LAPORAN SEMENTARA

PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI AGROINDUSTRI

ACARA II
ISOLASI BAKTERI Rhizobium DARI TANAMAN LEGUMINOSA

Disusun oleh :

Nama : Ahmad Fathullah Afidaputra

NIM : 17/412853/PN/15175
Kelompok : 2
Departemen : Mikrobiologi Pertanian
Asisten : 1. Nur Lailatul Fatichah
2. Arina Permatasari
3. Brigitta Carera Christivanie
Pangestu

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI AGROINDUSTRI

DEPARTEMEN MIKROBIOLOGI PERTANIAN
FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS GADJAH MADA
YOGYAKARTA
2020
 I. PENDAHULUAN
I.1 Latar Belakang
Mikroorganisme rizosfer memainkan peran penting dalam kesehatan dan nutrisi tanaman,
dan interaksi antara tanaman dan mikroorganisme penting untuk pembentukan mikrobioma
akar. Sampai sekarang, interaksi tanaman-mikroba dan mikroba-mikroba di rhizosfer sebagian
besar masih misterius. Telah diketahui bahwa produksi tanaman kacang-kacangan (Phaseolus
vulgaris) dibatasi oleh terjadinya redaman (rhizoctoniosis), yang disebabkan oleh jamur
Rhizoctonia solani. Namun, ko-inokulasi terbukti dapat rhizobacteria pemacu pertumbuhan
tanaman (PGPR) yang terlibat dalam kontrol biologis bersama dengan rhizobia yang
memperbaiki nitrogen diatomik (N2) dapat meningkatkan nutrisi N dan meningkatkan
produksi. Dalam konteks ini, menemukan mikroorganisme dengan efek sinergis yang
melakukan kedua peran ini sangat penting untuk memastikan tingkat hasil yang memadai.
Terdapat pengujian hipotesis bahwa infeksi akar oleh Rhizobium yang memperbaiki
nitrogen memicu reaksi resistensi yang diinduksi oleh enzim, yang mengarah pada produksi
senyawa defensif yang menekan kolonisasi di atas permukaan tanah oleh hama daun.
Mikroorganisme di bawah pengaturan Rhizobiales (yang termasuk genus seperti Rhizobium,
Mesorhizobium, Bradyrhizobium, Azorhizobium, Ensifer, Sinorhizobium dll.) merupakan
legum-nodulating, bakteri gram negatif, milik α-proteobacteria, yang memperkaya tanah
dengan memperbaiki atmosfer N2 dan, oleh karena itu, pegang signifikansi ekologis yang
luas.
I.2 Tujuan
Tujuan dilaksanakannya praktikum mikrobiologi agroindustri acara 2 adalah:
1. Mengetahui cara mengisolasi bakteri Rhizobium.
2. Mampu menumbuhkan isolat bakteri Rhizobium sebagai biakan murni.
 II. TINJAUAN PUSTAKA

Produksi tanaman kacang-kacangan (Phaseolus vulgaris) dibatasi oleh terjadinya

redaman (rhizoctoniosis), yang disebabkan oleh jamur Rhizoctonia solani. Namun, ko-
inokulasi terbukti dapat rhizobacteria pemacu pertumbuhan tanaman (PGPR) yang terlibat
dalam kontrol biologis bersama dengan rhizobia yang memperbaiki nitrogen diatomik (N2)
dapat meningkatkan nutrisi N dan meningkatkan produksi. Dalam konteks ini, menemukan
mikroorganisme dengan efek sinergis yang melakukan kedua peran ini sangat penting untuk
memastikan tingkat hasil yang memadai (Karoney et al., 2020). Pengikat nitrogen secara
simbiotik pada spesies Rhizobium telah dilaporkan dapat memicu reaksi resistensi yang
diinduksi yang bersifat menghambat terhadap antagonis di atas permukaan tanah. Terdapat
pengujian hipotesis bahwa infeksi akar oleh Rhizobium yang memperbaiki nitrogen memicu
reaksi resistensi yang diinduksi oleh enzim, yang mengarah pada produksi senyawa defensif
yang menekan kolonisasi di atas permukaan tanah oleh hama daun (Linnajara et al., 2020).
Mikroorganisme rizosfer memainkan peran penting dalam kesehatan dan nutrisi
tanaman, dan interaksi antara tanaman dan mikroorganisme penting untuk pembentukan
mikrobioma akar. Sampai sekarang, interaksi tanaman-mikroba dan mikroba-mikroba di
rhizosfer sebagian besar masih misterius. Dalam suau studi, struktur komunitas jamur
rhizosphere pertama kali dipelajari dalam percobaan lapangan dengan dua kultivar kedelai
yang berbeda dalam nodulasi yang ditanam dalam dua perawatan inokulasi rhizobium. Setelah
ini, garis inbrida rekombinan (RIL) yang kontras dalam marka di tiga QTL untuk fiksasi
nitrogen biologis (BNF) dievaluasi untuk efek genotipe dan inokulasi rhizobium ke komunitas
jamur rhizosfer seperti yang dinilai menggunakan sequencing amplicon ITS1. Tanaman
kedelai yang diuji di sini tidak hanya menampung komunitas jamur rhizosphere yang berbeda
dari tanah curah, tetapi juga secara khusus merekrut dan memperkaya Cladosporium dari
tanah curah. Komunitas jamur rhizosfer yang dihasilkan bervariasi di antara genotipe kedelai,
dan juga antara perlakuan inokulasi rhizobium. Selain itu, Cladosporium sebagian besar
diperkaya dalam rizosfer genotipe kedelai yang membawa dua atau tiga QTL BNF yang
menguntungkan, menunjukkan hubungan erat antara sifat-sifat kedelai yang terkait dengan
nodulasi dan yang mempengaruhi komunitas jamur rhizosfer. Kesimpulan ini didukung oleh
pengamatan bahwa pengenalan rhizobia eksogen secara signifikan mengubah komunitas
jamur rhizosphere ke titik di mana komunitas-komunitas ini dapat dibedakan berdasarkan
kombinasi genotipe kedelai dan apakah rizobia eksogen diterapkan. Menariknya,
pengelompokan tanaman inang oleh BNF QTL juga membedakan respon komunitas jamur
terhadap inokulasi rhizobium. Secara keseluruhan, hasil ini mengungkapkan bahwa interaksi
crosskingdom yang kompleks ada di antara tanaman inang, bakteri pengikat N2 simbiotik dan
komunitas jamur di rizosfer kedelai (Xu et al., 2020).
Mikroorganisme di bawah pengaturan Rhizobiales (yang termasuk genus seperti
Rhizobium, Mesorhizobium, Bradyrhizobium, Azorhizobium, Ensifer, Sinorhizobium dll.)
merupakan legum-nodulating, bakteri gram negatif, memiliki α-proteobacteria, yang
memperkaya tanah dengan memperbaiki atmosfer N2 dan, oleh karena itu, pegang
signifikansi ekologis yang luas. Tidak semua organisme di bawah ordo ini adalah simbion;
beberapa di antaranya adalah metanotrof sementara yang lain bahkan bersifat patogen.
Aplikasi mereka sebagai bioinokulan dalam pertanian telah diikuti sejak beberapa dekade.
Mereka mengurangi kebutuhan pupuk nitrogen kimiawi serta meningkatkan produktivitas
kacang-kacangan di ladang. Inokulasi rizobial, selain mengarah ke peningkatan nodulasi dan
fiksasi nitrogen, memicu produksi siderofor, fitohormon, dan HCN (Trabelsi et al. 2011, 2012
cit. Hansen, 2017). Ini juga membantu dalam pelarutan fosfat bersama dengan serapan P dan
N (Zahir et al. 2011; Flores-Fe'lix et al. 2013; Yadav and Verma 2014 cit. Hansen, 2017).
Flores-Fe'lix et al. (2013) dalam Hansen (2017) melaporkan strain Rhizobium leguminosarum
yang menghasilkan siderofor dan asam asetat indol, dan fosfat terlarut. Strain ini mampu
menjajah dua tanaman hortikultura, Lactuca sativa L. (selada) dan Daucus carota L. (wortel).
Ketegangan mempromosikan pertumbuhan kedua spesies tanaman serta meningkatkan
penyerapan N dan P di bagian tanaman yang dapat dimakan, sehingga menunjukkan bahwa
itu dapat digunakan sebagai pupuk hayati untuk non-polong-polongan juga. Namun, masalah
pendirian mereka di nodul karena persaingan dengan strain asli sangat penting (Triplett dan
Sadowsky 1992; Toro 1996; Trabelsi et al. 2011 cit. Hansen, 2017). Inokulan yang efektif,
oleh karena itu, harus sangat kompetitif juga (Mrabet et al. 2005; Mnasri et al. 2007; Trabelsi
et al. 2011 cit. Hansen, 2017). Mnasri et al. (2007) dalam Hansen (2017) telah menunjukkan
bahwa strain Rhizobium gallicum 8a3 sangat kompetitif sehubungan dengan hunian nodulnya
dibandingkan dengan strain asli Sinorhizobium meliloti, yang dikenal sebagai simbion
Medicago. Faktanya, strain tersebut memiliki aktivitas antibiotik terhadap strain asli. Karena
inokulan dilepaskan ke lapangan dalam jumlah yang jauh lebih tinggi daripada jumlah aktual
mereka di tanah, dan kebutuhan nutrisi mereka mungkin tumpang tindih dengan komunitas
mikroba, itu akan mengarah pada setidaknya gangguan sementara dari keseimbangan tanah
karena persaingan mereka untuk lokalisasi ceruk. Oleh karena itu, efeknya harus dinilai
sehubungan dengan potensi risiko yang mungkin mereka miliki pada keanekaragaman
mikrofloral penduduk. Keanekaragaman didefinisikan sebagai jumlah spesies yang ada dan
kelimpahan relatifnya (Felske dan Osborn 2005 cit. Hansen, 2017). Jika aplikasi mereka
menyebabkan hilangnya spesies asli yang penting, itu akan mempengaruhi tanaman
berikutnya dan karenanya akan dianggap tidak diinginkan (Trabelsi et al. 2011 cit. Hansen,
2017). Gangguan ini dapat disangga oleh elastisitas ekosistem, resistensi, dan ketahanan, yang
pada gilirannya merupakan konsekuensi dari keanekaragaman dan interaksi tanaman-tanah-
biota (Holling 1973; GrimmandWissel 1997; Kennedy 1999; Reinhart et al. 2003 cit. Hansen,
2017). Karena redundansi bakteri, dampak negatif pada spesies mikroba penduduk tertentu
mungkin tidak secara drastis mengubah fungsi ekosistem (Kennedy 1999; Nannipieri et al.
2003 cit. Hansen, 2017). Ketika inokulasi rhizobial mempengaruhi komposisi microbiome
tanah, itu pada gilirannya mempengaruhi sintesis dan pembebasan enzim dalam rhizosphere
(Antoun dan Pre'vost 2005; Sun et al. 2009; Saharan dan Nehra 2011 cit. Hansen, 2017).
Inokulan rizobial juga telah terbukti memiliki kemampuan menekan patogen pada tanaman
polong dan non-polongan, dengan demikian mengendalikan beberapa penyakit tanaman
(Antoun dan Pre'vost 2005; Huang dan Erickson 2007; Shaban dan El-Bramawy 2011 cit.
Hansen, 2017).
Legum berkontribusi manfaat tidak langsung / langsung ke agroekosistem dan
masyarakat. Manfaat-manfaat ini termasuk :
(1) jasa budaya sistem penanaman produktif;
(2) penyediaan serat, pakan, makanan, dan protein;
(3) pendukung siklus air dan nutrisi, pembentukan tanah, dan produksi oksigen; dan
(4) mengatur perubahan iklim sedang (Chen et al. 2003; Haslmayr et al. 2016 cit.
Meena et al., 2018).
Pertanian intensif mempengaruhi berbagai jasa ekosistem (Lal 2013; Duru et al. 2015 cit.
Meena et al., 2018). Komponen perantara dalam agroekosistem yang berkelanjutan secara
pertanian adalah fauna tanah, daur hara, dan biota tanah (Chen et al. 2003; Kureh dan Kamara
2005 cit. Meena et al., 2018). Dimasukkannya legum dalam sistem tanam dapat memperkuat
layanan ekosistem dengan mempromosikan mikroorganisme tanah yang bermanfaat dan
meningkatkan keanekaragaman hayati tanah. (Meena et al. 2015 cit. Meena et al., 2018).
Selain itu, legum memberikan manfaat bagi tanaman tetangga, dan mereka juga meningkatkan
mineralisasi N dan hubungan air, memastikan perlindungan dari hama, dan mengurangi erosi
tanah (Williams dan Hedlund 2014 cit. Meena et al., 2018). Legum memiliki efek langsung
pada produktivitas tanaman dan memengaruhi keanekaragaman tanaman dan struktur
masyarakat dalam agroekosistem (Lal, 2013 cit. Meena et al., 2018). Selain itu, sistem akar
yang luas dari legum dan sekresi eksudat memiliki efek menguntungkan pada kesehatan tanah
dengan meningkatkan dinamika nutrisi, stabilitas struktural, dan kualitas tanah (Padilla dan
Pugnaire, 2006 cit. Meena et al., 2018). Tanaman legum juga membantu dalam siklus unsur-
unsur utama seperti N, P, dan C (Nees et al. 2010 cit. Meena et al., 2018).
Cowpea (Vigna unguiculata L. Walp) adalah kacang-kacangan biji-bijian makanan
paling penting di Afrika. Cowpea mengangguk oleh bakteri rhizobium di hampir semua tanah
di daerah tropis, tetapi penelitian yang dilakukan pada tahun 1970-an dan 1980-an di Nigeria
menyarankan hanya respons sederhana dari hasil gabah di lapangan untuk inokulasi strain
rhizobium yang dipilih. Baru-baru ini, percobaan yang dilakukan di Brasil menunjukkan
bahwa kacang ini merespons inokulasi rhizobium yang dipilih secara lokal dan hasil gabah
meningkat hingga 30%. Terdapat pengujian beberapa strain Brasil pada kacang tunggak di
sebuah situs di Mozambik utara dan di beberapa situs di Ghana Utara. Aplikasi pupuk
nitrogen mendorong pertumbuhan vegetatif tetapi tidak meningkatkan hasil gabah dan
nodulasi. Karena itu, menanam kacang tunggak dengan strain rhizobium yang sangat efektif
dapat meningkatkan hasil gabah petani kecil di Afrika (Boddey et al., 2017).
Kemurnian koloni diperiksa dengan goresan berulang pada pelat Yeast Extract
Mannitol Agar (YEMA) dan dengan pemeriksaan mikroskopis sel hidup. Pengamatan
mikroskopis dilakukan untuk menyelidiki beberapa karakteristik isolat seperti bentuk dan
reaksi gram. Uji katalase juga dilakukan dengan menggunakan kultur bakteri lama 24 jam di
mana satu koloni bakteri ditempatkan pada kaca slide dan setetes 30% hidrogen peroksida
(H2O2) ditambahkan. Penampilan gelembung gas menunjukkan adanya enzim katalase dalam
bakteri. Budaya murni tumbuh di YEM. Media agar air digunakan untuk pertumbuhan dan
dukungan untuk perkecambahan biji dan pertumbuhan tanaman. Biji disterilkan di permukaan
dengan merendam dalam larutan NaOCl 3,5% selama 5 menit dan kemudian dicuci bersih
dengan air suling steril. Dua benih sehat pilihan dengan ukuran seragam kemudian ditanam
per labu kerucut, dan ditipiskan menjadi satu tanaman per labu kerucut dengan
perkecambahan dan ketinggian yang sebanding antara 1 dan 2 hari setelah tanam. Labu
tanaman diamati setiap hari dan dua kali sehari (jika perlu) selama tahap pertumbuhan
selanjutnya untuk mengukur ketinggian dalam labu. Tidak ada larutan nutrisi standar yang
mengandung makronutrien K, Mg, Ca, dan S, dan mikronutrien Mn, Zn, Cu, B, Mo,
dipertimbangkan untuk penelitian. Labu ditanam di bawah kondisi normal pada suhu kamar
(Rathor et al., 2017).
Koloni Rhizobium yang terbentuk pada media Red Congo-YEMA berwarna putih,
tembus cahaya, berkilau, terangkat dan kecil. Kontaminan umum adalah koloni
Agrobacterium pada media YEMA. Kebanyakan Rhizobia, termasuk Bradyrhizobium, tidak
memiliki kemampuan untuk menyerap Kongo merah, ditambahkan pada konsentrasi akhir
0,0025% (b / v), dari media YEMA (Kneen dan LaRue 1983; Ondieki et al. 2017) sementara
Agrobacterium menyerap Kongo merah dengan mudah dan menjadi merah muda pada
awalnya dan kemudian menjadi hitam pekat (Fentahun et al. 2013; Gambar 1C) (Hossain et
al., 2019). Sedangkan pada media YEMA yang mengandung bromothymol blue diwarnai
dengan strain terisolasi dan diamati baik untuk warna kuning karena produksi asam atau
warna biru karena produksi alkali (Norris, 1965 cit. Dhiman et al., 2019).
 III. METODOLOGI

Praktikum Mikrobiologi Agroindustri Acara II yang berjudul Isolasi Bakteri

Rhizobium dari Tanaman Leguminosa dimulai pada hari Selasa, 3 Maret 2020 di
Laboratorium Mikrobiologi Timur. Cara kerjanya meliputi langkah-langkah sebagai berikut:
Cara Kerja
 DAFTAR PUSTAKA

Boddey, R., Fosu, M., Atakora, W., Miranda, C., Boddey, L., Guimaraes, A., and Ahiabor, B.
2017. Cowpea (Vigna unguiculata) crops in Africa can respond to inoculation with
Rhizobium. Experimental Agriculture 53(4): 578-587
Dhiman, M., Vinay Kumar Dhiman, Neerja Rana and Bhawna Dipta. 2019. Isolation and
characterization of Rhizobium associated with root nodules of Dalbergia sissoo.
International Journal of Current Microbiology Applied Science 8(3): 1910-1918
Ferreira, De Vasconcelos Martins Linnajara, Fernanda De Carvalho, J´Ulia Fonseca Colombo
Andrade, Dˆamiany Padua Oliveira, Fl´Avio Henrique Vasconcelos De Medeiros, and
Fatima Maria De Souza Moreira. 2020. Co-inoculation of selected nodule endophytic
rhizobacterial strains with Rhizobium tropici promotes plant growth and controls
damping off in common bean. Pedosphere 30 (1):98-108
Hansen, Alexander P.. 2017. Rhizobium Biology and Biotechnology. Cham, Springer
Hossain, A., Gunri, S., Barman, M. 2019. Isolation, characterization and purification of
Rhizobium strain to enrich the productivity of groundnut (Arachis hypogaea L.). Open
Agriculture, 4(1) : 400-409
Karoney, E. M., Ochieno, D. M. W., Baraza, D. L., Muge, E. K., Nyaboga, E. N., and
Naluyange, V. 2020. Rhizobium improves nutritive suitability and tolerance of
Phaseolus vulgaris to Colletotrichum lindemuthianum by boosting organic nitrogen
content. Applied Soil Ecology, 149
Meena, Ram Swaroop, Anup Das, Gulab Singh Yadav, and Rattan Lal. 2018. Legumes for
Soil Health and Sustainable Management. New Delhi, Springer
Rathor, Gopal, Bhupendra H Bhargav, K Singh and Davendra Bharti. 2017. Study and effect
of Rhizobium bacteria and culture suspension isolated from root nodules at Nimad Area
Rakesh Patel, The Pharma Innovation Journal 6(9): 368-371
Xu, H., Yang, Y., Tian, Y., Xu, R., Zhong, Y., & Liao, H. (2020). Rhizobium inoculation
drives the shifting of rhizosphere fungal community in a host genotype dependent
manner. Frontiers in Microbiology, 10.