TEKNIK EVALUASI BIOAKTIVITAS

ANTIBAKTERI
KELOMPOK 1
M. Isnain Ramatdani
Debby novrioza Isra Afriani
Dita Heriani Lily Suryani

Dosen : Rahayu Utami, Msc, Apt

PROGRAM STUDI S1 FARMASI

SEKOLAH TINGGI ILMU FARMASI RIAU YAYASAN UNIVERSITAS RIAU
PEKANBARU
2015
 Menurut Madigan dkk. (2000), berdasarkan sifat
AntiBakteri toksisitas selektifnya
senyawa
antimikrobia mempunyai 3 macam efek terhadap
pertumbuhan mikrobia yaitu:
senyawa-senyawa kimia alami yang
dalam kadar rendah dapat Bakteriostatik
menghambat pertumbuhan bakteri. memberikan efek dengan cara
menghambat pertumbuhan tetapi tidak
membunuh. Senyawa bakterostatik
seringkali menghambat sintesis protein
atau mengikat ribosom.
Bakteriosidal
memberikan efek dengan cara
membunuh sel tetapi tidak terjadi lisis
sel atau pecah sel.

Bakteriolitik
menyebabkan sel menjadi lisis atau
pecah sel sehingga jumlah sel
berkurang
 Mekanisme Kerja Bahan Faktor-faktor Berpengaruh Dalam
Antibakteri Aktivitas Senyawa Anti Bakteri

a) pH

Menghambat b) Suhu stabilitas

sintesis dinding senyawa
sel bakteri
tersebut
c) jumlah bakteri
yang ada
Mengganggu d) lamanya
permeabilitas
membran sel inkubasi
bakteri e) dan aktivitas
Menghambat metabolisme
Menghambat
sintesis atau
sintesis
merusak bakteri
protein sel
asam nukleat
bakteri
bakteri
 METODE DIFUSI

disc
diffusion

Cup plate
E-test
technique

Gradient-
Ditch-plate
plate
technique
technique
 • Pada metode ini digunakan strip plastic yang mengandung agen
antimikroba dari kadar rendah hingga tertinggi dan diletakkan pada
E-test permukaan media agar yang telah ditanami mikroorganisme

• Pada metode ini sampel uji berupa agen antimikroba yang diletakkan
pada parit cawan petri pada bagian tengah secara membujur dan
Ditch- mikroba uji maksimum 6 macam) digoreskan kearah parit yang berisi
plate agen anti mikroba
technique

• Media agar dicairkan ditambahkan. Campuran kemudian dituang

kedalam cawan petri dan diletakkkan dalam posisi miring. Nutrisi
kedua dan antibiotic atau anti bakteri selanjutnya dituang diatasnya
Gradient- • Plate diinkubasi selama 24 jam untuk memungkinkan agen antimikroba
plate berdifusi membentuk gradien konsentrasi dan permukaan media
technique mengering. Mikroba digoreskan pada arah mulai dari konsentrasi tinggi
ke rendah.
Gradient-plate
E-test
technique
Cup plate technique PRINSIP

Dibuat sumur
pada media agar
yang telah
ditanami
mikroorganisme
dan pada sumur
tersebut diberi
agen antimikroba
yang akan diuji
 Metode disc diffusion (tes Kirby & bauer)
Prinsip
Metode ini untuk menentukan
aktivitas agen antibakteri. Piringan
yang berisi agen antibakteri diletakkan
pada media agar yang telah ditanami
bakteri yang akan berdifusi pada
media agar tersebut. Area jernih
mengindikasikan adanya hambatan
pertumbuhan bakteri oleh agen
antibakteri pada permukaan media
agar.
Sentivitas suatu organisme
terhadap suatu obat ditentukan
berdasarkan ukuran daerah jernih
itu, yang tentunya bergantung pada
variable-variabel seperti :
1. Kemampuan dan kecepatan
difusi antibiotic ke dalam
media, serta interaksi antibiotic
dengan organisme uji
2. Jumlah organisme yang
diinokulasi
3. Kecepatan pertumbuhan
organisme
4. Derajat sensitivitas
organisme terhadap antibiotic
 Alat bahan

• timbangan
• dispenser cakram-sensi atau
pinset
• pembakar Bunsen • Biakan bakteri (suspense
• kertas cakaram bakteri
• Autoklaf • Cakram uji sensitivitas
• tabung reaksi antibakteri
• jarum ose • Medium agar
• incubator
• lumpang dan alu
• cawan petri
Pembuatan Suspensi
Mikroba Uji Penanaman Inokulum

Sebanyak 0,3 ml suspensi mikroba

uji dimasukkan kedalam cawan
Petri. Sebanyak 15 ml media NA
(pada suhu 40°C) dimasukkan
kedalam cawan Petri untuk
bakteri. Dikocok sampai homogen
lalu dibiarkan memadat.
PEMBUATAN MEDIA
NUTRIEN AGAR (NA)
Prosedur Kirby-bauer
 Biarkan seluruh lempeng
biakan mengering selama 5
menit
Diameter hambatan diukur dengan menggunakan
jangka sorong dan tentukan konsentrasi hambat
minimum (KHM)
 Tabel 1. Klasifikasi Respon Hambatan Pertumbuhan
Mikroba
Sumber : CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute)

Respon
Diameter zona
hambatan MIC (µg/mL)
bening (mm)
pertumbuhan
Kuat ≤4 ≥ 20

Sedang 8-16 15-19

Lemah ≥ 32 ≤ 14
 Metode Bioautografi KELEBIHAN & KEKURANGAN

• Bioautografi Kelebihan:
• Dapat digunakan untuk
merupakan metode mengetahui aktivitas biologi
yang spesifik untuk dari antibakteri
mendeteksi adanya • Dapat mendeteksi antibiotik
yang belum diketahui
bercak pada • Hanya membutuhkan peralatan
kromatogram hasil sederhana
kromatografi lapis • Interpretasi hasilnya relatif
mudah dan akurat
tipis
• daerah hambatnya
ditandai dengan Kekurangan:
• Waktu yang lama
adanya bercak pada • Kurang efisien
kromatogram • Harus digunakan pembanding
deteksi bercak
 Prinsip Metode Bioautografi

Pada bioautografi agar

overlay,lempeng
KONTA kromatogram dilapisi dengan
K agar yang masih cair yang
sudah diinokulasi dengan
uji. Setelah agar
mengeras, lempeng
kromatogram diinkubasi dan
METODE diwarnai dengan tetrazolium
BIOAUT dye. Penghambatan dapat
OGRAFI dideteksi dengan
AGAR terbentuknya pita (band).
LANGSU
OVERL
NG
AY

Bioautografi langsung dilakukan dengan menyemprot lempeng

kromatogram mikroba uji dan diinkubasi. Zona hambat yang
terbentuk divisualisasikan dengan menyemprot lempeng kromatogram
dengan tetrazolium dye
OVERLAY
 METODE BIOAUTOGRAFI

ALAT BAHAN

-Plat KLT ukuran 7 x 5 -Ekstrak antimikroba

cm tumbuhan
• -Chamber (berupa gelas -Konsentrasi 25%,
ukur) 20%, 15%, 10%, 5%
• -Kertas saring -Bakteri Uji
-Pipa Kapiler (Escherichia coli)
• -Petri Dish -Medium Agar
-Pinset (Nutrient Agar)
-Lampu Spritus -Eluent (metanol : etil
-Sinar UV
asetat)
• -Inkubator
-Pensil
-Spidol
PROSEDURE PEMBUATAN PLAT KLT

1. Plat KLT ukuran 7 x 5 cm disiapkan dan di buat garis pada bagian atas dan
bawah sebesar 0.5 cm.
2. Plat KLT ditandai 3 titik pada garis bawah.

3. Chamber disiapkan dan dijenuhkan dengan eluent metanol:etil asetat (3:2).

4. Masukkan kertas saring untuk mengetahui eluent sudah jenuh sampai tanda
batas dan angkat kertas saring tersebut.

5. Plat KLT di masukkan ke dalam chamber yang telah jenuh dengan eluent tadi
6. Tunggu hingga proses elusi selesai, ditandai dengan eluent telah sampai pada
garis batas atas

7. Plat KLT diangkat dan dikeringanginkan

8. Amati di bawah lampu UV, tandai noda yang terbentuk
 Prosedur Uji aktivitas antibakteri dengan
metode bioautografi

Media disiapkan (panasi media) dan suspensi

mikroba di buat

Sediakan petri dish steril, masukkan 0.3 ml

bakteri uji (Escherichia coli). Tambahkan media
nutrient agar sampai menutupi bakteri uji. Lalu
homogenkan media dengan memutar petridish,
diputar 5 ke kanan dan 5 ke kiri. Biarkan hingga
mengeras

Plat KLT di tempel diatas media yang mengeras

tadi sambil agak di tekan, tunggu 30 menit. Di
lingkari noda dengan spidol.

Plat diangkat dan petri dish di inkubasi pada suhu

37℃ selama 18 – 24 jam
Amati dan catat pengamatan (diameter daerah
bening yang terbentuk)
 ANALISIS DATA

B
 Metode dilusi

Dilusi Cair

Dilusi
Mikrodilusi
Padat
PRINSIP

• metode ini serupa dengan metode dilui cair

namun menggunakan media padat (solid)
Dilusi keutungan metode ini yaitu satu konsentrasi
agen anti mikroba yang diuji dapat
padat digunakan untuk menguji beberapa mikroba
uji

• Selama pengujian, beberapa piring mikro diisi

dengan Bakteri. Berbagai konsentrasi antibiotik
dan bakteri yang akan diuji kemudian ditambahkan
ke piring. Piring tersebut kemudian ditempatkan
Mikro dalam inkubator dan dipanaskan pada 35 C selama
dilusi 16-20 jam. Setelah waktu yang diberikan, diperiksa
untuk pertumbuhan bakteri. Jika media menjadi
keruh atau lapisan sel yang terbentuk di bagian
bawah, maka pertumbuhan bakteri terjadi
Prinsip dilusi cair Metode dilusi

Prinsip dilusi padat

Metode ini serupa dengan metode

difusi cair namun menggunakan
media padat (solid). Keuntungan
metode ini adalah satu konsentrasi
agen antibakteri yang diuji dapat
digunakan untuk menguji beberapa
bakteri uji.
 ALAT & BAHAN

ALAT
Alat : Bahan :
- Gelas beker 100 - Media Cair
ml, 250 ml - Bakteri
- Pipet tetes - Aquades
- Spiritus
- Tabung reaksi

BAHAN
PROSEDURE DILUSI CAIR

Disiapkan 7 buah tabung reaksi ( 2

tabung untuk kontrol dan 5 tabung
untuk perlakuan )

Dilakukan pengenceran larutan

streptomisin/penisilin dengan
menggunakan media TSB/NB sebagai
pengencer.
Dibuat seri pengenceran 400 µg / ml,
200 µg / ml, 100 µg/ ml, 50 µg/ ml, dan
25 µg/ ml dengan volume akhir dalam
tabung 2 ml.

Di inkulasikan setiap tabung (kecuali kontrol 1)

dengan menggunakan 0,1 ml biakan E.coli (24 jam ,
108 CFU/ml) diinkubasi selama 24 jam.
 Diamati tabung yang menunjukan
pertumbuhan yang dikocok. Apabila tabung
keruh (+) menunjukan pertumbuhan dan
apabila tabung jernih (-) tidak terjadi
pertumbuhanDilaporkan dihasil dalam
bentuk tabel

Dipindahkan satu mata ose biakan dari tabung jernih

kedalam media TSB dan media TSA yang baru.
Dinkubasi pada suhu 37 derajat C selama 24 jam

Diamati tabung yang menunjukan pertumbuhan

dengan di kocok. Apabila tabung keruh (+)
menunjukan pertumbuhan dan tabung jernih (-)
tidak ada pertumbuhan .Dilaporkan hasilnya
dalam bentuk tabel .

Ditentukan konsentrasi bahan kimia

yang bersifat bakteriostatik atau
bakterisidal.
Teknik Mikrodilusi

µ µ

µ
̊
ANALISI DATA

Difusi Data hasil uji antibakteri yang didapat dari hasil

pengukuran zona hambat dianalisis menggunakan
dan ANOVA satu arah dengan taraf kepercayaan 95%
yang kemudian dilanjutkan dengan analisis BNT.
Dilusi MIC dan MBC ditentukan dari hasil kadar
absorbansinya dimana kadar mencapai 90 % atau
lebih maka antibiotik memiliki MIC yang baik,
apabila <90 % antibiotik MIC nya tidak baik.

Untuk menentukan nilai MBC, adalah konsentrasi

terendah yang jumlah koloninya mendekati nol atau
99% dapat membunuh bakteri (mayer, 2010)

Nilai MICditentukan berdasarkan konsentrasi

ekstrak paling kecil yang menunjukkan adanya
penghambatan pertumbuhan bakteri (Doss et
all.,2009;Nazemiyeh et all., 2011)
RANGKUMAN METODE PENGUKURAN
PERTUMBUHAN MIKROORGANISME
METODE
Hitungan mikroskopik
Membaran atau filter molekuler Perhitungan mikroorganisme dalam susu, air,
Pengukuran kekeruhan
Penentuan nitrogen
Penetuan berat
Pengukuran aktivitas
biokimiawi
Teknik plating
PENERAPAN
perhitungan mikroorganisme dlm susu & vaksin
makanan, tanah, kultur dan lain”
Uji mikrobiologi, pendugaan hasil panen sel
dalam kaldu , kultur atau suspense berair
Pengukuran panen sel dri suspense kltur kental
utk digunakan pada penelitian mengenai
metabolisme
Pengukuran panen sel dri suspense kultur kental
untuk digunakan pada penelitian mengenai
metabolisme
Uji mikrobiologi
Perhitungan mikroorganisme dalam susu, air,
makanan, tanah, kultur dan lain”
TERIMAKASIH