Isolasi Dan Identifikasi Bakteri

Isolasi bakteri adalah proses mengambil bakteri dari medium atau lingkungan
asalnya dan menumbuhkannya di medium buatan sehingga diperoleh biakan yang
murni. Bakteri dipindahkan dari satu tempat ke tempat lainnya harus menggunakan
prosedur aseptik. Aseptik berarti bebas dari sepsis, yaitu kondisi terkontaminasi karena
mikroorganisme lain. Teknik aseptik ini sangat penting bila bekerja dengan bakteri.
Beberapa alat yang digunakan untuk menjalankan prosedur ini adalah bunsen dan
laminar air flow. Bila tidak dijalankan dengan tepat, ada kemungkinan kontaminasi
oleh miroorganisme lain sehingga akan mengganggu hasil yang diharapkan.

Identifikasi mikroba adalah suatu proses yang bertujuan untuk mengetahui

bentuk, sifat-sifat maupun morfologi dari sauatu mikroba atau dengan kata lain untuk
memperlihatkan bagian-bagian sel mikroba. Identifikasi mikroba dapat dilakukan
dengan metode pewarnaan gram. Metode pewarnaan gram adalah suatu teknik atau
metode pewarnaan yang paling luas digunakan untuk identifikasi bakteri. Metode ini
merupakan metode pewarnaan diferensial yang menggunakan lebih dari satu zat warna.
Metode Pewarnaan gram adalah salah satu metode yang bertujuan untuk
mengidentfikiasi mikroba berdasarkan kemampuannya dalam menyerap zat warna.
Metode ini merupakan salah satu teknik pewarnaan yang paling sering digunakan
dalam mengidentifikasi bakteri. Pada metode ini, olesan bakteri yang telah difiksasi
dikenai larutan-larutan zat warna seperti kristal violet, larutan yodium, larutan akohol,
dan zat pewarnaan tandinganya berupa zat warna safranin atau air fucshin. Bakteri yang
telah diwarnai dengan metode ini terbagi menjadi dua kelompok yaitu, bakteri gram
positf dan bakteri gram negatif. Pada bakteri garam positif, bakteri akan
mempertahankan zat warna kristal violet karenanya akan tampak berwarna ungu tua di
bawah mikroskop. Sedangkan bakteri gram negatif akan kehilangan zat warna kristal
violet setelah dicuci dengan alkohol dan akan mengikat zat pewarna tandingnya yaitu
safranin dan akan tampak berwarna merah pada pengamatan dengan mikroskop,
dimana perbedaan pengikatan zat warna ini di sebabkan oleh perbedaan komponen
penyusun dinding selnya.

Media adalah suatu campuran bahan yang mengandung nutrisi untuk

membiakan/menumbuhkan, mempertahankan, dan menyeleksi bakteri yang dibiakkan
secara invitro (diluar tubuh) sehingga dapat diketahui jenis bakterinya. Adapun jenis-
jenis media, yaitu,

 berdasarkan bentuknya: media padat, semipadat, dan cair;

 berdasarkan susunannya: media sintesis, semisintesis, dan alami;
 berdasarkan sifatnya: media diferensia, selektif, pengaya, enumerasi, dan
penguji.

A. Media
 Media TSIA

Media TSIA tergolong media padat (berdasarkan bentuknya), media

semisintesis (berdasarkan susunannya), dan media diferensial (berdasarkan
sifatnya). Media padat biasanya digunakan untuk mengamati morfologi koloni
dan mengisolasi biakan murni. Media semisintetis merupakan media yang
tersusun oleh campuran bahan alami dan bahan sintetis. Sedangkan media
diferensial adalah media yang digunakan untuk menumbuhkan mikroba tertentu
serta penentuan sifat-sifatnya. Sebagai differensial medium, pertumbuhan
bakteri memberikan koloni yang spesifik untuk masing-masing spesies yang
didasarkan pada perubahan-perubahan secara kimiawi (Anonim, 2012). Uji
Triple Sugar Iron Agar (TSIA) merupakan metode yang digunakan untuk
melihat kemampuan mikroorganisme dalam memfermentasikan gula. Medium
TSIA mengandung 3 macam gula, yaitu glukosa, laktosa, dan sukrosa. Terdapat
juga indikator fenol merah serta FeSO4 untuk memperlihatkan pembentukan
H2S yang ditunjukkan dengan adanya endapan hitam. Konsentrasi glukosa
 adalah 1/10 dari konsentrasi laktosa atau sukrosa agar fermentasi glukosa saja
yang terlihat (Anonim, 2012).

Media Triple Sugar Iron Agar

Untuk membuat media TSIA ditimbang bubuk TSI dengan neraca analitik.
Bubuk TSI dimasukkan ke erlenmeyer lalu dilarutkan dengan aquades. Larutan media
dipanaskan dengan menggunkan kompor listrik dan diaduk hingga larut sempurna.
Dicek pH menggunakan pH stick, pH media TSI adalah 7,4. Media dimasukkan ke
tabung reaksi, masing-masing 5 ml dengan menggunakan pipet ukur. Tabung ditutup
dengan kapas berlemak, aluminium foil, dan diikat dengan benang pulung. Larutan
media disterilisasi dengan autoclave. Tabung reaksi diletakkan dalam posisi miring
hingga media membeku. Media siap digunakan.
TSI Agar merupakan media untuk melihat kemampuan suatu mikroorganisme
dalam memfermentasikan gula. TSIA digunakan untuk pengujian biokimia untuk
membedakan beberapa jenis bakteri yang termasuk kelompok Enterobacteriaceae yang
bersifat gram negatif dan memfermentasikan glukosa kemudian membentuk asam,
sehingga dapat dibedakan dengan bakteri gram negatif lain. Perbedaan ini didasarkan
pada pola fermentasi karbohidrat dan produksi H2S pada tabung reaksi. Media ini
memiliki 3 gula dalam kandungannya, yaitu glukosa, laktosa, dan sukrosa, dengan
konsentrasi 1% sukrosa, 1% laktosa, dan 0,1% glukosa. Konsentrasi ini akan
berpengaruh terhadap penggunaan karbohidrat dan keadaan asam yang terbentuk.
Indikator pH, yaitu Phenol Red, ditambahkan untuk menunjukkan adanya perubahan
pH akibat fermentasi karbohidrat. Adapun komposisi yang terkandung dalam media
TSI Agar beserta fungsinya:

 Lab-Lemco powder 3,0 g, sebagai sumber vitamin B bagi mikroorganisme;

 Yeast extract 3,0 g, sebagai sumber nitrogen;
 Peptone 20,0 g, sebagai sumber energi/nutrisi bagi mikroorganisme;
 Sodium Chloride 5,0 g, sebagai pengatur keseimbangan tekanan osmosis/bahan
buffer media;
 Ferri Citrace 0,3 g, sebagai penerima elektron yang dapat memperlihatkan
pembentukan H2S oleh bakteri dan juga sebagai bahan buffer;
 Sodium thiosulphate 0,3 g, sebagai sumber mineral dan energy bagi
mikroorganisme;
 Phenol red 0,5 g, sebagai indikator;
 Agar, sebagai bahan pemadat media dan tempat tumbuhnya mikroorganisme;
 Glucose 10,0 g, sebagai sumber karbohidrat yang akan difermentasikan oleh
mikroorganisme;
 Lactose 10,0 g, sebagai sumber karbohidrat yang akan difermentasikan oleh
bakteri;
 Sucrose 10,0 gr, sebagai sumber karbohidrat yang akan difermentasikan oleh
bakteri
 EMBA

Media Eosin Methylene Blue Agar adalah hasil modifikasi dari Levine M.
(1918-1921) yang digunakan untuk diferensiasi Escherichia coli dan Enterobacteria
aerogenes, untuk identifikasi cepat dari Candida albicans, dan untuk
identifikasi Staphylococcus koagulase-positif. Media yang sudah jadi dirumuskan
secara spesifik oleh APHA (American Public Health Association) (1970-1992). Media
ini dibuat dan dirumuskan dengan tujuan untuk mendeteksi dan membedakan
mikroorganisme dari kelompok bakteri coliform.

 Media EMB

Media EMB Agar agar yang memiliki karakteristik sebagai berikut :

 Berdasarkan sifat fisiknya media EMB Agar merupakan media padat atau solid
karena mengandung agar sekitar 15g /liter sehingga setelah dingin media akan
menjadi padat.

 Berdasarkan kandungan bahannya media EMB Agar merupakan media sintetis

karena komposisinya tersusun dari bahan-bahan kimia yang telah diketahui
komposisinya secara pasti.
 Berdasarkan tujuan pembuatannya media EMB Agar merupakan media selektif
diferensial untuk menubuhkan bakteri gram negatif dari
golongan Enterobacteriaceae.
 Media EMB Agar yang masih berupa serbuk memiliki warna ungu berbentuk
serbuk dan media yang sudah jadi berwarna ungu gelap dengan konsistensi
padat.
 Berdasarkan jenisnya media EMB Agar merupakan media plate, karena dicetak
di dalam petridisk steril.
 Media EMB Agar memiliki pH asam yaitu pH 6.8 ± 0,2.

FUNGSI MEDIA EOSIN METHYLENE BLUE AGAR

Secara umum media EMB agar adalah media isolasi untuk
membedakan bakteri Enterobacteriaceae. EMB Agar adalah media yang
digunakan untuk mengetahui ada atau tidaknya bakteri coliform di dalam suatu
sample. Media Eosin Methylene Blue Agar ini mempunyai keistimewaan
mengandung laktosa dan berfungsi untuk membedakan mikroba yang
memfermentasikan laktosa seperti S. aureus, P. aerugenosa, dan Salmonella.
Mikroba yang memfermentasi laktosa menghasilkan koloni dengan inti
berwarna gelap dengan kilap logam. Sedangkan mikroba lain yang dapat
tumbuh koloninya tidak berwarna. Fungsi dari eosin dan metilen blue
membantu mempertajam perbedaan warna. Namun demikian, jika media ini
digunakan pada tahap awal, kuman lain bisa juga tumbuh terutama P.
Aerugenosa dan Salmonella sp. Hal ini dapat menimbulkan keraguan.
Bagaiamanapun media ini sangat baik untuk mengkonfirmasi bahwa
kontaminan tersebut adalah E.coli. Media ini berbentuk padat berguna untuk
menjaga sel tidak berpindah tempat sehingga akan mudah dihitung dan
dipisahkan jenisnya ketika tumbuh menjadi koloni. Media padat juga
menampakkan difusi hasil metabolit bakteri sehingga memudahkan dalam
pengujian suatu hasil metabolit.
Komponen-komponen Media EMB
Komposisi dari EMB Agar secara umum terdiri dari sumber nutrisi atau zat
makanan dan komposisi media pertumbuhan. Salah satu media EMB Agar yang
 diproduksi oleh pabrik yang biasa digunakan di laboratorium adalah media
EMB Agar dengan merk Oxoid CM0069, terdiri dari komponen :

 Peptone : 10.0 g/L

 Lactose : 10.0 g/L
 Dipotassium hydrogen phosphate : 2.0 g/L
 Eosin : 0.4 g/L
 Methylene blue : 0.065 g/L
 Agar : 15.0 g/L
FUNGSI KOMPONEN PENYUSUN MEDIA
Adapun fungsi dari masing-masing komponen tersebut adalah sebagai berikut :
 Pepton 10 g
Peptone adalah produk hidrolisis protein hewani atau nabati seperti otot, liver,
darah, susu, casein, lactalbumin, gelatin dan kedelai. Komposisinya tergantung
pada bahan asalnya dan bagaimana cara memperolehnya. Sebagai sumber protein
untuk mikroorganisme yang akan dibiakkan.
 Lactose 10 g
Laktosa dan berfungsi untuk memisahkan bakteri yang memfermentasikan laktosa
seperti E.coli, dengan bakteri yang tidak memfermentasi laktosa seperti S. aureus,
Pseudomonas aeruginusae, dan Salmonella. Berfungsi sebagai sumber karbohidrat
untuk pertumbuhan mikroorganisme.
 Di-potassium hydrogen phosphate 21 g
Merupakan garam yang sangat larut dalam air. Bahan ini berfungsi sebagai
pupuk, makanan aditif dan zat penyangga.
 Eosin 0.4 g
Berfungsi sebagai indikator warna.
 Methyline blue 0.06 g
Berfungsi sebagai Indikator warna.
  Agar 15 g

Agar (dari rumput laut) yang berfungsi untuk pemadat media. Agar sulit didegradasi
oleh mikroorganisme pada umumnya dan mencair pada suhu 45⁰C.

Media adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat makanan (nutrisi) yang
diperlukan mikroorganisme untuk pertumbuhannya. Adapun syarat-syarat yang harus
dipenuhi dalam pembuatan media antara lain :

 Media harus mengandung semua nutrisi yang mudah digunakan oleh mikroba.
 Media harus mempunyai tekanan osmosa, tegangan permukaan dan pH yang
sesuai dengan pertumbuhannya.
 Media tidak mengandung zat penghambat kecuali yang sengaja ditambahkan
pada media selektif atau one purpose media.
 Media harus steril
 Temperatur/ suhunya sesuai

Media juga dapat diklasifikasikan menjadi beberapa kelompok diantaranya :

Media berdasarkan konsistensi

 Media padat: Media yang mengandung agar 15% sehingga setelah dingin
media menjadi padat. Contohnya : Urea, KIA,Citrat,TSIA
 Media setengah padat: Media yang mengandung agar 0,3-0,4% sehingga
menjadi sedikit kenyal, tidak padat, tetapi tidak begitu cair. Media semisolid
dibuat dengan tujuan supaya pertumbuhan mikroba dapat menyebar ke seluruh
media tetapi tidak mengalami percampuran sempurna jika tergoyang.
Contohnya : SIM dan Carry and Blair
 Media cair: Media yang tidak mengandung agar, contohnya adalah NB
(Nutrient Broth), LB (Lactose Broth), dan TSB (Trypticase Soy Broth)
 Mac Conkey Agar
Mac Conkey Agar (MCA) adalah suatu jenis media yang digunakan untuk identifikasi
mikroorganisme, yang merupakan medium kultur yang dirancang untuk tumbuhnya
bakteri gram negative dan noda mereka untuk fermentasi laktosa, serta menghambat
pertumbuhan mikroorganisme gram positif. Mac Conkey Agar termasuk dalam media
selektif diferensial bagi mikroba. Jenis mikroba tertentu akan membentuk koloni
dengan ciri tertentu yang khas apabila ditumbuhkan pada media ini. Persenyawaan
utama dalam media ini adalah laktosa, garam empedu, dan neutral red sebagai indicator
warna. Media ini akan menghambat pertumbuhan bakteri gram positif dengan adanya
garam empedu yang akan membentuk kristal violet. Bakteri gram negatf yang tumbuh
dapat dibedakan dalam kemampuannya memfermentasikan laktosa. Koloni bakteri
yang memfermentasikan laktosa berwarna merah bata dan dapat dikelilingi oleh
endapan garam empedu. Endapan ini disebabkan oleh penguraian laktosa menjadi asam
yang akan bereaksi dengan garam empedu.

Bakteri yang tidak memfermentasikan laktosa biasanya bersifat patogen. Golongan

bakteri ini tidak memperlihatkan perubahan pada media. Hal ini menyebabkan warna
koloninya sama dengan warna media. Dimana warna koloni dapat dilihat pada bagian
koloni yang terpisah. Beberapa contoh pertumbuhan koloni pada MCA, adalah sebagai
berikut :
Salmonella dan Shigella : serupa media
Escherichia coli : merah dikelilingi zona keruh
Enterobacter dan Klebsiella : merah muda dan mukoid
Enterococcus dan Staphylococcus : kecil dan tidak terang tembus

 SMAC
Media MacConkey Agar adalah media selektif dan media diferensial yang digunakan
untuk mengisolasi bakteri batang gram negatif berdasarkan kemampuan bakteri
memfermentasi laktosa atau tidak. Media MacConkey Agar digunakan terutama untuk
famili Enterobacteriaceae dan genus Pseudomonas. Media MacConkey Agar
dikembangkan oleh seorang bacteriologist yang bernama Alfred Theodore
MacConkey.
Komposisi Media MacConkey Agar
 Peptone (Pancreatic digest of gelatin) :17 gram
 Proteose peptone (meat and casein) :3 gram
  Lactose monohydrate :10 gram
 Bile salts :1,5 gram
 Sodium chloride: 5 gram
 Neutral red : 0,03 gram
 Crystal Violet :0,001 gram
 Agar :13,5 gram
 Aquadest :1 liter
pH akhir pada media MacConkey agar : 7,1 ± 0,2 pada suhu 25°C
Fungsi Bahan Pada Komposisi Media MacConkey Agar
 Pepton : untuk menyediakan nitrogen, vitamin, mineral dan asam amino
esensial untuk pertumbuhan bakteri.
 Laktosa : untuk menyediakan karbon dan energi serta untuk membedakan
bakteri yang bisa memfermentasi laktosa dengan bakteri yang tidak
memfermentasi laktosa.
 Bile salts (garam empedu): sebagai agen selektif yang berfungsi menghambat
pertumbuhan bakteri gram positif.
 Kristal Violet : sebagai agen selektif yang berfungsi menghambat pertumbuhan
bakteri gram positif.
 Natrium Klorida : untuk menyediakan elektrolit dan keseimbangan osmotik.
 Neutral red : sebagai indikator pH, akan berwarna merah jika pH di bawah ini
6,8. Agar : untuk memadatkan media.

 PCR

Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah metode untuk amplifikasi

(perbanyakan) primer oligonukleotida diarahkan secara enzimatik urutan DNA
spesifik. Teknik ini mampu memperbanyak sebuah urutan 105-106-kali lipat
dari jumlah nanogram DNA template dalam latar belakang besar pada sequence
yang tidak relevan (misalnya dari total DNA genomik). Sebuah prasyarat untuk
memperbanyak urutan menggunakan PCR adalah memiliki pengetahuan,
 urutan segmen unik yang mengapit DNA yang akan diamplifikasi, sehingga
oligonucleotides tertentu dapat diperoleh. Hal ini tidak perlu tahu apa-apa
tentang urutan intervening antara primer. Produk PCR diamplifikasi dari
template DNA menggunakan DNA polimerase stabil-panas dari Thermus
aquaticus (Taq DNA polimerase) dan menggunakan pengatur siklus termal
otomatis (Perkin-Elmer/Cetus) untuk menempatkan reaksi sampai 30 atau lebih
siklus denaturasi, anil primer, dan polimerisasi. Setelah amplifikasi dengan
PCR, produk ini dipisahkan dengan elektroforesis gel poliakrilamida dan secara
langsung divisualisasikan setelah pewarnaan dengan bromida etidium.

PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan suatu teknik perbanyakan (amplifikasi)

potongan DNA secara in vitro pada daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer
oligonukleotida. Primer yang digunakan sebagai pembatas daerah yang diperbanyak
adalah DNA untai tunggal yang urutannya komplemen dengan DNA templatnya.
Proses tersebut mirip dengan proses replikasi DNA secara in vivo yang bersifat semi
konservatif.

PCR memungkinkan adanya perbanyakan DNA antara dua primer, hanya di dalam
tabung reaksi, tanpa perlu memasukkannya ke dalam sel (in vivo). Pada proses PCR
dibutuhkan DNA untai ganda yang berfungsi sebagai cetakan (templat) yang
mengandung DNA-target (yang akan diamplifikasi) untuk pembentukan molekul DNA
baru, enzim DNA polimerase, deoksinukleosida trifosfat (dNTP), dan sepasang primer
oligonukleotida. Pada kondisi tertentu, kedua primer akan mengenali dan berikatan
dengan untaian DNA komplemennya yang terletak pada awal dan akhir fragmen DNA
target, sehingga kedua primer tersebut akan menyediakan gugus hidroksil bebas pada
karbon 3’. Setelah kedua primer menempel pada DNA templat, DNA polimerase
mengkatalisis proses pemanjangan kedua primer dengan menambahkan nukleotida
yang komplemen dengan urutan nukleotida templat. DNA polimerase mengkatalisis
pembentukan ikatan fosfodiester antara OH pada karbon 3’ dengan gugus 5’ fosfat
dNTP yang ditambahkan. Sehingga proses penambahan dNTP yang dikatalisis oleh
enzim DNA polimerase ini berlangsung dengan arah 5’→3’ dan disebut reaksi
 polimerisasi. Enzim DNA polimerase hanya akan menambahkan dNTP yang
komplemen dengan nukleotida yang terdapat pada rantai DNA templat.

PCR melibatkan banyak siklus yang masing-masing terdiri dari tiga tahap berurutan,
yaitu pemisahan (denaturasi) rantai DNA templat, penempelan (annealing) pasangan
primer pada DNA target dan pemanjangan (extension) primer atau reaksi polimerisasi
yang dikaalisis oleh DNA polimerase.

B. Kegunaan

Polymerase Chain Reaction (PCR) dapat digunakan untuk:

1. amplifikasi urutan nukleotida.

2. menentukan kondisi urutan nukleotida suatu DNA yang mengalami mutasi.
3. bidang kedokteran forensik.
4. melacak asal-usul sesorang dengan membandingkan “finger print”.

Metode Indeks MPN

Dalam mikrobiologi air, kehadiran bakteri dapat digunakan sebagai indikator
alami pencemaran. Pengujian mikrobiologi air antara lain:
1. Persumtive Coliforom Test
- Multiple Tube Method/MPN
- Membrane Filtration Method
- Primary Health Care Technique
2. Colony Count
3. Pemeriksaan Streptokokus tinja dan Clostridium Perfingens (Chandra, 2007).
MPN (most probable number) adalah metode enumerasi mikroorganisme yang
menggunakan data dari hasil pertumbuhan mikroorganisme pada medium cair spesifik
 dalam seri tabung yang ditanam dari sampel padat atau cair sehingga dihasilkan kisaran
jumlah mikroorganisme dalam jummlah perkiraan terdekat (Harti, 2015). Bakteri
coliform dalam sumber air merupakan indikasi pencemaran air. Dalam penentuan
kualitas air secara mikrobiologi kehadiran bakteri tersebut ditentukan berdasarkan tes
tertentu yang umumnya menggunakan tabel atau yang lebih dikenal dengan nama MPN
(Most Propable Number). Dasar estimasi ini adalah estimasi jumlah paling
memungkinkan organisme coliform dalam 100cc air (Suriawiria, 2008).
Bakteri coliform yang difermentasi dengan media laktosa akan menghasilkan
gas jika diinkubasi selama lebih dari 48 jam pada suhu 35˚C, itulah dasar dilakukan
metode MPN dengan melihat gas yang dihasilkan dalam tabung reaksi yang kemudian
disesuaikan dengan tabel MPN (Krisna, 2005). Metode MPN terdiri dari 3 langkah,
yaitu :
- Uji Penduga (Presumtive test)
Sampel air diletakkan dalam tabung steril yang berisi Lactose Broth. Beberapa
tabung diinkubasi selama 48 jam pada suhu 35˚C, kemudian diperiksa terbentuknya
gas, karena bakteri akan memfermentasikan laktosa dan menghasilkan gas. Jika gas
tidak terbentuk dalam 24 jam, inkubasi diteruskan hingga 48 jam. Tes penduga
dikatakan positif jika pada tabung terdapat gas yang ditandai dengan terapungnya
tabung durham. Uji ini mendeteksi sifat fermentative coliform dalam sampel dan harus
dikonfirmasi dengan tes konfirmatif untuk menyingkirkan keberadaan organisme lain
yang memberikan hasil positif pada fermentasi laktosa.
- Uji Penegas (Confirmed test)
Tabung positif yang didapatkan dari uji penduga dilanjutkan dengan uji penegas.
Sampel positif yang menunjukkan gas diinokulasi pada media Brilian Green Lactose
Broth, kemudian inkubasi pada suhu 37˚C selama 48 jam. Apabila dihasilkan gas, maka
uji penegas ini dinyatakan positif (Willey, 2008).
- Uji Pelengkap (Complete test)
Uji pelengkap dilakukan dengan menginokulasikan koloni bakteri pada medium
agar dengan cara digoreskan dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35˚C. agar yang
digunakan adalah endo agar dan Eosin Metil Blue (EMB). Pembenihan pada media
agar ini mengakibatkan media agar menjadi bewarna ungu tua dengan kemilau tembaga
metalik dan membentuk koloni dengan pusat gelap (Willey, 2008).

Hasil metode MPN ini adalah nilai MPN, nilai MPN adalah perkiraan jumlah
unit tumbuh (growth unit) atau unit pembentuk koloni (colony forming unit) dalam
sampel. Satuan yang digunakan umumnya per 100cc, makin kecil nilai MPN, maka
makin tinggi kualitas air untuk dikonsumsi. (Permenkes, 2010).
 Angka Lempeng Total (ALT)

Angka lempeng total adalah angka yang menunjukkan jumlah bakteri

mesofil dalam tiap-tiap 1 ml atau 1 gram sampel makanan yang diperiksa. Prinsip
dari ALT adalah menghitung pertumbuhan koloni bakteri aerob mesofil setelah
sampel makanan ditanam pada lempeng media yang sesuai dengan cara tuang
kemudian dieramkan selama 24-48 jam pada suhu 35-37°C (Joko Wibowo
Ristanto, 1989).Uji angka lempeng total merupakan metode yang umum digunakan
untuk menghitung adanya bakteri yang terhadap dalam sediaan yang diperiksa.

Metode penentuan angka lempeng total ini digunakan untuk menentukan

jumlah total mikroorganisma aerob dan anaerob (psikrofilik, mesofilik dan
termofilik) .

a. Psikofilik adalah kelompok mikroorganisme yang hidup pada suhu kurang

dari 20°C,
b. Mesofilik adalah kelompok mikroorganisme yang hidup pada suhu 20 °C-
40°C
c. Termofilik adalah kelompok mikroorganisme yang hidup pada suhu lebih
besar dari 40°C.
Angka lempeng total aerob adalah jumlah mikroorganisma hidup yang
membutuhkan oksigen yang terdapat dalam suatu produk yang diuji. Pertumbuhan
mikroorganisme aerob dan anaerob (psikrofilik, mesofilik dan termofilik) setelah
contoh diinkubasikan dalam media agar pada suhu 35°C ± 1°C selama 24 jam 48
 jam ± 1 jam mikroorganisme ditumbuhkan pada suatu media agar, maka
mikroorganisma tersebut akan tumbuh dan berkembang biak dengan membentuk
koloni yang dapat langsung dihitung.
Populasi bakteri dihitung dengan cara mengencerkan sampel atau bahan uji,
dilanjutkan dengan melakukan inokulasi semua hasil pengenceran didalam media
pelat. Jumlah koloni yang dapat tumbuh pada pelat dihitung secara manual dengan
bantuan “Colony Counter”. Jumlah koloni yang memenuhi ketentuan perhitungan
adalah 25-30 sampai 250-300 koloni pada media pelat.
Metode ini dapat dianggap yang paling sensitive kerena sel hidup yang
dapat terhitung, beberapa jenis mikroorganisme dapat dihitung sekaligus dan dapat
digunakan utuk isolasi dan identifikasi karena koloni yang terbentuk mungkin
berasal dari satu sel induk.
Uji angka lempeng total dapat dilakukan dengan dua teknik, yaitu teknik
cawan tuang (pour plate) dan teknik sebaran (spread plate). Pada prinsipnya
dilakukan pengenceran terhadap sediaan yang diperiksa kemudian dilakukan
penanaman pada media lempeng agar. Jumlah koloni bakteri yang tumbuh pada
lempeng agar dihitung setelah inkubasi pada suhu dan waktu yang sesuai.
Perhitungan dilakukan terhadap petri dengan jumlah koloni bakteri antara 30-300.
Angka lempeng total dinyatakan sebagai jumlah koloni bakteri hasil perhitungan
dikalikan faktor pengenceran.

 Uji KIA (Kligers Iron Agar)

Fungsi dari uji pada midia KIA yaitu untuk mengetahui kemampuan bakteri
untuk memfermentasikan karbohidrat. Pada media KIA berisi 3 macam karbohidrat
yaitu glukosa, laktosa dan sukrosa. Glukosa berada di dasar media sedangkan laktosa
dan sukrosa berada di bagian lereng.
Sulfida indole motility (SIM) adalah media agar semisolid digunakan untuk
menentukan hidrogen sulfida (H 2 S) produksi, pembentukan indol, dan motilitas. SIM
media digunakan untuk membedakan anggota keluarga Enterobacteriaceae.
Kekaburan yang menyebar dari garis menusuk menunjukkan tes positif untuk motilitas.
Tabung harus dibandingkan dengan tabung tanpa inokulasi untuk membedakan antara
kekaburan samar dan motilitas. Sebuah pengembangan warna merah setelah
penambahan reagen Kovács menunjukkan produksi indole. Sebuah endapan hitam
menunjukkan produksi H 2 S. (Anoname,2012)
Media SIM (Sulfide Indole Motility) adalah media differensial. Media ini
digunakan untuk tes kemampuan organisme untuk melakukan beberapa hal yaitu
mengurangi sulfur, menghasilkan indole dan berjalan melalui agar-agar. SIM
umumnya digunakan untuk membedakan anggota Enterobacteriaceae. Sulfur dapat
direduksi menjadi H2S (Hidrogen Sulfida) baik oleh katabolisme asam amino sistem
oleh desulfurase sistem enzim atau dengan pengurangan thiosulphate dalam respirasi
anaerobik. Jika hidrogen sulfida diproduksi maka warna hitam akan terbentuk
dimedia.(Rachel Watson, 2012)