MK: MIKROBIOLOGI TEKNIK

DOSEN : Ir. Netti Herlina, MT.

PERSIAPAN UNTUK PEMERIKSAAN BAKTERI

1. PENDAHULUAN
Bakteri dapat diperoleh dari mana-mana, misal dari rongga mulut, dari sela-
sela gigi, dari sisa-sisa makanan yang sudah basi. Biasanya kita mengadakan
pemiaraan dulu didalam cawan petri yang berisi zat-makanan atau medium. Asalkan
medium itu dibiarkan begitu saja terbuka, maka sehabis 24 jam akan kita dapati
berpuluh-puluh koloni bakteri dan jamur (cendawan) menutup permukaan medium
tersebut. Rebusan kentang yang sudah dikuliti ataupun jenang-dodol dapat kita
pergunakan sebagai medium yang sederhana. Di belakang akan diuraikan tentang
pembuatan medium untuk keperluan penelitian.
Koloni cendawan dapat segera dibedakan dari koloni bakteri; koloni
cendawan itu memperlihatkan benang-benang miselium. Koloni bakteri nampak
seperti sekelumit mentega, air susu atau percikan sari-buah yang kental.
Untuk mengetahui sifat-sifat morfologi bakteri, maka bakteri dapat diperiksa
didalam keadaan hidup ataupun didaklam keadaan mati. Pemeriksaan morfologi ini
perlu untuk mengenal nama bakteri disamping itu diperlukan juga sifat-sifat
fisiologinya, bahkan sifat-sifat fisiologi itu kebanyakan merupakan factor penentu
dalam mengenal nama spesiesnya.

2. PEMERIKSAAN BAKTERI HIDUP

Pemeriksaan bakteri hidup harus dikerjakan dengan berhati-hati, lebih-lebih
jika yang akan diperiksa itu bakteri pathogen. di sini akan dibicarakan cara-cara
pemeriksaan itu secara garis besar saja; hal-hal yang lebih khusus dapat dipelajari
dari buku-buku penuntun praktikum mikrobiologi.
Untuk mengetahui tingkah-laku (gerak-gerik) bakteri, lazimnya kita adakan
penyelidikan bakteri di dalam “tetesan bergantung”. Alat-alat yang kita perlukan
untuk ini ialah:
a. sehelai kaca-penutup (cover glass)yang bersih.
b. sehelai kaca-benda yang mempunyai cekungan di tengah-tengah.
c. kawat inokulasi, yaitu kawat lurus sepanjang 10 cm, berdiameter kurang dari
pada suatu pegangan. Guna kawat inokulasi ialah untuk memindahkan
mikroorganisme dari tempat yang satu ke tempat yang lain.

1
 MK: MIKROBIOLOGI TEKNIK
DOSEN : Ir. Netti Herlina, MT.

Baik sekali jika kawat itu dibuat dari platina atau logam lain yang tidak mudah
berkarat.
d. Sebuah mikroskop biasa.
e. Nyala api, misalnya dari lampu Bunsen, yaitu sentir yang diisi dengan spritus. Api
ini perlu sekali untuk memijarkan kawat inokulasi. Tiap kali kawat itu akan dipakai
untuk memindahkan bakteri, haruslah sebelum dan sesudahnya dipijarkan supaya
benar-benar steril.

3. PROSEDUR MENYIAPKAN SEDIAAN (PREPARAT)

Jika bakteri dipiara didalam cairan, ujung kawat inokulasi setelah dipijarkan
dan dingin kembali, kemudian dicelupkan sedikit didalam pemiaraan tersebut.
Sentuhkanlah ujung kawat yang mengandung piaraan itu kepada tengah-tengah
kaca penutup, kemudian baliklah kaca penutup itu dan letakkanlah ia diatas benda
kaca demikian rupa, sehingga tetesan yang berisi bakteri itu masuk tepat didalam
cekungan kaca benda. Setelah ujung kawat selesai dipakai tadi perlulah dipijarkan
dalam nyala api.
Kaca benda yang membawakan tetesan bergantung tersebut dapat
dipindahkan ke piringan mikroskop untuk diperiksa. Supaya cairan yang
mengandung bakteri itu tidak menguap, dapatlah tepi kaca penutup ditetesi dengan
gliserin.
Perlu diperingtkan disini, bahwa tepi mulut tabung reaksi tempat piaraan
bakteri itu harus dipanasi dengan nyala api setelah kapas penyumbatnya diambil.
Demikian pula, setelah pengambilan bakteri selesai dan kapas akan disumbatkan
kembali, maka mulut tabung piaraan itu harus dipanasi lagi. Memijarkan kawat
inokulasi sebelum dan sesudah dipakai serta memanasi mulut tabung sebelum dan
sesudah dipakai harus dipakai harus merupakan kebiasaan yang tidak boleh
dilupakan. Hal ini merupakan apa yang disebut teknik aseptik.
Keuntungan penggunakan metoda “tetesan bergantung” ialah:
a. Bakteri ada terkurung didalam lubang kaca benda, sehingga bahaya
terhamburnya kemana-mana itu hampir tidak ada.
b. Bakteri dapat bergerak dengan leluasa, jika bakteri memang suka bergerak.
Tidak semua spesies dapat bergerak.
Cara lain untuk memeriksa bakteri hidup ialah dengan tetesan medium yang
tidak bergantung. Prosedurnya lebih mudah, dan untuk itu tidak diperlukan kaca
2
 MK: MIKROBIOLOGI TEKNIK
DOSEN : Ir. Netti Herlina, MT.

benda yang mempunyai cekungan ditengah, akan tetapi cukuplah dengan

menggunakan kaca benda yang datar biasa. Ujung kawat yang membawa bakteri
disentuhkan ditengah-tengah kaca benda, kemudian tetesan itu ditutup dengan kaca
penutup biasa, maka jadilah suatu preparat yang siap untuk diperiksa. Preparat yang
disediakan demikian ini kurang aman, lagi pula gerakan bakteri tidak dapat sebebas-
bebasnya.

4. MEMBUAT PREPARAT BAKTERI YANG SUDAH DIMATIKAN LEBIH DAHULU

Sediakan sehelai kaca yang bersih. Ambillah sedikit sample dari bakteri yang
dipiara dalam medium cair atau dari suatu koloni yang terdapat pada suatu medium
padat. Pengambilan itu dengan menggunakan ujung kawat inokulasi. Gesekkan
ujung kawat yang membawakan bakteri itu ditengah-tengah kaca benda sehingga
terjadi suatu pembidangan seluas kira-kira 1 cm2. Sikap ujung kawat itu diusahakan
agak sejajar dengan permukaan kaca benda, maka penggesekan akan lebih mudah
dan lebih merata, bakteri tidak akan bertimbun-timbun pada suatu tempat tertentu.
Jika sample tadi diambil dari suatu koloni pada medium padat, maka tengah-tengah
kaca benda harus diberi sedikit air murni dulu sebelum penggesekan dilakukan. Air
itu tidak perlu diberikan, jika sample bakteri diambil dari piaraan yang berada pada
medium cair.
Tunggulah sampai gesekan agak kering, kemudian lewatkan kaca benda itu
melalui suatu nyala api, perlahan-lahan sampai gesekan itu kering. Dalam hal ini
haruslah dijaga supaya tempat gesekan bakteri tersebut tidak langsung kena nyala
api, jadi permukaan yang mengandung gesekan haruslah diatas pada waktu kaca
benda itu dilewatkan nyala api.
Jika gesekan bakteri itu sudah kering benar, dapatlah dimulai dengan
pewarnaan bakteri. Metode mewarnai preparat itu banyak sekali, akan tetapi hanya
kira-kira 12 cara sajalah yang lazim digunakan. Bakteri hidup itu tidak nampak jelas
bentuk maupun sifat-sifat morfologi lainnya. Bakteri tunggal yaitu berupa satu sel
saja nampaknya hanya bening belaka, walaupun bakteri itu berasal dari suatu koloni
yang mempunyai warna tertentu. Maka untuk memperlihatkan bagian-bagian sel itu
diperlukan pewarnaan. Untuk memperlihatkan inti atau bahan inti ada pewarnaan
tersendiri, untuk memperlihatkan flagel ada cara lain lagi, demikian pula untuk
memperlihatkan spora ada cara yang khusus untuk itu saja. Cara-cara mewarnai itu
ditemukan oleh sarjana-sarjana, sehingga metode pewarnaan itu disebut menurut
3
 MK: MIKROBIOLOGI TEKNIK
DOSEN : Ir. Netti Herlina, MT.

nama sarjana yang menemukan cara itu, misalnya pewarnaan inti disebut
pewarnaan secara Feulgen, kemudian ada pewarnaan secara Giemsa, pewarnaan
secara Gram, secara Neisser, dan masih banyak lagi. Zat warna yang digunakan
biasa biru metilen, merah safranin, ungu, hijau berlian dan lain-lainnya lagi.
Disamping itu zat warna biasa bersifat asam, netral atau basa.

5. PETUNJUK-PETUNJUK UMUM UNTUK MEWARNAI BAKTERI

Secara umum, petunjuk-petunjuk untuk mewarnai bakteri yaitu:
a. Bakteri haruslah diambil dari suatu piaraan yang masih muda, kira-kira umur 24
jam, ini usia yang baik untuk memperlihatkan bentuk morfologinya. Jika ingin
melihat bakteri yang sudah membentuk spora, maka perlulah diambil bakteri
yang sudah tua, yaitu dari suatu piaraan yang berumur 2 sampai 3 kali 24 jam.
b. Bakteri diratakan diatas kaca benda yang bersih, seluas kira-kira 1 cm2.
Hindarilah pengambilan bakteri yang terlalu banyak. Jika tidak diratakan tipis-
tipis, maka bakteri akan bertimbun-timbun sehingga pemeriksaan bentuknya satu
persatu tidak akan jelas.
c. Jika sudah kering, sediaan perlu dilewatkan nyala api perlahan-lahan supaya
bakteri itu benar-benar melekat pada kaca benda, sehingga dengan demikian
tidak akan terhapus apabila sediaan dicuci. Jangan sampai bidang yang
mengandung bakteri itu kena nyala api.
d. Zat warna ditetesi pada bidang yang mengandung bakteri. Juga mungkin seluruh
kaca benda tersebut terendam miring didalam zat warna, hal ini bergantung sifat
khusus pewarnaan, dan kadang-kadang juga bergantung pada banyak sedikitnya
kaca benda (preparat) yang harus dibuat. Zat warna diberi waktu beberapa lama
supaya diserap oleh bakteri yang sudah kering itu, waktu inipun bergantung sifat
khas dari zat warna yang digunakan.
e. Kemudian sediaan dicuci dengan alcohol atau asam encer guna menghilangkan
zat warna yang berlebihan. Alkohol yang digunakan untuk mencuci itu dapat
berupa larutan 15% sampai 95%, kadang-kadang diperlukan juga alcohol 100%.
Caranya mencuci itu cukup dengan mencelupkan sediaan ke dalam alcohol atau
ke dalam asam encer dengan tidak usah disinggung-singgung ataupun digesek-
gesek. Ada pula zat warna yang cukup dicuci dengan air murni ataupun air biasa
dari kran.

4
 MK: MIKROBIOLOGI TEKNIK
DOSEN : Ir. Netti Herlina, MT.

f. Sediaan ditunggu keringnya, jangan dipanasi. Jika sudah kering, sediaan dapat
diperiksa dengan mikroskop, kalau perlu dengan menggunakan minyak cedar
(minyak imersi atau minyak celup). Jika dikehendaki, sediaan dapat ditutup
dengan kaca penutup sebelum di tempatkan diatas piringan mikroskop. Sediaan
yang diinginkan untuk disimpan lama perlu perlakuan sebagai berikut.
Permukaan yang mengandung bakteri ditetesi balsam kanada, kemudian ditutup
dengan kaca penutup yang bersih. Sebelum kering betul, sediaan tidak boleh
diletakkan miring. Sesudah balsam kanada kering betul, barulah sediaan dapat
dimasukkan kotak penyimpan sediaan, dalam posisi miring. Selanjutnya preparat
disimpan di dalam gelap lagi pula sejuk, agar supaya zat warna tidak lekas
luntur.

6. TAHAN ASAM, GRAM POSITIF, GRAM NEGATIF

Ada kalanya, setelah suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna,
kemudian dicuci dengan asam encer, maka semua zat warna terhapus. Ditinjau dari
tujuan pewarnaan sudah barang tentu pewarnaan tersebut merupakan kegagalan.
Akan tetapi ada juga preparat yang tahan asam encer, misalnya basil-basil TBC dan
basil-basil yang berspora. Maka kita katakana, bahwa bakteri itu adalah bakteri
tahan asam, ini merupakan cirri yang khas bagi suatu species.
Ada kalanya suatu sediaan perlu diwarnai dua kali. Setelah zat warna yang
pertama (ungu) terserap, maka sediaan dicuci dengan alcohol, kemudian ditumpangi
dengan zat warna yang berlainan, yaitu dengan zat warna merah.
Jika sediaan itu kemudiaan kita cuci dengan air, lalu dengan alcohol maka
dua kemungkinan dapat terjadi. Pertama, zat warna tambahan terhapus, sehingga
yang nampak ialah zat warna yang asli (ungu). Dalam hal ini sediaan (bakteri) kita
sebut Gram Positif. Kedua, zat warna tambahan (merah) bertahan hingga zat warna
asli tidak tampak. Dalam hal ini sediaan (bakteri) kita katakan Gram Negatif. Ada
pula bakteri yang usia tertentu berubah dari gram positif menjadi gram negative atau
sebaliknya. Bakteri yang demikian ini disebut gram variable. Jumlah bakteri yang
gram variable tidaklah banyak. Bakteri gram positif lebih peka terhadap fenol,
penisilin, dan resisten terhadap streptomisin. Ciri yang khas ini dipergunakan dalam
penggolongan bakteri.

5
 MK: MIKROBIOLOGI TEKNIK
DOSEN : Ir. Netti Herlina, MT.

GUNA KULTUR BAKTERI

Untuk menggampangkan pemeriksaan perlulah diadakan kultur atau

pembiakan bakteri, sehingga sewaktu-waktu perlu, bakteri itu selalu tersedia. Kultur
dapat disimpan didalam lemari es untuk waktu yang lama.

1. KULTUR CAMPURAN, KULTUR MURNI

Supaya kita mendapatkan satu spesies saja dalam satu kultur, maka perlulah
diadakan suatu kultur murni (pure culture). Kultur murni dapat diperoleh dari kultur
campuran (mixed culture) dengan cara sebagai berikut.
Kalau kita pertama kali mengadakan pengkulturan, biasanya yang kita
peroleh itu suatu kultur campuran. Misal, kita ambil bahan (sampel) dari udara, dari
tanah, dari kotoran; kalau bahan kita sebarkan pada medium steril, akan tumbuhlah
beraneka koloni yang masing-masing mempunyai sifat-sifat yang khas. Jika kita
mengambil bahan dari salah satu koloni tersebut, kemudian bahan itu kita tanam
pada medium baru yang steril, maka bahan itu tumbuh menjadi koloni yang murni,
asalkan pekerjaan pemindahan itu dilakukan dengan cermat menurut teknik aseptik,
yaitu menggunakan alat-alat yang steril dan aturan-aturan laboratorium tertentu.
Kultur yang kita peroleh dengan jalan demikian kita sebut kultur pertama (primary
culture), dan sifatnya murni. Kultur semacam ini dapat disimpan, tetapi tiap-tiap
waktu tertentu harus diadakan peremajaan dengan memindahkannya ke medium
baru. Kultur-kultur yang diperoleh dari kultur pertama disebut kultur turunan (sub-
culture).
Tiap-tiap laboratorium perlu menyimpan beberapa jenis kultur murni. Negara-
negara yang sudah maju mesti mempunyai koleksi pelbagi kultur murni; kultur
simpanan itu disebut juga “stock culture”.
Ada kultur spesies bakteri yang sewaktu-waktu, yaitu tiap 2 atau 3 bulan
sekali, perlu diremajakan, meskipun kultur itu selalu disimpan dalam lemari es.
Untuk meremajakan kultur itu caranya sama dengan yang telah diceritakan diatas
dengan memindahkan “bibit” dari koloni yang lama kepada medium yang baru.
Setelah tanaman baru itu dibiarkan tumbuh beberapa jam dalam temperature biasa

6
 MK: MIKROBIOLOGI TEKNIK
DOSEN : Ir. Netti Herlina, MT.

(250-270C), koloni baru ini dimasukkan dalam lemari es, untuk diperbaharui 2 atau 3
bulan lagi.
Cara lain untuk menyimpan kultur murni adalah dengan jalan liofilisasi yang
prosedurnya sebagai berikut:
Bakteri ditanam di dalam air susu yang tidak mengandung lemak atau didalam
serum yang steril. Setelah tumbuh diambillah 0,1 ml dari medium tersebut untuk
dimasukkan kedalam botol-botol kecil yang dari dalam telah dilapisi dengan alkohol
yang mengandung CO2 yang kental (temperatur -780C). Kemudian leher botol itu
dipijarkan sehingga tertutuplah botol berisi bakteri itu. Dalam keadaan demikian ini
bakteri dapat disimpan sampai bertahun-tahun, asal selalu ada dalam 40C.

2. DASAR MAKANAN (MEDIUM ATAU SUBSTRAT)

Dasar makanan yang paling baik bagi kultur bakteri adalah medium yang
mengandung zat-zat organik seperti rebusan daging, sayur-sayuran, sisa-sisa
makanan, atau ramu-ramuan yang dibuat oleh menusia. Medium yang banyak
digunakan dalam pekerjaan rutin di laboratorium ialah kaldu cair dan kaldu agar.
Medium ini tersusun dari pada:
Kaldu bubuk 3g
Peptone 5g
Air suling 1000 g
Jika diperlukan medium padat, maka kepadanya ditambahkan 15 g agar-agar.
Medium ini disebut medium baku. Untuk keperluan penelitian yang berhubungan
dengan serologi perlu ditambahkan 5 g NaCl.
Jika tidak ada kaldu bubuk, bahan itu dapat diganti dengan rebusan daging
yang diperoleh sebagai berikut: ambil barang 0,5 kg daging yang tidak berlemak,
rendam dalam 1000 ml air suling semalam-malaman dalam lemari es. Paginya
buanglah lemak yang mungkin terdapat mengapung di permukaan air. Kemudian
peraslah suspensi lewat kain mori yang halus. Tambahkan air suling kepada filtrat
sehingga volume menjadi 1 liter lagi. Kepada medium ini ditambahkan 5 g peptone
dan lain-lainnya yang diperlukan, lalu panasi suspensi lewat kertas saring, dan
tambahkan air suling lagi sehingga volume tetap 1 liter. Medium ini perlu disterilkan
dahulu sebelum digunakan untuk mengkultur bakteri. Juga keasaman medium perlu
diatur, biasanya pH 7.

7
 MK: MIKROBIOLOGI TEKNIK
DOSEN : Ir. Netti Herlina, MT.

Untuk mengetahui jenis-jenis medium yang lain, yang berkepentingan

dipersilahkan membaca buku-buku praktikum mikrobiologi atau bakteriologi.
Selanjutnya medium buatan manusia itu dapat berupa :
A. Medium Cair
Medium cair yang biasa dipakai adalah kaldu yang disiapkan sebagai berikut.
Kepada 1 liter air murni ditambahkan 3 g kaldu daging lembu dan 5 g peptone.
Peptone adalah protein yang terdapat pada daging, pada air susu, pada kedelai,
dan pada putih telur. Peptone mengandung banyak N 2, sedangkan kaldu berisi
garam-garam mineral dan lain-lainnya lagi. Medium itu kemudian ditentukan
pHnya 6,8 sampai 7, jadi sedikit asam atau netral; keadaan yang demikian ini
sesuai bagi kebanyakan bakteri. Kaldu seperti tersebut diatas masih perlu
disaring untuk kemudian dimasukkan ke dalam tabung-tabung reaksi atau botol-
botol. Penyaringan dapat dilakukan dengan kertas saring. Setelah tabung atau
botol berisi medium kaldu tersebut disumbat dengan kapas, dapatlah mereka
dimasukkan kedalam alat pensteril (autoklaf).

B. Medium Kental (Padat)

Dahulu kala orang lazim menggunakan kentang yang dipotong-potong serupa
silinder untuk medium. Silinder kentang mentah dibuat dengan pipa besi, lalu
potongan-potongan itu dimasukkan kedalam tabung reaksi. Kemudian tabung
disumbat dengan kapas, dan setelah itu disterilkan di dalam autoklaf. Setelah
kentang dingin kembali, permukaan atas dari silinder kentang dapat ditanami
bakteri.
Suatu penemuan yang baik sekali adalah medium dari kaldu yang dicampur
dengan sedikit agar-agar. Setelah medium itu disterilkan, dan kemudian
dibiarkan mendingin, maka kita perolehlah medium padat. Gelatin dapat juga
dipakai sebagai bahan pengental dan memang dahulu orang biasa memakainya,
tetapi sejak lama orang lebih suka menggunakan agar-agar. Agar-agar baru
mencair pada suhu 950C, sedangkan gelatin sudah mencair pada suhu 23 0C.
Dengan demikian medium yang mengandung gelatin perlu disimpan dalam
tempat yang lebih dingin daripada temperatur kamar, jika dikehendaki medium
tersebut tetap dalam keadaan padat.

8
 MK: MIKROBIOLOGI TEKNIK
DOSEN : Ir. Netti Herlina, MT.

Agar-agar merupakan zat pengental, dan bukan zat makanan bagi bakteri.
Gelatin sebaliknya dapat diencerkan oleh enzim-enzim bakteri. Gelatin diperoleh
dari rebusan tulang-tulang, jadi gelatin itu zat serupa perekat.

C. Medium Yang Diperkaya

Kebanyakan bakteri suka tumbuh pada dasar makanan seperti disebut diatas.
Tetapi bakteri patogen seperti Brucella abortus, Mycobacterium tuberculosis,
Diplococcus pneumoniae, dan Neisseria gonorrhoeae memerlukan zat makanan
tambahan berupa serum atau darah yang tak mengandung fibrinogen lagi.
Fibrinogen adalah zat yang menyebabkan darah menjadi kental, apabila keluar
diluka. Serum atau darah itu dicampurkan ini dilakukan sebelum disterilkan. Jika
pencampuran ini dilakukan sebelum sterilisasi, maka serum atau darah tersebut
akan mengental akibat pemanasan. Pada medium buatan Loeffler, serum
dicampurkan didalam dasar makanan sebelum sterilisasi. Medium ini baik sekali
untuk memiara basil-basil dipteri. Juga medium yang memerlukan tambahan
putih telur dibuat dengan cara demikian. Sering kali orang menambahkan susu
atau air tomat kepada dasar makanan untuk menambahkan Lactobacillus dan
beberapa spesies lainnya.

D. Medium Yang Kering

Pekerjaan laboratorium sekarang ini banyak dipermudah dengan telah adanya
bermacam-macam medium yang tersedia dalam bentuk serbuk kering. Untuk
menyiapkan medium tersebut, cukuplah orang mengambil sekian gram serbuk
kering tersebut untuk dilarutkan dalam sekian liter air dan kemudian larutan itu
disterilkan. Penentuan pH tidak perlu lagi, karena hal itu sudah dilakukan lebih
dahulu pada pembuatan serbuk. Periksalah “Difco Manual of dehydrated culture
media and reagents for microbiological and dimical laboratory producers”.

E. Medium Yang Sitentik

Medium sitentik berupa ramuan-ramuan zat anorganik yang tertentu yang
mengandung zat karbon dan nitrogen. Bakteri autotrof dapat hidup dalam
medium ini. Bakteri saprofit (istilah lain untuk ini adalah saprobakteri) dapat juga
di kultur di dalam medium ini asalkan kepada medium ini ditambahkan natrium
sitrat dan natrium ammonium fosfat; yang pertama merupakan sumber karbon,
9
 MK: MIKROBIOLOGI TEKNIK
DOSEN : Ir. Netti Herlina, MT.

sedang yang kedua merupakan sumber nitrogen. Medium ini buatan koser, dan
medium ini berguna untuk membedakan Aerobacter aerogenes dari Escherichia
coli; yang pertama dapat hidup dalam medium ini, sedang yang kedua tidak.
Medium yang hanya cocok untuk spesies-spesies tertentu, dan tidak cocok untuk
spesies-spesies yang lain, itu disebut medium selektif.
Medium sintetik itu umumnya dibuat secara eksperimental. Medium ini tidak
menimbulkan zat-zat penolak, apabila masuk tubuh hewan atau manusia.
Selanjutnya medium sintetik itu berguna sekali sebagai medium dasar dalam
penyelidikan macam-macam vitamin, asam amino dan lain-lain. Penyelidikan
tentang ada tidaknya zat-zat tertentu dengan menggunakan mikroorganisme itu
disebut analisis zat jadi atau bio-assay.

3 STERILISASI MEDIUM DAN PERALATAN

Kita semua dapat memaklumi, andaikata medium dan alat-alat yang kita
pergunakan dalam inokulasi itu tidak steril, niscahayalah kita tidak akan mungkin
memperoleh kultur bakteri yang kita inginkan. Maka langkah-langkah pertama yang
harus kita ambil sebelum kita mengadakan inokulasi adalah mengusahakan sterilnya
medium serta alat-alat perlengkapannya. Lagi pula, kita harus menguasai teknik
inokulasi.
Beberapa cara untuk mensterilkan medium, adalah:
1. Dalam abad 18 orang mensterilkan medium cukup dengan mendidihkan
medium tersebut selama beberapa jam. Dengan jalan ini maka matilah semua
benih kehidupan. Cara yang demikian ini dilakukan oleh Spallanzani (1729-
1799) untuk membuktikan tidak mungkinnya abiogenesis.
2. Tyndallisasi, medium ini berupa mendidihkan medium dengan uap untuk
beberapa menit saja. Sehabis didiamkan satu hari selama itu spora-spora
sempat tumbuh menjadi bakteri vegetatif, maka medium tersebut dididihkan lagi
selama beberapa menit. Akhirnya pada hari ketiga, medium tersebut dididihkan
sekali lagi. Dengan jalan demikian ini diperolehlah medium yang steril, dan lagi
pula, zat-zat organik yang terkandung didalamnya tidak mengalami banyak
perubahan.
3. Dengan autoklaf, yaitu alat berupa tangki minyak yang dapat diisi dengan uap.
Medium yang akan disterilkan ditempatkan didalam autoklaf selama 15 sampai
20 menit, hal ini bergantung kepada banyak sedikitnya barang yang perlu
10
 MK: MIKROBIOLOGI TEKNIK
DOSEN : Ir. Netti Herlina, MT.

disterilkan. Medium yang akan disterilkan itu lebih baik ditempatkan dalam
beberapa botolyang agak kecil daripada dikumpul dalam satu botol yang besar.
Setelah pintu autoklaf ditutup rapat, barulah kran pada pipa uap dibuka, dan
temperatur akan terus-menerus naik sampai 1210C. Biasanya autoklaf sudah
diatur sedemikian rupa, sehingga pada suhu tersebut, tekanan ada sebesar 15
lbs (pound) per inch persegi yang berarti 1 atmosfer per 1 cm 2. Perhitungan
waktu 15 atau 20 menit itu dimulai semenjak thermometer pada autoklaf
menunjuk 1210C. Setelah cukup waktu, maka kran uap ditutup, dan dengan
demikian akan kita saksikan, bahwa suhu mulai turun sedikit demi sedikit,
demikian pula manometer. Autoklaf tidak boleh dibuka sembarangan. Jika
dilakukan hal demikian, maka isi botol yang ada diautoklaf akan meluap
kemana-mana. Kita menunggu sampai manometer menunjuk 0, barulah
autoklaf kita buka. Pendinginan dilakukan sedikit demi sedikit. Jika medium
mengandung vitamin, gelatin maka setelah sterilisasi sependek-pendeknya
dalam autoklaf, medium tersebut haruslah segera didinginkan sesudahnya
dikeluarkan dari autoklaf. Perlakuan ini pertlu untuk menghindarkan terurainya
zat-zat tersebut. Medium yang sudah steril dapat disimpan dalam lemari es.
4. Dengan Penyaringan (filtrasi). Medium disaring dengan saringan porselin atau
dengan tanah diatom. Dengan jalan ini, maka zat-zat organik tidak akan
mengalami penguraian sama sekali. Hanya sayang, virus tak dapat terpisah
dengan penyaringan semacam ini. Oleh karena itu, sehabis penyaringan,
medium masih perlu dipanaskan dalam autoklaf, meskipun tidak selam 15
menit dengan temperatur 1210C. Penyaringan dapat juga dengan
menggunakan saringan yang dibuat dari asbes, Saringan ini lebih murah dan
lebih mudah penggunaannya daripada saringan porselen. Saringan asbes
dapat dibuang setelah dipakai, sedangkan saringan porselen terlalu mahal
untuk dibuang, dan terlalu sulit untuk dibersihkan.

Pensteril Dengan Gelas-Gellas

Gelas, botol, pipa, pipet yang sudah bersih tidak disterilkan didalam autoklaf,
karena barang-barang tersebut akan tetap basah sehabis sterilisasi. Alat-alat dari
gelas dimasukkan didalam oven kering selama 2-3 jam pada temperatur 1600-
1700C, hal ini bergantung kepada banyak sedikitnya muatan yang dimasukkan
dalam oven. Kapas masih dapat bertahan dalam oven kering selama waktu dan
11
 MK: MIKROBIOLOGI TEKNIK
DOSEN : Ir. Netti Herlina, MT.

pada temperatur seperti tersebut diatas. Alat-alat yang belum bersih dan belum
kering tidak boleh dimasukkan dalam oven kering.
Pensterilan peralatan dapat pula dilakukan dengan gas etilen oksida. Hal ini
harus dikerjakan dengan hati-hati, karena ada bahaya letusan.

4. PENANAMAN BAKTERI (INOKULASI)

Pekerjaan memindahkan bakteri dari medium yang lama ke medium yang
baru meminta banyak ketelitian. Terlebih dahulu harus diusahakan agar semua
peralatan yang ada sangkut-pautnya dengan medium dan pekerjaan inokulasi harus
benar-benar steril, ini untuk menghindari kontaminasi, yaitu masuknya
mikroorganisme yang tidak kita inginkan.

A. Menyiapkan Ruangan.
Ruang tempat inokulasi itu kecil, bersih dan bebas angin. Dinding ruang yang
basah menyebabkan butir-butir debu menempel kepadanya. Pada waktu
mengadakan inokulasi, baik sekali jika meja tempat inokulasi itu dibasahi dengan
kain basah. Pekerjaan inokulasi dapat dilakukan juga didalam suatu kotak berkaca.
Dalam laboratorium didalam untuk membuat vaksin, serum dan sebagainya, udara
yang masuk kedalam ruangan itu dilewatkan saringan yang disinari dengan sinar
ultra-ungu.

B. Memindahkan Dengan Kawat Inokulasi

Ujung kawat inokulasi sebaiknya dari platina atau dari micron, ujung itu boleh
lurus, boleh juga berupa kolongan dengan diameter 1-3 mm. Lebih dahulu ujung
kawat dipijarkan, sedang sisanya dalam tangki cukup dilewatkan nyala api saja.
Setelah dingin kembali, ujung kawat itu disentuhkan suatu kolini. Mulut tabung
tempat pengkulturan itu dipanasi juga setelah sumbatnya diambil. Setelah
pengambilan inokulum (yaitu sampel bakteri) selesai, mulut tabung dipanasi lagi
kemudian disumbat seperti semula. Ujung kawat yang membawakan inokulum
tersebut digesekkan pada medium baru atau pada suatu kaca benda, kalau
tujuannya memang akan membuat suatu sediaan.

12
 MK: MIKROBIOLOGI TEKNIK
DOSEN : Ir. Netti Herlina, MT.

C. Pemindahan Dengan Pipet

Cara ini dilakukan misalnya pada penyelidikan air minum atau pada
penyelidikan susu. Untuk itu diambillah 1 ml contoh untuk diencerkan dengan 99 ml
air murni yang steril. Kemudian ambil 1 ml dari enceran ini untuk dicampur adukkan
dengan medium agar-agar yang masih dalam keadaan cair (suhu antara 42-450C).
Lalu agar-agar yang masih encer itu dituangkan dalam cawan Petri. Setelah agar-
agar membeku, maka cawan petri yang berisi kultur baru itu disimpan dalam tempat
yang aman, misalnya didalam lemari atau dalam laci. Penyimpanan cawan dilakukan
dengan meletakkannya secara terbalik, yaitu permukaan medium menghadap
kebawah, ini untuk menghindari tetesnya air yang mungkin melekat pada dinding
dalam tutup cawan. Kultur diperoleh dengan jalan seperti disebut diatas ini dikenal
sebagai kultur adukan. Dengan cara yang demikian ini bakteri yang diinokulasikan
tadi dapat menyebar luas keseluruh medium. Bakteri yang aerob maupun yang
anaerob dapat tumbuh disitu, dan banyaknya koloni dapat dihitung dengan mudah.
Pengenceran 1 ml sampel dengan 99 ml air murni itu tidak mutlak, hal ini
tergantung kepada keadaan air atau susu yang akan diselidiki.

5 CARA MENYENDIRIKAN KULTUR MURNI

Dalam keadaan sebenarnya (dialam bebas) boleh dikata tidak ada bakteri
yang hidup tersendiri terlepas dari spesies lainnya. Kerap kali bakteri patogen
kedapatan bersama-sama bakteri saprobe. Yang terakhir ini boleh disebut
penyerbuk yang membonceng (secondary invaders). Mungkin juga bakteri patogen
yang membonceng. Untuk menentukan siapa pembonceng dan siapa yang
memboncengi diberikan pedoman “siapa yang kedapatan disitu lebih dulu, dan siapa
yang datang kemudian”
Untuk menyendirikan suatu spesies ada dikenal beberapa cara, yaitu:
A. Dengan Pengenceran
Cara ini pertama-tama dilakukan oleh Lister dalam tahun 1865. Ia berhasil
mengkultur murni Streptococcus lactis yang diisolasikannya dari susu yang
sudah asam.
Suatu sampel dari suatu suspensi yang berupa bemacam-macam spesies
diencerkan dalam suatu tabung tersendiri. Dari enceran ini kemudian diambil 1
ml untuk diencerkan lagi. Kalau perlu, dari enceran yang kedua ini diambil 1 ml
untuk diencerkan lebih lanjut. Jika dari pengenceran yang ketiga ini diambil 0,1
13
 MK: MIKROBIOLOGI TEKNIK
DOSEN : Ir. Netti Herlina, MT.

ml untuk disebarkan pada suatu medium padat, kemungkinan besar kita akan
mendapatkan beberapa koloni tumbuh dalam medium tersebut, tetapi mungkin
juga kita hanya memperoleh satu koloni saja. Dalam hal yang demikian ini kita
memperoleh satu koloni murni, dan selanjutnya spesies ini dapat kita jadikan
kultur murni. Kalau kita belum yakin, bahwa koloni tunggal yang kita peroleh itu
murni, kita dapat mengulang pengenceran dengan menggunakan koloni ini
sebagai sampel.

B. Dengan Penuangan
Robert Koch (1843-1905) mempunyai metode lain, yaitu dengan mengambil
sedikit sampel campuran bakteri yang sudah diencerkan, dan sampel ini
kemudian disebarkan didalam suatu medium dari kaldu dan gelatin encer.
Dengan demikian diperolehnyalah suatu kultur adukan. Setelah medium itu
mengental, maka selang beberapa jam kemudian nampaklah koloni-koloni
masing-masing dapat dianggap murni. Dengan mengulang pekerjaan seperti
tersebut diatas ini, maka akhirnya akan diperoleh kultur murni yang lebih
terjamin.
Dalam melakukan metode ini ada dua orang pembantu Koch yang sangat
berjasa, yaitu Petri yang menciptakan cawan petri (petri dish). Pembantu yang
kedua adalah Hesse yang menemukan agar-agar untuk menggantikan gelatin.
Memang agar-agar ternyata lebih baik daripada gelatin untuk bahan pengental
suatu medium. Agar-agar tidak lekas mencair, titik cairnya 950C.

C. Dengan Penggesekan
Metode ini sekarang banyak digunakan, karena tidak begitu memakan waktu,
hanya sayang, dengan cara ini maka bakteri anaerob tidak dapat tumbuh.
Jika ujung kawat inokulasi dibengkokan, kemudian ujung itu setelah disentuhkan
suatu koloni lalu digesekkan pada permukaan medium padat, maka beberapa
waktu kemudian dari pada itu (kurang lebih setelah 12 jam) akan tampaklah
koloni-koloni yang letaknya tersebar dipermukaan medium. Jika diadakan
pemindahan sampel dari suatu koloni yang letaknya terpencil, maka akan
diperoleh suatu kultur murni.

14
 MK: MIKROBIOLOGI TEKNIK
DOSEN : Ir. Netti Herlina, MT.

D. Dengan Mengucilkan Satu Sel

Alangkah baiknya, jika kita mempunyai alat yang dapat memungut satu bakteri
dari sekian banyak, dengan tidak ikut sertanya bakteri lain. Alat semacam itu
ada, meskipun cara menggunakannya tidak gampang. Alat itu berupa mikropipet
yang ditempatkan pada tangan-tangan suatu micromanipulator. Dengan
mikropipet dibuat beberapa tetesan bergantung pada suatu kaca penutup.
Pekerjaan ini dilakukan dibawah objektif mikroskop. Jika tampak suatu tetesan
hanya mengandung satu bakteri, maka dengan kata lain mikropipet, tetesan
tersebut dipindahkan ke suatu medium encer dengan maksud supaya bakteri
tersebut berbiak dulu. Kemudian dari sini dapat diperoleh kultur murni. Metode ini
sangat memerlukan kesabaran, lagi pula, micromanipulator itu sangat mahal.

E. Dengan Inokulasi Hewan

Metode ini didasarkan atas suatu kenyataan, bahwa tidak semua bakteri dapat
tumbuh didalam tubuh seekor hewan. Misalnya kita ambil dahak dari seseorang
yang disangka menderita tbc. Jika dahak ini disuntikkan kedalam tubuh tikus
putih, maka bakteri-bakteri saproba yang ikut serta itu tidak akan bertahan,
sehingga kemudian kita peroleh semata-mata basil tbc saja. Kultur
Pneumococcus murni dapat diperoleh dengan jalan demikian juga. Bakteri yang
ketinggalan dalam tubuh tikus yang sakit atau mati itu akhirnya dapat
dipindahkan kedalam medium yang sesuai.
Inokulasi dapat dilakukan di dalam kulit (intracutaneous), dapat di bawah kulit
(subcutaneous), dapat di dalam otot (intramuscular), dapat di dalam rongga
tubuh atau lain-lain tempat lagi.

15