagen B dicampurkan dalam volume
yang sama (1:1). Campuran reagen A dan B ini harus digunakan dalam waktu tidak
lebih dari 20 menit setelah dicampurkan.
3.4.4.2 Uji Pendahuluan Optimasi Konsentrasi Substrat dan Enzim

Uji pendahuluan optimasi konsentrasi substrat dan enzim terdiri dari
optimasi konsentrasi substrat (bagian I), optimasi konsentrasi substrat (bagian II),
dan optimasi konsentrasi substrat dengan konsentrasi enzim yang ditingkatkan.
a. Optimasi Konsentrasi Substrat (Bagian I)
Proses optimasi ini menggunakan prosedur yang sama dengan prosedur uji
enzim dari produsen. Perbedaan terletak pada pemilihan variasi konsentrasi substrat
yang berdasar pada perhitungan secara teoritis reaksi yang terjadi.
Sebanyak 15 µL aqua bidestilata, 15 µL larutan enzim arginase 0,1 U/mL,
dan 20 µL larutan substrat L-arginin (konsentrasi 1, 3, 5, 7, 10 mM dari larutan
induk substrat L-arginin 10 mM) dimasukkan ke dalam masing-masing sumuran
pada microplate 96 sumuran. Masing-masing konsentrasi substrat dibuat blanko
dimana larutan substrat L-arginin ditambahkan setelah penambahan campuran
reagen A dan B dari kit uji kadar urea. Campuran tersebut diinkubasi selama 30
menit pada suhu 37º C, kemudian ditambahkan 100 µL campuran reagen A dan B
dari kit uji kadar urea dan diinkubasi pada suhu ruang selama 60 menit. Serapan
diukur pada panjang gelombang 430 nm.
b. Optimasi Konsentrasi Substrat (Bagian II)
Proses optimasi ini menggunakan prosedur yang sama dengan prosedur uji
enzim dari produsen. Perbedaan terletak pada volume larutan substrat L-arginin
39
yang dicampurkan dalam sumuran. Konsentrasi pemilihan variasi konsentrasi

substrat yang berdasar pada konsentrasi substrat yang tertera pada prosedur uji
enzim dari produsen.
Sebanyak 15 µL aqua bidestilata, 15 µL larutan enzim arginase 0,1 U/mL,
dan 25 µL larutan substrat L-arginin (konsentrasi 100, 300, 570, 800, 1200 mM dari
larutan induk substrat L-arginin 2000 mM) dimasukkan ke dalam masing-masing
sumuran pada microplate 96 sumuran. Masing-masing konsentrasi substrat dibuat
blanko dimana larutan substrat L-arginin ditambahkan setelah penambahan
campuran reagen A dan B dari kit uji kadar urea. Campuran tersebut diinkubasi
selama 30 menit pada suhu 37º C, kemudian ditambahkan 100 µL campuran reagen
A dan B dari kit uji kadar urea dan diinkubasi pada suhu ruang selama 60 menit.
Serapan diukur pada panjang gelombang 430 nm.
c. Optimasi Konsentrasi Substrat dengan Konsentrasi Enzim yang Ditingkatkan

Proses optimasi ini merupakan pengembangan dari hasil optimasi
konsentrasi substrat bagian I dan II dengan meningkatkan konsentrasi enzim yang
digunakan (dari 0,1 U/mL menjadi 1 U/ mL).
Sebanyak 15 µL aqua bidestilata, 15 µL larutan enzim arginase 1 U/mL, dan
25 µL larutan substrat L-arginin (konsentrasi 100, 300, 570, 800, 1200 mM dari
larutan induk substrat L-arginin 2000 mM) dimasukkan ke dalam masing-masing
sumuran pada microplate 96 sumuran. Masing-masing konsentrasi substrat dibuat
blanko dimana larutan substrat L-arginin ditambahkan setelah penambahan
campuran reagen A dan B dari kit uji kadar urea. Campuran tersebut diinkubasi
selama 30 menit pada suhu 37º C, kemudian ditambahkan 100 µL campuran reagen
A dan B dari kit uji kadar urea dan diinkubasi pada suhu ruang selama 60 menit.

Kontrol Positif
a. Pembuatan larutan nor-NOHA sebagai kontrol positif
Larutan nor-NOHA (N-hidroksi-nor- L-arginin) dibuat dengan melarutkan
10 mg nor-NOHA dalam 2,5 mL DMSO sehingga didapat konsentrasi larutan induk
40
4.000 µg/mL. Larutan induk tersebut diencerkan dengan dapar fosfat ph 7,2 saat
akan digunakan menjadi konsentrasi 1,5; 3,0; 5; 10; dan 15 µg/mL (konsentrasi
akhir nor-NOHA dalam reaksi adalah 0,3; 0,6; 1; 2; dan 3 µg/mL.
b. Pengujian larutan nor-NOHA sebagai kontrol positif

Sebanyak 15 µL larutan enzim arginase 1 U/ml, 25 µL larutan substrat L-
arginin 130 mM, dan 10 µL larutan nor-NOHA (konsentrasi 1,5; 3,0; 5; 10; dan 15
µg/mL) dimasukkan ke dalam masing-masing sumuran pada microplate 96
sumuran. Masing-masing konsentrasi substrat dibuat blanko dimana larutan
substrat L-arginin ditambahkan setelah penambahan campuran reagen A dan B dari
kit uji kadar urea. Campuran tersebut diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37º C,
kemudian ditambahkan dengan 100 µL campuran reagen A dan B dari kit uji kadar
urea dan diunkubasi pada suhu ruang selama 60 menit. Serapan diukur pada panjang
gelombang 430 nm.

Sampel Uji
Untuk skrining awal aktivitas penghambatan dari ekstrak, larutan induk
sampel uji diencerkan dengan aqua bidestilata hingga konsentrasi 500 µg/mL
(konsentrasi akhir sampel uji pada reaksi adalah 100 µg/mL).
41
Tabel 3.1 Prosedur uji aktivitas penghambatan enzim arginase

Reagen Volume (µL)
Blanko Kontrol Blanko Sampel
kontrol sampel
Sampel (ekstrak,
standar nor-NOHA) - - 10 10
Aqua bidestilata 10 10 - -
Enzim Arginase 1 15 15 15 15
U/mL
Larutan Substrat L- - 25 - 25
Arginin 130 mM
Jumlah volume reaksi 25 50 25 50
Inkubasi suhu 37º C selama 30 menit

Campuran reagen A 100 100 100 100
dan B dari Kit
Uji Kadar Urea
Larutan Substrat L- 25 - 25 -
Arginin 130 mM
Jumlah volume reaksi 150 150 150 150
akhir
Inkubasi pada suhu ruang selama 60 menit

Ukur panjang gelombang pada 430 nm
42
Sebanyak 10 µL sampel uji, 15 µL larutan enzim, dan 25 µL larutan L-

arginin dimasukkan ke dalam sumuran. Masing-masing sampel uji dibuat blanko
dimana larutan subatrat L-arginin ditambahkan setelah penambahan campuran
reagen A dan B dari kit uji kadar urea. Campuran tersebut diinkubasi selama 30
menit pada suhu 37º C, kemudian ditambahkan dengan 100 µL campuran reagen A
dan B dari kit uji kadar urea dan diinkubasi pada suhu ruang selama 60 menit.
3.4.4.5 Perhitungan Persentase Penghambatan (% Inhibisi) dan Inhibition

Concentration 50 (IC50)
Uji penghambatan arginase ditentukan dengan mengukur serapan
menggunakan prinsip spektrofotometri pada microplate reader pada panjang
gelombang 430 nm. Persentase penghambatan enzim arginase dapat dihitung
dengan rumus sebagai berikut:
% penghambatan arginase = (B-S) / B x 100%
Keterangan :
B = serapan kontrol dikurangi serapan blanko kontrol
S = serapan sampel dikurangi serapan blanko sampel
Untuk menentukan IC50 digunakan sampel dengan beberapa variasi
konsentrasi. IC50 dihitung dengan menggunakan persamaan regresi linier,
konsentrasi sampel atau logaritma konsentrasi sampel sebagai sumbu x dan persen
penghambatan sebagai sumbu y. Dari persamaan y = a + bx dapat dihitung nilai
IC50.
3.4.4.6 Penentuan Kinetika Penghambatan Enzim Arginase

Inhibisi sampel uji ditentukan dengan cara membuat kurva Lineweaver-
Burk dari data reaksi inhibisi antara beberapa konsentrasi substrat dengan arginase
yang diperoleh dan membandingkannya dengan kurva Lineweaver-Burk tentang
pengaruh inhibitor terhadap laju reaksi.
BAB 4
RENCANA PENELITIAN
Tabel 4.1 Tabel Rencana Penelitian

Kegiatan penelitian Desember Januari Februari Maret April Mei
Tahap I : Persiapan
1.1 Mengurus surat peminjaman
laboratorium Farmakognosi-
Fitokimia UI
1.2 Pembelian bahan-bahan yang
diperlukan
Tahap II : Penelitian
2.1 Penguapan pelarut ekstraksi
2.2 Ekstraksi simplisia
2.3 Identifikasi senyawa
2.4 Optimasi uji enzim
2.5 Uji enzim
2.6 Pengukuran pengujian
Tahap III : Pengolahan Data
3.1 Pengumpulan dan input data
3.2 Analisis data
Tahap IV : Penulisan Laporan Akhir Kegiatan
4.1 Penulisan laporan akhir
4.2 Finalisasi laporan akhir
43
44
DAFTAR ACUAN
AHA. (2011). Heart-Health Screenings. American Heart Association. Available

from : http : //www.heart.org/HEARTORG/Conditions/Heart-Health
Screenings_UCM_428687_Article.jsp.
Araujo, AA., et al. (2014). Quantification of polyphenols and evaluation of
antimicrobial, analgesic and anti-inflammatory activities of aqueous and
acetone–water extracts of Libidibia ferrea, Parapiptadenia rigida and
Psidium guajava. J. Ethnopharmacol, 156, 88-96.
Ash, DE., Cox, JD., Christianson, DW. (2000). Arginase: a binuclear manganese
metalloenzyme. Met Ions Biol Syst, 37, 407–428.
Bacchi, EM., Sertie, JAA. (1994). Antiulcer action of Styrax camporum and
Caesalpinia ferrea in rats. Planta Med, 60, 118-120.
Bachi, EM., Sertie, JAA., Villa N., Katzbraga, H. (1995). Antiulcer action and
toxicity of Styrax camporum and Caesalpinia ferrea. Planta Med. 61, 204–
207.
Bariani A., et al. (2012). Partial purification of trypsin inhibitors from Caesalpinia
ferrea and Swartzia polyphylla seeds and effect of protein extracts on
pathogenic fungi. Summa Phytopathol, 38(2), 131-138.
Buga, GM., et al. (1996). Arginase activity in endothelial cells: inhibition by NG-
hydroxyarginine during high output nitric oxide production. Am. J.
Physiol. 271, 1988–1998.
Carvalho, AA., Menezes, IAC., Antoniolli, AR., Santos, MRV. (2010). Effect of
the Chronic Treatment with Aqueous Extract of Caesalpinia ferrea and
Chrysobalanus icacoon the Vascular Reactivity of Diabetic Rats. Lat. Am.
J. Pharm, 29(5), 845-848.
Carvalho, JC., et al. (1996). Preliminary studies of analgesic and antiinflammatory
properties of Caesalpinia ferrea crude extract. J. Ethnopharmacol, 53,
175-178.
Cavalheiro, MG., et al. (2009). Biological and enzymatic activities of aqueous
extract of seeds from Caesalpinia ferrea Mart., Leguminosae. Rev. Bras.
Farmacogn, 19(2B), 586-591.
45
Departemen Kesehatan RI. (1995). Materia Medika Indonesia Jilid VI. Jakarta :
Departemen Kesehatan RI
Dias, AMA., et al. (2013). Wound dressings loaded with an antiinflammatory jucá
(Libidibia ferrea) extract using supercritical carbon dioxide technology. J.
Supercrit Fluids, 74, 34-45.
Ditjen POM. (2000). Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat. Jakarta :
Departemen Kesehatan RI
Durante, W., Liao L., Peyton KJ., and Schafer AI. (1997). Lysophosphatidyl
choline regulates cationic amino acid transport and metabolism in vascular
smooth muscle cells: role in polyamine synthesis. J. Biol. Chem. 272,
30154–30159.
Durante, W., Liao L, Reyna SV., Peyton KJ., and Schafer AI. (2000). Physiologic
cyclic stretch directs L- arginine transport and metabolism to collagen
synthesis in vascular smooth muscle cells. FASEBJ. 14, 1775–1783.
Durante, W., Liao L., Iftikhar I., Cheng K., and Schafer AI. (1996). Platele derived
growth factor regulates vascular smooth muscle cell proliferation by
inducing cationic amino acid transporter gene expression in cultured
vascular smooth muscle cells. J. Biol.Chem. 271, 11838–11843.
Durante, W. (2001). Regulation of L-arginine transport and metabolism in vascular
smooth muscle cells. Cell Biochem. Biophys. 35, 19–34.
Durante, W. (2013). Role of arginase in vessel wall remodeling. Frontiers in
Immunology 4, 1-12.
Durante,W., Liao L., Reyna SV., Peyton, KJ, and Schafer, AI. (2001).
Transforming growth factor- b1 stimulates L-arginine transport and
metabolism in vascular smooth muscle cells : role in polyamine and
collagen synthesis. Circulation 103, 1121–1127.
Durante,W., Liao L., Peyton KJ., and Schafer, AI. (1998). Thrombin stimulates
vascular smooth muscle cell polyamine synthesis by inducing cationic
amino acid transporter and ornithine decarboxylase gene expression. Circ.
Res. 83, 217–223.
46
Ferreira, MRA., Soarez, LAL. (2015). Libidibia ferrea (Mart. Ex Tul.) L.P.
Queiroz: A review of the biological activities and phytochemical
composition. J. Med. Plants Res, 9(20), 140-150.
Ferreira, MRA., et al. (2013). Antifungal activity of medicinal plants from
Northeastern Brazil. J. Med. Plants Res, 7(40), 3008-3013.
Forstermann, U., and Sessa, WC. (2012). Nitric oxide synthases: regulation and
function. Eur. Heart J, 33, 829–837.
Gallao, MI., et al. (2013). Morphological, chemical and rheological properties of
the main seed polysaccharide from Caesalpinia ferrea Mart. Ind. Crop.
Prod, 47, 58-62.
Harborne, JB. (1987). Metode Fitokimia, Penuntun Cara Modern Mengekstraksi
Tumbuhan (Padmawinata, K : Penerjemah). Bandung : Penerbit ITB.
Harmita. (2006). Buku Ajar Analisis Fitokimia. Depok : Departemen Farmasi
FMIPA Universitas Indonesia.
Hecker, M., Sessa,WC., Harris, HJ., Angard, EE., and Vane, JR. (1990). The
metabolism of L-arginine and its significance for the biosynthesis of
endothelium derived relaxing factor : cultured endothelialcells recycle L-
citrulline to L-arginine. Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 87, 8612–8616.
Herbert RD. (1989) The Biosynthesis of Secondary Metabolites, 2nd ed, Chapman-
Hall, London.
Hibbs, JBJ., Taintor, RR., Vavrin, Z., and Rachlin, EM. (1988). Nitricoxide : a
cytotoxic activated macrophage effector molecule.
Biochem.Biophys.Res.Com- mun. 157, 87–94.
Hull, Allison. (1993). Penyakit Jantung, Hipertensi, dan Nutrisi. Jakarta : PT Bumi
Aksara.
Igor, AC., et al. (2007). Cardiovascular effects of the aqueous extract from
Caesalpinia ferrea : Involvement of ATP-sensitive potassium channels.
Vascular Pharmacology, 47, 41–47.
Inada, A., et al .(2003). Cancer Chemopreventive Activity of 2-(2,3,6-trihydroxy-
4-carboxyphenyl) ellagic Acid from the fruits of Caesalpinia ferrea. Nat.
Med. 57(5):192-195.
47
Integrated Taxonomic Information System (ITIS). (2011). Caesalpinia ferrea. 9

Oktober 2016. http://www.itis.gov.
Khallou-Laschet, et al. (2010). Macrophage plasticity in experimental
atherosclerosis. Plo SONE 5: e8852. Doi :10.1371/journal.pone.0008852
Lerman, A., and Zeiher, AM. (2005). Endothelial function: cardiac events.
Circulation, 111, 363–368.
Libby, P. (2002). Inflammation in atherosclerosis. Nature, 420, 868–874.
Libby P. (2005). Prevention and treatment of atherosclerosis in Harrison’s
Principles of Internal Medicine (16th Ed) Vol II. New York: The McGraw-
Hill Companies US, 1430 –1440.
Lima, SMA., et al. (2012). Anti-inflammatory and analgesic potential of
Caesalpinia ferrea. Rev. Bras. Farmacogn, 22(1), 169-175.
Lopes, N., et al. (2013). Sulfated polysaccharide of Caesalpinia ferrea inhibits
herpes simplex virus and poliovirus. Int. J. Biol. Macromol, 60, 93-99.
Mantovani, A., Garlanda, C., and Locati, M. (2009). Macrophage diversity and
polarization in atherosclerosis: a question of balance. Arterioscler.
Thromb.Vasc.Biol, 29, 1419–1423.
Martins, M., et al. (2014). Inhibition of growth and aflatoxin production of
Aspergillus parasiticus by guarana (Paullinia cupana Kunth) and juca
(Libidibia ferrea Mart) extracts. Afr. J. Biotech, 13(1), 131-137.
Menezes, IAC., Moreira, IJA., Carvalho, AA., Antoniolli, AR., Santos, MRV.
(2007). Cardiovascular effects of the aqueous extract from Caesalpinia
ferrea: Involvement of ATP-sensitive potassium channels. Vasc.
Pharmacol, 47, 41-47.
Ming, XF., et al. (2012). Arginase II promotes macrophage inflammatory responses
through mitochondrial reactive oxygen species, contributing to insulin
resistance and atherogenesis. J. Am.Heart Assoc, 1, 992.
Morris, SMJ. (2005). Arginine metabolism in vascular biology and disease. Vasc
Med, 10 (l1), 83–87.
Morrison, RF., and Seidel, ER. (1995). Vascular endothelial cell proliferation :
regulation of cellular polyamines. Cardiovasc.Res, 29, 841–847.
48
Murray, Robert K, Granner, Daryl K, dan Victor W. Rodwell. (2006). Harper’s

Illustrated Biochemistry (27th ed). New York: McGraw-Hill. Nutrients, 5,
3163-3183.
Nakamura, ES., et al. (2002). Cancer chemopreventive effects of a Brazilian folk
medicine, Juca, on in vivo two-stage skin carcinogenesis. J.
Ethnopharmacol, 81, 135–137.
Nozaki, H., et al. (2007). Pauferrol A, a novel chalcone trimer with a cyclobutane
ring from Caesalpinia ferrea mart exhibiting DNA topoisomerase II
inhibition and apoptosis-inducing activity. Tetrahedron Lett, 48, 8290-
8292.
Noviani, Arikadia.(2015). Isolasi dan Identifikasi Senyawa dari Caesalpinia
sappan L. Lignum (Kayu Secang) dengan Aktivitas Penghambatan
terhadap Enzim Arginase. Tesis Program Magister Ilmu Kefarmasian
Universitas Indonesia.
Ohira, S., et al. (2013). New chalcone dimers from Caesalpinia ferrea Mart act as
potent inhibitors of DNA topoisomerase II. Tetrahedron Lett, 54, 5052-
5055.
Palmer, RMJ., Ashton, DS., and Moncada, S. (1988). Vascular endothelial cells
synthesize nitric oxide from L-arginine. Nature, 333, 664–666.
Pernow J, Jung C. (2013). Arginase as a potential target in the treatment of
cardiovascular disease: reversal of arginine steal?. Cardiovascular
Research 98, 334-343
Port's PS, Chisté RC, Godoy HT, Prado MA. (2013). The phenolic compounds and
the antioxidant potential of infusion of herbs from the Brazilian
Amazonian region. Food Res. Intern. 53:875-881.
Pratanu, S. (1995). Regresi aterosklerosis. Cermin Dunia Kedokteran Hal 14 – 18
Regunathan, S., Youngson, C., Raasch, W., Wang, H., and Reis, DJ. (1996).
Imidazoline receptors and agmatine in blood vessels : a novel system
inhibiting vascular smooth muscle cell proliferation. J. Pharmacol.Exp.
Ther, 276, 1272–1282.
Ryoo, SG., et al. (2008). Endothelial arginase II. A novel target for the treatmen to
atherosclerosis. Circ. Res, 102, 923–932.
49
Sampaio, FC., et al. (2009). In vitro antimicrobial activity of Caesalpinia ferrea

Martius fruits against oral pathogens. J. Ethnopharmacol, 124, 289-294.
Sawada, LA., et al. (2014). Libidibia ferrea mature seeds promote antinociceptive
effect by peripheral and central pathway: possible involvement of Opioid
and Cholinergic receptors. BioMed. Res. Intern, 508, 725.
Sharma, R. (2012). Enzyme inhibition: Mechanisms and Scope. Enzyme Inhibition
and Bioapplications, 1-36, http://www.intechopen.com.
Shemyakin, A., et al. (2012). Arginase inhibition improves endothelial function in
patients with coronary artery disease and type 2 diabetes. Circula- tion,
126, 2943–2950.
Shibata, N., and Glass, CK. (2009). Regulation of macrophage function in
inflammation and atherosclerosis. J. Lipid Res, 50, 277–281.
Silva, FA., et al. (2014). Arbuscular mycorrhizal fungi increase gallic acid
production in leaves of field grown Libidibia ferrea (Mart. ex Tul.) L. P.
Queiroz. J. Med. Plants Res. 8(36):1110-1115.
Silva, LCN., et al. (2011). Comparative analysis of the antioxidant and DNA
protection capacities of Anadenanthera colubrina, Libidibia ferrea and
Pityrocarpa moniliformis fruits. Food Chem. Toxicol, 49:2222-2228.
Silva, LCN., et al. (2013). Evaluation of combinatory effects of Anadenanthera
colubrina, Libidibia ferrea and Pityrocarpa moniliformis fruits extracts
and erythromycin against Staphylococcus aureus. J. Med. Plants Res,
7(32), 2358-2364.
Sloop, GD., et al. (1999). Atherosclerosis an inflamatory disease. The New England
Journal of Medicine, 340 (24), 1928-1929.
Souza, CF., Lucyszyn N., Ferraz, FA., Sierakowski, MR. (2010). Caesalpinia
ferrea var. ferrea seeds as a new source of partially substituted
galactomannan. Carbohydr. Pol, 82, 641-647.
Tabor, CW., and Tabor, H. (1984). Polyamines. Annu.Rev.Biochem. 53, 749–790.
Ueda, H., Kawanishi K., Moriyasu M. (2004). Effects of Ellagic Acid and 2-(2,3,6-
Trihydroxy-4-carboxyphenyl) ellagic Acid on Sorbitol Accumulation in
Vitro and in Vivo. Biol. Pharm. Bull, 27(10), 1584-1587.
50
Ueda, H., Tachibana Y., Moriyasu M., Kawanishi K., Alves, SM. (2002). Aldose
reductase inhibitors from the fruits of Caesalpinia ferrea Mart.
Phytomedicine, 8(5), 377-381.
Vaisman, BL., et al. (2012). Selective endothelial over expression of arginase II
induces endothelial dysfunction and hypertension and enhances
atherosclerosis in mice. Plo SONE 7 : e39487. Doi :
10.1371/journal.pone.0039487
Vasconcelos, CFB., et al. (2011). Hypoglycaemic activity and molecular
mechanisms of Caesalpinia ferrea Martius bark extract on streptozotocin-
induced diabetes in Wistar rats. J. Ethnopharmacol, 137, 1533-1541.

Caesalpinia Ferrea

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Judul Asli

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

Caesalpinia Ferrea

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

USULAN PENELITIAN

PENAPISAN FITOKIMIA DAN UJI PENGHAMBATAN ENZIM

PENAPISAN FITOKIMIA DAN UJI PENGHAMBATAN ENZIM

Diajukan sebagai salah satu syarat untuk mengikuti seminar proposal

Usulan ini diajukan oleh

Nama : Devi Indriani

Program Studi : Sarjana Farmasi

pada Ekstrak Kulit Batang Caesalpinia ferrea C. Mart

Pembimbing I : Prof. Dr. Dra. Berna Elya, Apt., M.Si ( )

Pembimbing II : Arikadia Noviani, M. Farm., Apt ( )

Halaman Judul ........................................................................................................................ i

BAB 1 PENDAHULUAN ..................................................................................................... 1

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA ........................................................................................... 4

BAB 4 RENCANA PENELITIAN .......................................................................... 43

Gambar 2.1 (1. Batang; 2. Pohon; 3. Cabang; 4. Ranting; 5. Buah; 6. Biji)

Tabel 2.1 Senyawa-senyawa yang tedapat pada Caesalpinia ferrea ...................................... 7

1.1 Latar Belakang

1.2 Rumusan Masalah

1.3 Jenis Penelitian dan Metode yang digunakan

1.4 Tujuan Penelitian

1.5 Hipotesis Penelitian

2.1 Caesalpinia ferrea

2.1.2 Deskrisi Tanaman

[Sumber : Journal of Medicinal Plant Research Volume 9 Number 5, 2015]

2.1.3 Kandungan Kimia

Tabel 2.1 Senyawa-senyawa yang terdapat pada Caesalpinia ferrea

[Sumber : Journal of Medicinal Plant Research Volume 9 Number 5, 2015]

2.1.4 Aktivitas Biologis Caesalpinia ferrea

b. Anti-inflamasi, analgesik dan efek antinosiseptive

Penelitian terhadap buah C. ferrea juga telah dilakukan dengan metode

c. Antimikroba dan aktivitas antijamur

efek antijamur pada ekstrak etanol menunjukkan aktivitas terhadap Aspergillus

450 mg/kgBB/hari CE kulit batang C. ferrea memperlihatkan penurunan kadar

g. Aktivitas biologis lainnya

menunjukkan aktivitas penghambatan terhadap topoisomerase II dan proliferasi sel

2.2.2 Metode Ekstraksi

2.3 Penapisan Fitokimia dan Identifikasi Senyawa

2.3.2 Identifikasi Senyawa

menurunkan tegangan permukaan dan pada konsentrasi rendah dapat menyebabkan

2.4.2 Klasifikasi Enzim

d. Liase adalah enzim yang mengatalisis reaksi pembentukan atau pemecahan

2.4.3 Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Laju Enzim

substrat karena jumlah substrat telah melampaui konsentrasi enzim (Murray,

2.4.4 Kinetika Enzim

[Sumber : Murray, Granner dan Rodwell, 2006]

diilustrasikan dengan mengevaluasi persamaan Michaelis-Menten dalam tiga

Vmaks dan Km bernilai konstan, maka Vi = k(S).

Maka V1 = separuh Vmaks, sehingga Km dapat ditentukan secara

[Sumber : Murray, Granner dan Rodwell, 2006]

2.4.5 Tipe Penghambatan Enzim

[Sumber : Murray, Granner dan Rodwell, 2006]

[Sumber : Murray, Granner dan Rodwell, 2006]

[Sumber : Murray, Granner dan Rodwell, 2006]

2.5 Enzim Arginase

dan urea. Arginase merupakan metalloenzyme mangan yang menghidrolisis L-

2.5.2 Metabolisme L-Arginin oleh Sel Vaskular

poliamina berturut-turut, spermine, dan spermidine (Tabor dan Tabor, 1984).

[Sumber : Durante, William, 2013]

[Sumber : Pernow, John, et.al., 2013]

2.5.3 Kaitan Enzim Arginase dan Aterosklerosis

endotel sangat signifikan. Penghambatan arginase II meningkatkan produksi NO

2.5.4 Inhibitor Enzim Arginase

[Sumber : Cardiovascular Research (2013) 98, 334–343]