ISOLASI DNA GENOM BAKTERI

LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI

Oleh :

Ena Milada Tri Handayani

NIM. 150210103097
Kelompok 1/Shift B

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGI

JURUSAN PENDIDIKAN MIPA
FAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN
UNIVERSITAS JEMBER
2018
 BAB 1. PENDAHULUAN

1.1 Latar belakang

DNA merupakan asam nukleat yang mengandung materi genetik yang berfungsi
untuk mengatur perkembangan biologis dari seluruh bentuk kehidupan secara
seluler. DNA biasnya terdapat di nukleus, mitokondria dan kloroplas. DNA dari
ketiga tempat tersebut memiliki perbedaan,perbedaan di antara ketiganya adalah
DNA nukleus berbentuk linear dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon,
sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi
dengan protein histon. Selain itu, DNA mitokondria dan kloroplas mempunyai
kekhasan yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis induk.
Pengenalan isolasi DNA merupakan suatu hal yang sangat penting, hal ini
mengingat bioteknologi pada akhir-akhir ini semakin maju dan berkembang secara
pesat. Terlebih untuk bidang biologi molekuler. Isolasi DNA pada dasarnya
memiliki bebrapa prinsip yang akan mendukung keberhasilan dari suatu isolasi.
Prinsip dari isolasi DNA yaitu untuk mendapatkan DNA murni yang tidak
tercampur dengan komponen sel lainnya seperti protein dan karbohidrat. Isolasi
DNA genom ini bisa dilakukan dengan metode lisis sel secara fisik dan kimia.
Secara fisik sel dipecah dengan kekuatan mekanik yaitu secara freeze thaw, bead
mill homogenization dan resonansi misalnya dengan sonikasi. Sedangkan secara
kimia sel dirusak dengan buffer lisis berisi senyawa kimia yang dapat merusak
integritas barrier dinding sel, misalnya SDS (Sodium Dedocyl Sulfate) dan CTAB
(Cetyltrimethylammonium bromide). Secara umum, isolasi DNA genom bakteri
terdiri atas tiga tahapan yaitu perusakan sel atau pemecahan sel, ekstraksi DNA, dan
purifikasi DNA. Proses pengeluaran DNA dengan cara diekstraksi atau dilisiskan
biasanya dilakukan dengan homogenasi dengan penambahan bufer ekstrasi atau
bufer lisis untuk mencegah rusaknya DNA.
1.2 Rumusan masalah
1.Apa saja fungsi dari masing-masing bahan yang digunakan?
2.Apa alasan menggunakan bakteri yang ada dalam praktikum ?
3.Bagaimana mekanisme isolasi DNA genom?
4.Mengapa bakteri yang digunakan dalam teknik freeze thaw hanya bakteri gram
negatif?
5.Apa alasan langkah desentrifus pada tahap awal yang diambil peletnya dan tahap
terakhir yang diambil supernatannya?
6.Apa fungsi dari loading dye?
1.3 Tujuan
1.Untuk mengetahui apa saja fungsi dar masing-masing bahan yang digunakan
2.Untuk mengetahui apa alasan menggunakan bakteri yang ada dalam praktikum
3.Untuk mengetahui bagaimana mekanisme isolasi DNA genom
4.Untuk mengetahui mengapa bakteri yang digunakan dalam teknik freeze thaw
hanya bakteri gram negatif
5.Untuk mengetahui apa alasan langkah desentrifus pada tahap awal yang diambil
peletnya dan tahap terakhir yang diambil supernatannya
6.Untuk mengetahui apa fungsi dari loading dye
 BAB 2. METODE PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat Praktikum

Praktikum ini di lakukan di lahan parkiran dosen gedung MIPA ruang
praktikum Mikrobiologi Universitas Jember pada :
Hari : Sabtu-Minggu
Tanggal : 19-20 Mei 2018
Waktu : 10.00-12.00

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat
1. Mikropipet
2. Eppendorf
3. Elektroforesis
4. UV Transluminator
5. Disentrifugator
6. Kompor
7. Rak untuk eppendorf
8. Labu Erlenmeyer
90. Cetakan gel untuk DNA
10. Penangas listrik
11. Stopwatch
12. Box es
13. Panci
14. Kulkas
3.2.2 Bahan
1. NA
2. NB
3. Bakteri E. coli
4. Bakteri Serratia marcescens
 5. DNA genom
6. Gel Agarose 1%
7. Buffer TAE (Tris Acetic EDTA)
8. EtBr (Ethidium Bromide)
9. Loading dye
10. PBS
11. Aquadest steril
12. Latex
13. Masker
14. Alat tulis
15. Alkohol 70%
16. Tissue
3.3 Langkah kerja
a. Hari pertama

Mengambil 1000 µl kultur cair bakteri

menggunakan mikropipet

Memasukkan kultur tersebut ke dalam eppendorf

kemuadian disentrifugasi selama 5 menit, 4oC ,
dan 10000 rpm

Mengambil pelet yang terbentuk setelah proses

sentrifugasi selesai
 Melakukan kegiatasn tersebut sebanyak 3 kali
ulangan

Pelet yang didapat kemudian dicuci

menggunakan PBS dan di sentrifugasi kembali

Menyimpan pelet yang didapatkan pada suhu -

20oC selama 24 jam

b. Hari kedua

Mengekstraksi DNA genome dengan

mendidihkan pelet beku selama 4 menit

Melarutkan pelet dengan 50 µl aquadest steril

Meresuspensi pelet dengan cara mikropipeting

Mensentrifugasi suspensi tersebut

Menambahkan 1 µl loading dye pada supernatan

Memasukkan campuran tadi pada sumuran gel

yang mengandung EtBr

Mengelektroforesis selama 40 menit pada 80V

dengan buffer TBE sebagai running buffer

Mencatat hasil elektroforesis yang tampak pada

UV transluminator
 BAB 3. HASIL DAN PEMBAHASAN

3.1 Hasil pengamatan

Kelompok Hasil

1,2,3 dan 4

3.2 Pembahasan

Praktikum kali ini merupakan praktikum mengenai isolasi DNA genom dari
bakteri. Isolasi DNA baik dari sel tanaman,hewan maupun mikroorganisme itu
dapat dipotong dengan suatu enzim. Semua organisme sebenarnya tersusun atas
elemen genetik yang sama yaitu DNA yang terdapat di dalam kromosom
(Nugroho&Dwi,2017). DNA sendiri merupakan suatu materi yang berisikan
informasi-informasi genetik secara turun temurun yang diwariskan oleh setiap
organisme kepada generasi selanjutnya (Buwono,dkk.,2018).

Literatur menyatakan bahwa Isolasi DNA merupakan salah satu teknik dasar
dalam biologi molekuler yang dapat dikembangkan menjadi penelitian-penelitian
yang kompleks mengenai informasi genetik yang dimiliki oleh suatu
organisme.Informasi pada DNA disimpan dalam bentuk basa nukleotida yaitu
adenine (A), guanine (G), cytosine (C), dan timin (T).Setiap sekuen basa nukleotida
mengandung informasi genetik yang berperan dalam perkembangan dan pengaturan
organisme (Lister,2013).

Bahan yang digunakan dalam praktikum ini terdiri atas NA, NA (Nutrient Agar)
merupakan suatu medium yang berbentuk padat, NA (Nutrient Agar) dibuat dari
campuran ekstrak daging dan peptone dengan menggunakan agar sebagai pemadat.
NA (Nutrient Agar) termasuk kedalam jenis media umum, karena media ini
merupakan media yang peling umum digunakan untuk pertumbuhan sebagian besar
bakteri(Munandar,2016:84).NB yang merupakan medium yang digunakan sebagai
tempat menumbuhkan bakteri. Bahan selanjutnya yaitu ada alhohol 70% sebagai
cairan untuk mensterilkan,bahan selanjutnya yaituada aquadest yang digunakan
untuk melindungi tangan agar mengurangi kontaminasi dan zat-zat berbahaya.
Bahan selanjutnya yang dipakai yaitu PBS atau Phospat Buffered Saline yang
merupakan suatu larutan fisiologis yang digunakan untuk pelarut. Bahan selanjutnya
yang dipakai yaitu loading dey yang berfungsi sebagai penambah densitas sehingga
nantinya DNA yang terletak dibagian bawah bawah sumur,kemudian fungsi
selanjutnya yaitu untuk memberikan warna pada DNA sehingga mudah terlihat,dan
yang terakhir dapat mempermudah untuk bergerak ke arah anoda dalam laju yang
dapat diprediksi. Fungsi dari buffer TAE yaitu untuk penyangga serta menjaga
keseimbangan pH saat terjadi perpindahan fragmen DNA sehingga nantinya akibat
adanya perubahan fragmen DNA dapat mendenaturasi struktur DNA dan dapat
mengubah elektromobilitas dari DNA itu sendiri. Bahan selanjutnya yang
digunakan yaitu gel agarose 1%, gel ini merupakan salah satu jenis
polisakarida,fungsi penggunaanya yaitu menseparasi suatu DNA dalam suatu
kisaran luas,artinya gel agarose nanti akan mampu memisahkan sampel DNA
menjadi beberapa ukuran,hal ini sesuai dengan literature yang ada yang menyatakan
bahwa gel agarose digunakan untuk memisahkan fragmen-fragmen DNA yang
mempunyai perbedaan ukuran yang lebih besar (Marks,et,al.,2000). Bahan yang
terakhir yaitu EtBr atau Ethidium Bromida yang berfungsi untuk mengikat suatu
DNA dari bakteri pada praktikum ini serta memberikan warna pada DNA sehingga
DNA yang akan disinari UV dapat berpendar.

Praktikum isolasi DNA genom ini menggunakan 2 bakteri yaitu E.coli dan
Serratia marcescens yang memiliki alasan karena bakteri ini merupakan bakteri
gram negatif,bakteri yang mudah didapat dan memiliki proses pertumbuhan yang
cepat. Hal ini berkaitan dengan pada praktikum ini yang digunakan dalam metode
freeze and thaw adalah bakteri gram negatif saja,hal ini dikarenakan memiliki
dinding sel yang tipis dibandingkan dengan bakteri gram positif yang struktur
dinding selnya lebih tebal sehingga lebih sulit dipecahkan,sedangkan bakteri gram
negatif dengan dinding sel yang tipis jika dilakukan freeze and thaw maka dinding
sel bakteri akan mudah pecah sehingga diharapkan dapat mengeluarkan DNA yang
ada. Hal ini sesuai dengan literatur yang menyatakan bahwa E. coli digolongkan
sebagai bakteri Gram negatif. Bakteri Gram negatif diketahui tidak tahan terhadap
perlakuan fisik. Berdasarkan literature yang ada apabila dinding sel bakteri
mengalami lisis dan pecah maka DNA yang ada di nucleus nantinya akan pecah dan
keluar,karena kebanyakan DNA terdapat dibagian nucleus (Buwono,dkk.,2018).

E. coli berdasarkan literatur merupakan bakteri gram negatif yang berbentuk

basil, ada yang individu (monobasil), saling berpasangan (diplobasil) atau berkoloni
membentuk rantai pendek (streptobasil), tidak membentuk spora maupun kapsula,
berdiameter ± 1,1 – 1,5 x 2,0 – 6,0 µm, dapat bertahan hidup di medium sederhana
(Pelezar dan Chan,2006:949).

Mekanisme isolasi DNA genom pada praktikum ini diawali dengan cara yang
pertama adalah menyiapkan kultur bakteri yang akan diisolasi,kemudian mengambil
1000 µl kultur cair bakteri menggunakan mikropipet kemudian memasukkan kultur
yang sesuai bakteri pada masing-masing kelompok kedalam Eppendorf,setelah
dimasukkan ke Eppendorf dan dilakukan sentifugasi menggunakan alat sentrifug
elektrik selama 5 menit dalam suhu 40oC dan 1000 rpm,setelah 5 menit kemudian
mengambil pelet yang terbentuk setelah proses sentrifugasi selesai,proses
sentrifugasi dilakukan sebanyak tiga kali ulangan. Setelah tiga kali maka pellet yang
diambil kemudian dicuci menggunakan PBS dan setelah itu di sentrifugasi kembali.
Proses isolasi pada hari pertama diakhiri dengan mengambil pellet yang didapat dan
menyimpan pellet pada suhu -20oC selama 1 hari atau 24 jam. Langkah diatas
merupakan langkah freeze,kemudian setelah melakukan freeze yaitu melakukan
proses thaw yaitu memanaskan pellet DNA kedalam panci yang berisikan air
mendidih selama 4 menit,hal itu dikarenakan karena jika lebih dari 4 menit akan
menyebabkan DNA rusak hal ini dikarenakan saat proses thawing pada suhu cukup
tinggi dapat menimbulkan terjadinya kejutan osmotik (osmotic shock) sehingga
mengakibatkan pengaruh yang mematikan terhadap sel. Kejutan osmotik
disebabkan aliran air yang berasal dari proses pencairan mengalir cepat ke dalam
sel akibat konsentrasi intraseluler yang tinggi, sehingga sel menggembung dan
akhirnya pecah karena tekanan intraseluler yang besar (Pollari,2008). Berdasarkan
literature yang ada faktor yang dapat memengaruhi keberhasilan metode freezing
adalah pencairan (thawing). Thawing merupakan proses pencairan kembali sel yang
telah dibekukan. Proses thawing dapat dilakukan pada suhu ruangan (37° C) atau
pada suhu tertentu pada water bath (Liu,2013). Mekanisme selanjutnya adalah
melarutkan pellet dengan 50 µl aquadest steril,kemudian melakukan meresuspensi
pelet dengan menggunakan mikropipet yaitu mikropipeting,setelah itu melakukan
sentrifugasi suspensi. Mekanisme selanjutnya yaitu memindahkan supernatant yang
didapat pada tabung eppendorf yang baru. Langkah selanjutnya yaitu
menambahkan loading dye sebanyak 1 µl pada supernatant yang didapat,selanjutnya
memasukkan campuran kedalam sumuran gel yang berisikan EtBr dan melakukan
elektroforesis selama 40 menit pada 80 V menggunakan buffer TBE sebagai running
buffer,setelah itu mencatat hasil elektroforesis yang tampak pada uv transluminator.
Hal ini dapat dibandingkan dengan literatur yang ada bahwa secara garis besar
isolasi DNA genom bakteri melibatkan tiga proses atau tahapan yang meliputi
perusakan sel, ekstraksi DNA, dan purifikasi DNA (Ahmed, et al., 2014).

Alasan mengapa dalam sentrifus hari pertama yang diambil adalah peletnya. Hal
ini dikarena pelet dalam sentrifus pertama mengandung bakteri sedangkan pada
sentrifus hari kedua itu yang diambil supernatannya karena dalam supernatannya
mengandung beberapa materi genetik yang didapat dari proses lisisnya sel bakteri
yang telah dilakukan proses freeze and thaw,proses ini dilakukan untuk pemecahan
atau perusakan sel atau jaringan dimaksudkan untuk mengeluarkan isi sel
(Bordonaro, et,all.,2013).

Loading dey merupakan salah satu bahan yang digunakan dalam praktikum ini
yang berfungsi sebagai penambah densitas sehingga nantinya DNA yang terletak
dibagian bawah bawah sumur,kemudian fungsi selanjutnya yaitu untuk memberikan
warna pada DNA sehingga mudah terlihat,dan yang terakhir dapat mempermudah
untuk bergerak ke arah anoda dalam laju yang dapat diprediksi.
 BAB 4. PENUTUP

4.1 Kesimpulan

1. Bahan yang digunakan dalam praktikum ini terdiri atas NA, NA (Nutrient Agar)
merupakan suatu medium yang berbentuk padat,NB yang merupakan medium
yang digunakan sebagai tempat menumbuhkan bakteri.Alhohol 70% sebagai
cairan untuk mensterilkan dan digunakan untuk melindungi tangan agar
mengurangi kontaminasi dan zat-zat berbahaya. PBS atau Phospat Buffered Saline
yang merupakan suatu larutan fisiologis yang digunakan untuk pelarut. Loading
dey yang berfungsi sebagai penambah densitas sehingga nantinya DNA yang
terletak dibagian bawah bawah sumur,dan memberikan warna pada DNA sehingga
mudah terlihat,dan yang terakhir dapat mempermudah untuk bergerak ke arah
anoda dalam laju yang dapat diprediksi. TAE yaitu untuk penyangga serta menjaga
keseimbangan pH saat terjadi perpindahan fragmen DNA ,gel agarose 1 %,gel ini
nanti akan mampu memisahkan sampel DNA menjadi beberapa ukuran,hal ini
,EtBr atau Ethidium Bromida yang berfungsi untuk mengikat suatu DNA dari
bakteri pada praktikum ini serta memberikan warna pada DNA sehingga DNA
yang akan disinari UV dapat berpendar.

2. Alasan karena bakteri ini merupakan bakteri gram negatif,bakteri yang mudah
didapat dan memiliki proses pertumbuhan yang cepat. Hal ini berkaitan dengan
pada praktikum ini yang digunakan dalam metode freeze and thaw adalah bakteri
gram negatif saja,hal ini dikarenakan memiliki dinding sel yang tipis dibandingkan
dengan bakteri gram positif yang struktur dinding selnya lebih tebal

3. Isolasi DNA genom bakteri secara garis besar melibatkan tiga proses atau tahapan
yang meliputi perusakan sel, ekstraksi DNA, dan purifikasi DNA

4. Praktikum ini yang digunakan dalam metode freeze and thaw adalah bakteri gram
negatif saja,hal ini dikarenakan memiliki dinding sel yang tipis dibandingkan
dengan bakteri gram positif yang struktur dinding selnya lebih tebal
 5. Pelet dalam sentrifus pertama mengandung bakteri sedangkan pada sentrifus hari
kedua itu yang diambil supernatannya karena dalam supernatannya mengandung
beberapa materi genetik yang didapat dari proses lisisnya sel bakteri yang telah
dilakukan proses freeze and thaw,saat setelah proses thaw maka pada bagian
supernatant akan mengandung materi genetic akibat dinding sel bakteri yang telah
lisis sehingga mengakibatkan DNA keluar..

6. Fungsi Loading dye yaitu untuk penambah densitas sehingga nantinya DNA yang
terletak dibagian bawah bawah sumur,kemudian fungsi selanjutnya yaitu untuk
memberikan warna pada DNA sehingga mudah terlihat,dan yang terakhir dapat
mempermudah untuk bergerak kea rah anoda dalam laju yang dapat diprediksi

4.2 Saran

Sebaiknnya dalam melakukan kegiatan praktikum,praktikan melakukan dengan

baik setiap langkahnya sehingga dapat menghasilkan hasil yang terbaik
 DAFTAR PUSTAKA

Ahmed, O. B., Atif H. A. & Mogahid M. E. (2014). Comparison of three DNA

extraction methods for polymerase chain reaction (PCR) analysis of bacterial
genomic DNA. African Journal of Microbiology Research. 8(6), 598-602
Bordonaro, R., P. L. McDonough, Y. Chang, and H. O. Mohammed.2013. Molecular
detection of Salmonella species in bovine fecal samples.Journal of Veterinary
Diagnostic Investigation. 25(6): 756-758
Buwono,I.D.,Iskandar,M.U.K. Agung, U. Subhan. 2018. Buku Ajar Aplikasi Teknologi
DNA rekombinan Untuk Perakitan Konstrusi Vektor Ekspresi Ikan Lele
Transgenik. Selamn: Deepublish.
Lin, Y., M. Hirai, Y. Kashino, H. Koike, S. Tuzi & K. Satoh. 2013. Tolerance to
freezing stress in cyanobacteria, Nostoc commune and some cyanobacteria with
various tolerances to drying stress. Polar Biosci .17: 56-68.
Lister, H.2013. Cells and DNA.National Institute of Health.USA: Department of
Health and Human Services.
Marks, Dawn B, Allan D Marks and Collen M. Smith. 2000. Biokimia Kedokteran
Dasar Sebuah Pendekatan Klinis. Jakarta:EGC.
Munandar,K. 2016. Pengenalan Laboratorium IPA-BIOLOGI Sekolah. Bandung:
Refika Aditama.

Pelczar, M.J dan E.C.S, Chan. 2006. Dasar–Dasar Mikrobiologi. Jakarta: UI Press.
Pollari, M. 2008. Cyanobacterial acclimation to changing environmental conditions :
role for group 2 sigma factors in Synechocystis sp. PCC 6803.Finland: Thesis
Master Biology University of Turki
R. Hunter, P.2013. Drinking water and diarrhoeal disease due to E. Coli. Journal water
and health.1(2)
LAMPIRAN

Kelompok Hasil

1,2,3 dan 4