MEDIA SELEKTIF BAKTERI YANG TIDAK BOLEH ADA DALAM SEDIAN

Media selektif / media penghambat adalah media yang ditambah zat kimia tertentu yang bersifat selektif
untuk mencegah pertumbuhan mikroba lain sehingga dapat mengisolasi mikroba tertentu

1. Salmonella dan Shigella (SSA)

Salah satu contoh media selektif yaitu salmomella shigella agar yang digunakan untuk mengisolasi kuman
Salmonella sp dan Shigella sp dari sampel feses, urin, dan makanan. Untuk khusus isolasi kuman shigella,
media ini tidak disarankan karena beberapa strain shigella akan terhambat. Media ini tersusun atas
beberapa bahan, seperti campuran ekstrak, vitamin, mineral, dan asam amino, campuran bile salt, sodium
sitrat, dan brilliant green, neutral red ,dan ferric citrate. (Ageha, 2011). Perbenihan ini mirip dengan Mc.
Conkey Agar, hanya penggunaannya lebih khusus lagi untuk basil gram negatif patogen enterik, sehingga
dipakai untuk isolasi dari spesimen tinja terutama,Salmonella dan Shigella yang keduanya
memperlihatkan pertumbuhan koloni yang tak berwarna. (Edi,2012)

Untuk membuat media SSA ditimbang bubuk SSA menggunakan neraca analitik kemudian masukkan ke
dalam Erlenmeyer. Larutkan bubuk SSA dalam Erlenmeyer dengan aquadest, diaduk hingga homogen.
Larutan dipanaskan menggunkan kompor listrik sambil diaduk hingga larut sempurna. Ukur pH larutan
dengan menggunakan pH stick, pH SSA adalah 7 ± 0,2. Media dituang ke dalam plate sebanyak 15-
20mL dengan disertai proses fiksasi. Media diberi label nama dan tanggal pembuatan. Media siap
digunakan.

Dalam label kemasan bubuk media SSA merk OXOID tertera 63 gram bubuk media dilarutkan dengan 1L
aquades. Jika kita ingin menggunakan 50 ml aquades maka berat bubuk MCA yang harus ditimbang
dapat dihitung sebagai berikut :

SSA digunakan untuk menyeleksi salmonella dan beberapa strains shigella dari specimen tinja (stool).
SSA juga membedakan bakteri yang menghasilkan koloni yang karakteristik pada medium. SSA
mengandung garam empedu, Na-sitrat, dan brilliant green yang menghambat pertumbuhan gram (+) dan
beberapa gram (-) LF normal yang ada di tinja. Laktosa merupakan sumber karbohidrat , sedangkan
indicator yang dipakai adalah neutral red. Jika bakteri tumbuh dan memefermentasi laktosa maka akan
menghasilkan asam dan mengubah indikator menjadi pink-merah. Na-tiosulfit sebagai sumber sulfur
untuk produk H2S. jika H2S diproduksi maka akan bereaksi dengan FeCl3 yang terdapat dalam medium.

Bakteri Salmonella mempunyai karakteristik gram negatif; berbentuk batang, tidak membentuk spora,
aerob/fakultatif an-aerob. Ia dapat memfermentasiglukosa dengan membentuk asam/gas dan dapat
mereduksi nitrat menjadi nitrit. Mempunyai sifat katalase positif dan oksidase negatif serta mudah
tumbuh pada kebanyakan media. Pengujian Salmonella juga memerlukan tahapan yang cukup panjang
dan hanya dengan pengujian lengkap maka seseorang bisa menyimpulkan keberadaan Salmonella . Uji
Salmonella umumnya didahului dengan tahap pre-enrichment pada medium kaya untuk meyembuhkan sel
Salmonella yang luka ( injured ) , selective-enrichment (pengkayaan selektif) pada media selektif untuk
menghalau bakteri-bakteri non Salmonella.
Komposisi bahan-bahan dari bubuk SSA beserta fungsinya adalah sebagai berikut:

 Lab-Lemco powder 5,0 gr, Sebagai sumber vitamin B 

 Peptone 5,0 gr, Sebagai sumber nutrisi yang diperlukan untuk pertumbuhan mikroba 
 Laktose 10,0 gr, Sebagai sumber energy dan sebagai bahan karbohidrat 
 Bile Salt 8,5 gr, Sebagai penghambat tumbuhnya bakteri gram positif 
  Sodium Citrate 10,0 gr, Sebagai sumber nutrisi lain bagi mikroorganisme 
 Sodium thiosulphate 8,5 gr, Sebagai sumber nutrisi bagi mikroorganisme 
 Ferric citrate 1,0 gr, Sebagai bahan buffer dan aseptor electron 
 Briliant green 0,00033 gr, Sebagai inhibitor atau penghambat tumbuhnya mikroorganisme lain 
 Neutral red 0,025 gr, Sebagai indicator untuk mengetahui terbentuk tidaknya asam karena
pemecahan karbohidrat 
 Bacto Agar 13,5 gr, Sebagai bahan pemadat media. 
 Sebagai bahan penghambat utama adalah garam empedu dan brilian green yang tidak hanya
menghambat bakteri garam positif saja tetapi meneekan pertumbuhan basil patogen nonenterik
lainnya.

Untuk menghindari kesalahan pembuatan media khususnya S S A, salah satunya harus memperhatikan
pH aquadest yang digunakan. pH aquadestyang di atur pH nya sesuai dengan volume yang akan kita
gunakan. pH aquadest untuk media SSA yaitu 7,0±0,2, jika pH masih dibawah ketentuan atau cenderung
ke asam, maka harus ditambahkan HCL tetes demi tetes hingga mencapai pH yang digunakan. SSA tidak
disterilkan dalam autoclave karena ada zat zat yang akan rusak yakni sodium sitrate dan sodium
thiosulphate. Mulut Erlenmeyer harus ditutup dengan kapas berlemak untuk mengurangi terjadinya
penguapan dan menjaga volume dari SSA tersebut. Setelah medianya padat disusun dalam keadaan
terbalik supaya uap air yang terdapat pada penutup plat diturun kembali ke permukaan media

2. Pseudomonas
a) Selenit Enrichment Broth

Selenit menghambat pertumbuhan kuman coliform dan enterococcus selama 6-12 jam pertama inkubasi
sedangkan Salmonella, Proteus, dan Pseudomonas tidak terhambat pertumbuhannya.

Komposisi :

      Pepton 5 gram

      Laktosa 4 gram

      Na selenit 4 gram

      Dikalium hygrogen fosfat 3,5 gram

      Kalium dihydrogen fosfat 6,5 gram

Cara pembuatan :

        Campur 23 g/liter (jika perlu pemanasan suhu tidak boleh melebihi 60° C), jika media akan disimpan
untuk jangka waktu yang lama filter steril dan ditempatkan dalam wadah yang sesuai.

Jangan di autoclave, jika terdapat endapan merah pada selenit maka media tidak dapat digunakan lebih
lanjut. pH 7,0 ± 0,1.

b) Pseudomonas Selective Agar Base (Cetrimide Agar)

        Media ini digunakan sebagai media isolasi dan diferensial untuk Pseudomonas aeruginosa dari
berbagai macam bahan.
        Sebagian besar senyawa dalam media ini menghambat pertumbuhan mikroba flora yang
menyertainya sehingga konsentrasi asli dari inhibitor (0,1%) dikurangi untuk meminimalkan gangguan
pada pertumbuhan Pseudomonas. Produksi pigmen Pseudomonas aeruginosa tidak di hambat bila ditanam
pada media ini.

Komposisi :

       Pepton dari gelatin 20 gram

       Magnesium klorida 1,4 gram

       Kalium sulfat 10 gram

       Cetrimide 0,3 gram

       Agar-Agar 13,6 gram

       Gliserol 10 ml

Cara pembuatan :

       Campur 45,5 g/liter tambahkan 10 ml gliserol/liter, sterilkan di autoclave. Tuang ke dalam cawan
petri steril.

       Agar cetrimide merupakan jenis agar-agar yang digunakan untuk isolasi selektif bekteri gram
negative, Pseudomonas aeruginosa. Seperti namanya media ini mengandung cetrimide, yang merupakan
agen selektif terhadap flora mikroba elternatif. Cetrimide juga meningkatkan produksi pigmen
Pseudomonas seperti pyocyanin dan fluorescens, yang menunjukkan warna biru-hijau dan kuning-hijau
karakteristik masing-masing. Cetrimide agar-agar secara luas digunakan dalam pengujian kosmetik,
farmasi dan spesimen klinis untuk menguji keberadaan Pseudomonas aeruginosa.

c) Pseudomonas Agar F Base dan Pseudomonas Agar P Base

       Media ini digunakan untuk isolasi dan diferensiasi Pseudomonas berdasarkan pembentukan
pyocyanin dan pyorubin atau fluorescein.

       Pseudomonas Agar P Base merangsang pembentukan pyocianin dan mengurangi fluorescein,
sedangkan Pseudomonas Agar F Base merangsang produksi fluorescein dan mengurangi pyocianin.
Simultan menggunakan kedua media kultur memungkinkan cepat saat identifikasi prminilary dari spesies
Pseudomonas, karena beberapa strain hanya dapat mensintesis pyocyanin, beberapa hanya dapat
mensintesis fluorescein dan ada yang menghasilkan kedua pigmen.

Komposisi:

a. Pseudomonas Agar F Base

       Pepton dari kasein 10 gram

       Pepton dari daging 10 gram

       Magnesium sulfat 1,5 gram

       Di-kalium hydrogen sulfat 1,5 gram

       Agar –agar 12 gram

      Gliserol 10 ml

b. Pseudomonas Agar P Base

      Pepton dari gelatin 20 gram

      Magnesium klorida 1.4 gram

      Kalium fosfat 10 gram

      Agar –agar 12.6 gram

      Gliserol 10 ml

Cara pembuatan :

      Campur 10 ml gliserol/liter dengan 35 gram Pseudomonas Agar F Base/liter atau 44 gram
Pseudomonas Agar P Base/liter. Sterilkan di autoclave, kemudian tuang dalam cawan petri steril.

Prosedur dan evaluasi :

       Inokulasi permukaan media kultur yang diduga mengandung Pseudomonas sehingga koloni individu
berkembang.

Inkubasi: 1 minggu pada suhu 37 ° C

Periksa pertumbuhan bakteri setelah 24,48,72 jam dan kemudian setelah 6 hari.

Hanya Pseudomonas aeruginosa dapat tumbuh pada Pseudomonas Agar P Base dengan koloni yang
dikelilingi oleh zona biru hingga hijau karena pembentukan pyocianin atau zona merah hingga coklat
gelap karena produksi pyorubin. Pigmen yang berwarna dapat diekstraksi dengan kloroform.
Pseudomonas aeruginosa muncul pada Pseudomonas Agar F Base sebagai koloni dikelilingi oleh zona
kuning hingga kehijauan-kuning yang dihasilkan dari produksi fluorescein. Jika pycyanin juga disintesis,
warna hijau terang yang dihasilkan berfluoresensi dalam cahaya ultraviolet.

3. Staphulococcus Aureus

mannitol salt agar atau disingkat MSA (agar garam manitol )merupakan media selektif dan diferensial
untuk identifikasi staphylococcus aureus. Media ini mengandunng garam natrium klorida 7,5% sehingga
media ini menjadi media selektif. Karena sebagian besar bakteri tidak dapat tumbuh pada konsenterasi
garam7,5% kecuali staphylococcus . Selain itu MSA mengandung manitol dan indikator PH phenol red
yang membuat media ini menjadi media diferensial. Staphylococcus Aureus akan menghasilkan koloni
kuning dengan zona kuning karena dapat memfermentasi manitol menjadi asam yang kemudian merubah
warna indikator phenol red dari merah menjadi kuning, sedangkan Staphylococcus jenis lainnya
menghasilkan koloni merah muda kecil atau koloni merah dengan tidak ada perubahan warna medium
karena tidak dapat memfermentasi manitol.

4. E.Coli

 Mac Conkey Agar

Mac Conkey Agar adalah salah satu jenis media yang digunakan untuk identifikasi mikroorganisme. Mac
Conkey agar termasuk dalam media selektif dan diferensial bagi mikroba. Jenis mikroba tertentu akan
membentuk koloni dengan ciri tertentu yang khas apabila ditumbuhkan pada media ini.

Persenyawaan utama dalam media ini adalah laktosa, garam empedu, dan merah netral sebagai indikator
warna. Media ini akan menghambat pertumbuhan bakteri gram positif dengan adanya garam empedu
yang akan membentuk kristal violet. Bakteri gram negatif yang tumbuh dapat dibedakan dalam
kemampuannya memfermentasikan laktosa. Koloni bakteri yang memfermentasikan laktosa berwarna
merah bata dan dapat dikelilingi oleh endapan garam empedu. Endapan ini disebabkan oleh penguraian
laktosa menjadi asam yang akan bereaksi dengan garam empedu.[1]

Bakteri yang tidak memfermentasikan laktosa biasanya bersifat patogen. Golongan bakteri ini tidak
memperlihatkan perubahan pada media. Ini berarti warna koloninya sama dengan warna media. Warna
koloni dapat dilihat pada bagian koloni yang terpisah.[1]

Beberapa contoh pertumbuhan koloni pada Mac Conkey Agar[1]:

 Salmonella dan Shigella: serupa media

 Escherichia coli: merah dikelilingin zona keruh

 EMBA

Pembuatan medium EMBA (Merck) dilakukan dengan menimbang terlebih dahulu sebanyak 36 gr,
selanjutnya dimasukkan dalam Erlenmeyer dan ditambahkan akuades hingga volume mencapai 1L.
larutan dihomogenkan dalam penangas yang dipanaskan sambil diaduk. Setelah homogen, mulut
Erlenmeyer ditutup menggunakan cotton plug dan disterilkan dalam autoclave. Alat dan bahan penelitian
disterilkan menggunakan autoclave pada suhu 121 0C selama 15-30 menit. Alat-alat penelitian dan
akuades yang akan digunakan disterilkan menggunakan autoclave selama 20 menit, dan bahan medium
disterilkan dalam autoclave selama 15 menit. Medium yang telah steril dituang pada petridish steril dalam
Biosafety Cabinet (BSC) hingga memadat, selanjutnya medium steril tersebut disimpat dalam cooler
media. Sampel yang diperoleh diambil sebanyak 1 ml untuk diencerkan secara seri dalam 9 ml akuades
steril untuk pengenceran 10-1 hingga pengenceran 10-3. Masing-masing pengenceran diambil sebanyak
100µl dan ditumbuhkan dalam medium EMBA dengan metode spread plate atau perataan dan diinkubasi
pada inkubator bakteri suhu ± 37 0C. Sampel positif pada uji konfirmasi ditandai dengan tumbuhnya
koloni berwarna metalik kehijauan dengan bintik gelap di tengah koloni pada permukaan medium
EMBA. Penentuan jumlah bakteri E. coli dalam sampel secara kuantitatif menggunakan rumus
perhitungan oleh Fardiaz (1992):
𝐾𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖 𝑚𝐿

= 𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑘𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖 𝑝𝑒𝑟 𝑐𝑎𝑤𝑎𝑛 𝑥

1 𝑓𝑎𝑘𝑡𝑜𝑟 𝑝𝑒𝑛𝑔𝑒𝑛𝑐𝑒𝑟𝑎𝑛

𝑥 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑖𝑛𝑜𝑘𝑢𝑙𝑢𝑚

Satuan yang digunakan untuk menyatakan hasil perhitungan jumlah bakteri dalam sampel berdasarkan
rumus tersebut yaitu CFU (Colony Form Unit)/mL.

Bakteri E. coli yang diidentifikasi menggunakan media EMBA akan membentuk koloni berwarna metalik
kehijauan dengan bintik gelap di bagian tengah koloni pada permukaan media (Brooks et al., 2010).
Warna metalik kehijauan disebabkan karena terbentuknya asam yang dihasilkan selama proses fermentasi
oleh bakteri E. coli sehingga pH medium mengalami penurunan (Wynne et al., 1942; Horvath & Ropp
1974).

Medium EMBA merupakan medium selektif diferensial untuk bakteri E. coli. Sebelum sampel
diinokulasikan ke dalam medium EMBA, perlu dilakukan pengenceran seri terlebih dahulu. Hasil uji
dikatakan positif apabila terdapat koloni berwarna metalik kehijauan dan bagian tengah koloni berwarna
gelap pada permukaan medium EMBA.