MIKROBIOLOGI IAN L PEPPER

CHAPTER 1
Introduction to Environmental Microbiology

1.1 MIKROBIOLOGI LINGKUNGAN SEBAGAI DISIPLIN

Kami mendefinisikan "mikrobiologi lingkungan" sebagai studi tentang mikroba di semua habitat, dan

dampaknya yang menguntungkan dan merugikan bagi kesehatan dan kesejahteraan manusia.

Mikrobiologi lingkungan terkait dengan, tetapi juga berbeda dari, "ekologi mikroba," yang berfokus

pada interaksi mikroorganisme dalam lingkungan seperti udara, air atau tanah. Perbedaan utama

antara kedua disiplin ilmu adalah bahwa mikrobiologi lingkungan adalah bidang terapan di mana

kami berusaha untuk memperbaiki lingkungan dan memberi manfaat bagi masyarakat. Mikrobiologi

lingkungan juga terkait dengan banyak disiplin ilmu lain (Gambar 1.1). Mikroorganisme terjadi di

mana-mana di Bumi. Tubuh manusia dewasa mengandung sel mikroba 10 kali lebih banyak daripada

sel mamalia, terdiri dari sekitar 1,25 kg biomassa mikroba (Wilson, 2005). Meskipun studi tentang

mikroba penghuni manusia berada dalam mikrobiologi klinis, itu adalah penemuan mikroorganisme

patogen lingkungan yang menginvasi tubuh manusia yang mengakibatkan permulaan mikrobiologi

lingkungan. Akar-akar ini dimungkinkan oleh karya Louis Pasteur dan Robert Koch, yang

mengembangkan Teori Kuman Penyakit pada tahun 1870-an, setelah itu, keberadaan patogen manusia

yang ditularkan melalui air kemudian menjadi fokus awal mikrobiologi lingkungan. Di negara maju,

studi lingkungan terapan terkait dengan minum

pengolahan air dan air limbah secara dramatis mengurangi penyakit yang ditularkan melalui air

bakteri. Namun, agen mikroba lain seperti virus dan protozoa, yang lebih tahan terhadap desinfeksi

daripada bakteri enterik, masih menyebabkan masalah, sehingga kualitas air terus menjadi fokus

utama dalam mikrobiologi lingkungan. Diperkirakan ada 20.000.000 kasus penyakit per tahun karena

minum air yang terkontaminasi (Reynolds et al., 2008). Wabah penyakit yang ditularkan melalui air

terbesar di Amerika Serikat terjadi pada tahun 1993, ketika lebih dari 400.000 orang jatuh sakit dan
sekitar 100 orang meninggal di Milwaukee, Wisconsin, karena parasit protozoa Cryptosporidium

(Eisenberg et al., 2005). Di negara-negara berkembang, sanitasi yang buruk akibat kurangnya air dan

pengolahan air limbah masih menghasilkan jutaan kematian setiap tahunnya. Mengontrol kontaminasi

pasokan makanan kita juga terus menjadi perhatian; dan Centers for Disease Control memperkirakan

bahwa di Amerika Serikat setiap tahun ada 48 juta kasus dengan 128.000 orang dirawat di rumah sakit

dan 3000 kematian. Wabah ketiga yang paling mematikan dari infeksi bawaan makanan di Amerika

Serikat terjadi pada 2011, ketika 29 orang meninggal karena kontaminasi Cantaloupe oleh Listeria.

Kotak Informasi 1.1 mendokumentasikan beberapa wabah bawaan makanan ini. Sampai pertengahan

abad ke-20, bahan kimia industri di Amerika Serikat secara rutin dibuang dengan cara membuangnya

ke saluran pembuangan, tanah, sungai atau lautan, tanpa memperhatikan polusi yang disebabkannya,

atau dampak buruk selanjutnya.

efek ekologis dan kesehatan manusia. Ini semua berubah pada 1960-an ketika kekhawatiran atas

tempat pembuangan racun disorot oleh buku tengara Rachel Carson, Silent Spring. Pada dasarnya, ini

menghasilkan kelahiran gerakan lingkungan di Amerika Serikat, dan bidang studi baru untuk

mikrobiologi lingkungan yang dikenal sebagai "bioremediasi." dampak kesehatan manusia. Namun,

karena hidrokarbon, pelarut terklorinasi dan sebagian besar pestisida bersifat organik, mereka dapat

melakukannya

berpotensi terdegradasi oleh mikroorganisme heterotrofik termasuk bakteri dan jamur. Bidang

bioremediasi dalam mikrobiologi lingkungan melibatkan peningkatan dan optimalisasi degradasi

mikroba dari polutan organik, yang menghasilkan pembersihan lingkungan dan mengurangi efek

buruk pada kesehatan manusia. Kemanjuran bioremediasi ditunjukkan pada tahun 1989, ketika tanker

minyak Exxon Valdez menumpahkan sekitar 11 juta galon minyak mentah ke Pangeran William

Sound. Optimalisasi bioremediasi adalah faktor utama dalam membersihkan dan memulihkan

Pangeran William Sound. Bioremediasi juga terbukti sangat penting dalam membersihkan tumpahan

minyak Teluk Meksiko 2010 yang lebih baru (lihat Bab 31). Juga di abad ke-20, mikrobiologi tanah,
komponen mikrobiologi lingkungan, menjadi penting sebagai sarana untuk meningkatkan produksi

pertanian. Studi tentang rhizosfer (tanah di sekitar akar tanaman), dan studi spesifik tentang interaksi

akar-mikroba yang melibatkan rhizobia pengikat nitrogen, dan jamur mikoriza yang meningkatkan

penyerapan fosfor, semuanya digunakan untuk meningkatkan pertumbuhan tanaman. Studi lain

tentang bakteri pemacu pertumbuhan tanaman yang mengurangi insiden patogen tanaman juga efektif

dalam membantu “Revolusi Hijau,” yang menghasilkan peningkatan hasil panen yang menakjubkan

di seluruh Amerika Serikat dan di banyak bagian dunia. Secara keseluruhan, bidang studi mendasar

ini telah membantu membentuk disiplin mikrobiologi lingkungan saat ini, dan semuanya

memengaruhi kehidupan kita sehari-hari

1.2 PENGARUH MIKROBA TERHADAP KEHIDUPAN HARIAN KAMI

Beberapa pengaruh yang dimiliki mikroorganisme dalam kehidupan kita sehari-hari ditunjukkan pada

Tabel 1.1. Pengaruh-pengaruh ini dapat diringkas dalam hal:

l Kesehatan planet ini secara keseluruhan l Apa yang menginfeksi kita l Apa yang menyembuhkan

kita l Apa yang kita minum l Apa yang kita makan l Apa yang kita hirup

1.2.1 Keseluruhan Kesehatan Planet

Kehidupan di Bumi tergantung pada siklus biogeokimia yang digerakkan oleh mikroba. Sebagai

contoh, karbon dioksida dikeluarkan dari atmosfer selama fotosintesis oleh tanaman dan mikroba

fotosintetik. Hasil dari proses ini adalah bahwa karbon dioksida diubah menjadi blok bangunan

karbon organik sebagai biomassa tanaman atau mikroba, yang akhirnya menghasilkan pembentukan

bahan organik. Untungnya, bahan organik ini akhirnya terdegradasi oleh mikroorganisme melalui

proses pernapasan, yang lagi-lagi melepaskan karbon dioksida ke atmosfer. Tanpa respirasi mikroba,

sejumlah besar bahan organik akan terakumulasi. Proses biogeokimia serupa ada untuk semua elemen

lain, dan juga didorong oleh mikroorganisme. Semua kehidupan di Bumi tergantung pada ini siklus

biogeokimia. Selain itu, siklus ini dapat bermanfaat bagi aktivitas manusia, seperti dalam kasus

remediasi polutan organik dan logam, atau dapat merusak, seperti dalam pembentukan oksida nitrat
yang dapat menguras lapisan ozon Bumi (Ravishankara et al., 2009). Efek tidak langsung utama dari

mikroba lingkungan mungkin adalah pengaruh mikroba tanah terhadap pemanasan global. Namun,

saat ini masih ada perdebatan tentang dampak bersih mikroba pada proses ini (Rice, 2006). Tanah

dapat menjadi sumber "gas rumah kaca" seperti karbon dioksida, metana dan dinitrogen oksida karena

respirasi mikroba, atau mereka dapat menjadi penyerap karbon karena peningkatan aktivitas

fotosintesis dan penyerapan karbon selanjutnya. Meskipun perdebatan belum diselesaikan, jelas

bahwa bahkan perubahan kecil dalam penyimpanan karbon tanah dapat secara signifikan

mempengaruhi keseimbangan karbon global dan pemanasan global. Pada gilirannya, banyak ilmuwan

percaya bahwa pemanasan global yang berkelanjutan pada akhirnya akan memiliki dampak bencana

pada kesehatan manusia melalui peristiwa cuaca ekstrem dan bencana alam.

1.2.2 Apa Yang Menginfeksi Kita

Manusia terkena serangan mikroba dari kebanyakan patogen yang dapat bersifat virus, bakteri atau

protozoa (Tabel 1.2). Demikian juga, rute paparan bervariasi dan dapat melalui konsumsi atau inhalasi

makanan yang terkontaminasi, air atau udara, atau dari kontak dengan tanah atau fomites. Infeksi

yang dihasilkan dari mikroba patogen bisa ringan hingga berat, atau bahkan fatal. Sangat ekstrim

kasus, pandemi dapat terjadi, seperti dalam kasus pandemi influenza 191821919, yang menyebar ke

seluruh dunia dan membunuh lebih banyak orang daripada jumlah yang meninggal dalam Perang

Dunia Pertama (Brundage dan Shanks, 2008). Baru-baru ini, kekhawatiran telah berpusat pada potensi

pandemi yang berasal dari virus avian influenza (H5N1) (Malik Peiris et al., 2007). Secara

keseluruhan, setiap orang di Bumi telah mengalami beberapa bentuk infeksi, dan setiap lokasi di

Bumi dapat menjadi sumber infeksi. Misalnya, rumah sakit yang dirancang untuk menampung pasien

yang baru pulih dari berbagai penyakit dapat menjadi sumber Staphylococcus aureus yang resisten

metisilin (MRSA).

1.2.3 Apa Yang Menyembuhkan Kita

Meskipun banyak mikroba yang bersifat patogen bagi manusia, banyak mikroba lain menyediakan

peti harta karun berupa produk-produk alami yang penting untuk menjaga atau meningkatkan

kesehatan manusia. Kelas senyawa yang paling awal ditemukan adalah antibiotik. Antibiotik adalah

senyawa yang diproduksi oleh mikroorganisme lingkungan yang membunuh atau menghambat

mikroorganisme lainnya. Antibiotik yang ditemukan pertama kali adalah penisilin yang diisolasi dari

jamur Penicillium yang ditanggung oleh tanah oleh Sir Alexander Fleming pada tahun 1929.

Kemudian, Selman Waksman menemukan streptomisin pada tahun 1943, suatu prestasi yang ia terima

dengan Hadiah Nobel. Antibiotik ini diisolasi dari Streptomyces griseus, dan, sejak itu, actinomycetes

tanah telah terbukti menjadi sumber utama antibiotik. Selain bakteri, jamur juga merupakan sumber

produk alami yang membantu kesehatan manusia. Secara khusus, endofit, yaitu mikroba yang

berkoloni pada akar tanaman tanpa efek patogenik, merupakan sumber yang kaya akan antibiotik

baru, antimikotik, imunosupresan, dan agen antikanker (Strobel dan Daisy, 2003). Agen penstabil

mikrotubulus (MSA) seperti paclitaxel telah diisolasi dari jamur endofit yang berasosiasi dengan

spesies pohon yew (Taxus spp.). Karena paclitaxel bertindak sebagai racun sel yang menangkap

pembelahan sel, itu telah menjadi agen antikanker yang sangat kuat (Snyder, 2007). Endofit juga telah

terbukti memiliki aplikasi yang berguna di bidang pertanian dan industri (Mei dan Flinn, 2010).

Sebuah teknologi baru yang dikenal sebagai "penambangan genom" telah menghasilkan penemuan

baru dari produk alami yang bermanfaat. Teknologi molekuler ini memungkinkan untuk

mengidentifikasi produk obat baru yang dihasilkan dari kelompok gen yang biasanya tidak dinyatakan

dalam kondisi laboratorium (Gross, 2009). Pendekatan baru ini menjadi pertanda baik bagi sumber

produk alami baru di masa depan yang akan meningkatkan kesehatan manusia.

1.2.4 Apa Yang Kita Minum

Mikroba lingkungan juga mempengaruhi kualitas air yang kita minum, baik secara langsung maupun

tidak langsung. Efek samping langsung dapat mencakup kontaminasi air permukaan atau air tanah

dengan mikroorganisme patogen. Mikroba juga dapat memperburuk kontaminasi kimiawi air, seperti
dalam kasus arsenik. Secara khusus, beberapa mikroba tanah menggunakan arsenate sebagai akseptor

elektron terminal di bawah kondisi anaerob, sehingga mengubah arsenat menjadi arsenit yang

merupakan spesies yang lebih beracun dan bergerak yang lebih mungkin mencemari air tanah

(National Research Council, 2007). Di sisi lain, mikroba

juga dapat secara tidak langsung melindungi kualitas air, seperti melalui degradasi organik beracun di

Zona Kritis yang melindungi air tanah (Lin, 2010). 1.2.5 Apa Yang Kita Makan Tanah adalah

persyaratan mendasar untuk produksi makanan karena sebagian besar makanan yang ditanam untuk

konsumsi manusia atau hewan berasal dari tanah. Tanah yang dekat dengan akar tanaman dikenal

sebagai rizosfer, yang mengandung sejumlah besar mikroorganisme tanah yang penting untuk

pertumbuhan tanaman. Tanpa organisme rizosfer, pertumbuhan tanaman sangat tertekan, karena

mikroba yang menguntungkan meningkatkan penyerapan nutrisi. Selain itu, bakteri tanah tertentu

yang dikenal sebagai rhizobia memperbaiki nitrogen atmosfer menjadi amonia untuk tanaman

polongan, dan jamur mikoriza meningkatkan penyerapan fosfat tanaman. Efek buruk dari

mikroorganisme pada apa yang kita makan juga termasuk kontaminasi dengan mikroba patogen dan

racun mikroba (Informasi Kotak 1.1). 1.2.6 Apa Yang Kita Bernafas Mikroba dapat aerosol melalui

aktivitas alami dan manusia. Manusia mempengaruhi transportasi mikroba aerosol melalui berbagai

kegiatan termasuk, misalnya, aplikasi limbah tanah. Pengenalan menara pendingin dan pancuran air

panas juga menciptakan rute bagi paparan bakteri Legionella aerosol yang dapat menyebabkan infeksi

yang mengancam jiwa. Dengan sebanyak 80% dari waktu kita sekarang dihabiskan di dalam ruangan,

kualitas udara di lingkungan ini juga dapat mengakibatkan "sindrom bangunan sakit" dan serangan

asma. Alergen turunan mikroba juga siap diangkut ke dan melalui udara. Mikotoksin yang diproduksi

oleh jamur tanah termasuk Aspergillus, Alternaria, Fusarium dan Penicillium dapat menyebabkan

berbagai masalah kesehatan. Sebagai contoh, aflatoksin yang diproduksi oleh Aspergillus flavus

adalah karsinogen kuat (Williams et al., 2004). 1.3 MIKROBIOLOGI LINGKUNGAN DI 2014
Masalah terus muncul di mana solusi tergantung pada pemahaman tentang mikrobiologi lingkungan.

Misalnya, wabah flu burung mengangkat kekhawatiran tentang pandemi di seluruh dunia, dengan

sedikit harapan untuk segera mengembangkan vaksin. Informasi yang lebih baik diperlukan tentang

bagaimana virus ini menyebar melalui lingkungan dari satu orang ke orang lain, untuk

mengembangkan intervensi yang berhasil. Menjadi jelas bahwa sedikit yang diketahui tentang

seberapa penting rute penularan terjadi (yaitu, udara vs fomit vs air), dan bagaimana mereka

memengaruhi transmisi

virus influenza. Sangat penting bahwa rute paparan ini dipahami lebih baik sehingga kontrol

lingkungan yang tepat dapat dikembangkan. Pada tahun 2010, pelepasan minyak Teluk Meksiko

setelah ledakan pada anjungan minyak menghancurkan ekonomi masyarakat setempat, tetapi

bioremediasi yang meningkat dan intrinsik sangat penting dalam mengurangi bahaya (Gambar 1.2)

Pada tahun 2011, galur baru yang mematikan dari E. coli ( O104: H4) adalah sumber wabah mikroba

bawaan makanan di Jerman yang menewaskan lebih dari 50 orang (Rasko et al., 2011). Sebagai

catatan positif, teknik dan metodologi baru membantu upaya kami untuk mengandung kontaminan

mikroba yang merugikan (Kotak Informasi 1.2). Teknik molekuler baru termasuk qPCR (reaksi

berantai polimerase kuantitatif) memungkinkan pendeteksian patogen “hampir real-time”. Pelacakan

sumber mikroba sekarang memungkinkan kita untuk menemukan sumber kontaminasi mikroba.

Sensor baru memungkinkan kita untuk memantau kualitas air mikroba secara real time. Kemajuan

dalam penilaian risiko mikroba kuantitatif sekarang memungkinkan kita untuk menentukan apakah

kegiatan tertentu seperti aplikasi lahan biosolids dan kotoran hewan adalah "aman." keanekaragaman

mikroba di lingkungan, dan mengeksploitasi keanekaragaman itu untuk sumber baru produk alami.

Kemajuan dalam sintesis DNA dan teknologi transplantasi memungkinkan pembangunan

"mikroorganisme sintetis" dan dapat merevolusi pendekatan kami untuk mengkarakterisasi dan

menambang genom mikroorganisme lingkungan. Permukaan self-sanitizing berpotensi menyediakan

desinfeksi proaktif yang akan mengurangi infeksi mikroba. Secara keseluruhan, bidang mikrobiologi

lingkungan sudah matang, namun terus berkembang, dan memiliki posisi yang baik untuk

menghadapi berbagai masalah mikroba yang dihadapi masyarakat saat ini (dan masa depan).

Bergabunglah bersama kami dalam perjalanan yang mengasyikkan saat kami memeriksa keadaan

sains.

Chapter 2
Microorganisms Found in the Environment

Mikroorganisme selain virus dapat didefinisikan sebagai organisme lepas yang sangat kecil sehingga

tidak dapat dilihat dengan mata telanjang. Secara umum, kisaran ukuran ini kurang dari 100 μm,

tetapi mendefinisikan mikroba hanya dalam hal ukuran dapat membingungkan karena beberapa

mikroba dapat dilihat dengan mata telanjang dan lebih besar dari 100 μm dalam ukuran. Contoh-

contoh mikroba yang lebih besar termasuk beberapa protozoa, dan bakteri seperti Epulopiscium

fishelsoni. Jamur tentu cukup besar untuk dilihat dengan mata telanjang, namun diklasifikasikan

sebagai jamur. Virus juga memperumit gambaran karena, meskipun mereka kecil (10 100 nm),

mereka tidak lepas dan tidak bermetabolisme. Meskipun terdapat anomali ini, mikroba yang

ditemukan di lingkungan umumnya dianggap terdiri dari: Bakteri (termasuk aktinomisetes); Archaea;

Jamur; Protozoa; Alga; dan Virus. Mikroba yang berasal dari lingkungan, yang meliputi tanah, air dan

udara, dicirikan sebagai mampu beradaptasi dengan kondisi lingkungan yang bervariasi seperti suhu,

potensial redoks, pH, rezim kelembaban dan tekanan. Ini membedakan mereka dari mikroba yang

ditemukan di dalam tubuh manusia yang ada di bawah kondisi yang jauh lebih konstan, dan yang

biasanya tidak bertahan hidup ketika dimasukkan ke lingkungan. Mikroorganisme juga mampu hidup

dalam kondisi oligotropik (nutrisi rendah), pada dasarnya hidup

dalam kondisi kelaparan. Karakteristik ini memungkinkan mikroba dapat ditemukan di setiap habitat

yang dapat dibayangkan termasuk gurun dan hutan, dan bahkan dalam kondisi Arktik. Dalam bab ini
kami memperkenalkan berbagai jenis mikroba yang ditemukan di lingkungan termasuk fitur struktural

dan beberapa fungsi dan dampak utama mereka, tidak hanya pada kesehatan dan kesejahteraan

manusia, tetapi juga pada lingkungan. Untuk menempatkan pentingnya mikroba dalam perspektif,

menarik untuk menyadari bahwa mereka pertama kali muncul di Bumi sekitar 4 miliar tahun yang

lalu, dan telah kritis terhadap pembentukan kondisi global saat ini, termasuk keberadaan oksigen

molekul bebas yang pertama kali muncul sekitar 2,5. miliar tahun lalu. Informasi tambahan dan latar

belakang tentang jenis-jenis mikroba ini dapat ditemukan dalam buku-buku teks dalam bacaan yang

disarankan yang tercantum di akhir bab ini.

2.1 KLASIFIKASI ORGANISME

Sampai tahun 1970-an, klasifikasi makro dan mikroorganisme terutama didasarkan pada perbedaan

fisiologis dengan mana saja dari dua hingga enam kerajaan besar yang diusulkan untuk

mengkategorikan kehidupan seperti yang kita kenal. Namun, pada 1970-an, teknik menjadi tersedia

untuk memungkinkan pemeriksaan asam nukleat, termasuk RNA ribosom (rRNA), yang merupakan

struktur yang sangat dilestarikan yang digunakan untuk sintesis protein pada makhluk hidup.

Berdasarkan analisis 16S rRNA, Carl Woese mengidentifikasi kelompok organisme yang sama sekali

baru - Archaea (Woese and Fox, 1977) - yang akhirnya mengarah pada klasifikasi modern organisme

hidup ke dalam sistem tiga domain yang terdiri dari Archaea, Eukarya dan Bacteria ( Gambar 2.1).

Dari jumlah tersebut, Bakteri dan Archaea disebut prokariota, dan Eukarya dikenal sebagai eukariota.

Mikroba eukariotik selain ganggang dan jamur secara kolektif disebut protista. Di dalam Eukarya ada

jamur, protozoa, ganggang, tanaman, hewan, dan manusia.

2.2 PROKARYOT

Prokariota adalah organisme yang paling sederhana dan ditandai oleh kurangnya inti sejati dan ikatan

membran organel sel, seperti mitokondria atau kloroplas. Prokariota terdiri dari dua kelompok besar

yang terpisah, Bakteri dan Archaea. Fitur struktural prokariota ditunjukkan pada Kotak Informasi 2.1.

2.2.1 Bakteri
Bakteri adalah mikroorganisme hidup yang paling tidak kompleks tetapi menawarkan fleksibilitas

metabolisme terbesar dan memiliki keragaman terbesar. Mereka mendominasi berbagai proses

lingkungan yang penting tidak hanya bagi manusia, tetapi juga bagi lingkungan (seperti fiksasi

nitrogen); namun, mereka juga memasukkan beberapa patogen manusia, hewan, dan tumbuhan yang

paling terkenal. Diperkirakan ada lebih dari 50 filum bakteri berdasarkan analisis sekuens 16S rRNA

yang dilestarikan (Schloss dan Handelsman, 2004). Sekitar setengah dari filum ini belum dikultur.

Dengan demikian, kita tahu sedikit tentang mayoritas bakteri lingkungan, dan diskusi yang mengikuti

berkaitan dengan sel-sel yang telah berhasil dikultur. Bakteri yang tumbuh di laboratorium rata-rata

berdiameter 0,5 1 μm dan panjang 1 2 μm dan memiliki komposisi dasar yang ditunjukkan pada Tabel

2.1. Mereka umumnya dicirikan oleh tingkat replikasi yang tinggi (Escherichia coli dapat mereplikasi

dengan pembelahan biner dalam waktu kurang dari 10 menit), rasio luas permukaan-terhadap-volume

yang tinggi dan kelenturan genetik. Mereka memiliki satu kromosom lingkaran besar yang terletak di

sitoplasma dan tidak ada kompartementalisasi sel (Gambar 2.2). Kesederhanaan relatif dari sel bakteri

memungkinkannya untuk merespon dan beradaptasi dengan cepat terhadap perubahan kondisi

lingkungan. Actinomycetes secara teknis diklasifikasikan sebagai bakteri, tetapi cukup unik sehingga

dapat didiskusikan dan sering disebut sebagai kelompok individu. Apa yang membedakan

actinomycetes dari bakteri khas lainnya adalah kecenderungan mereka untuk bercabang menjadi

filamen atau hifa yang secara struktural menyerupai hifa jamur, hanya lebih kecil di alam. Secara

keseluruhan, actinomycetes adalah organisme Gram-positif yang sangat lazim di tanah.

Actinomycetes adalah produsen antibiotik yang penting, dan juga bertanggung jawab untuk produksi

geosmin, yang dapat menyebabkan masalah bau pada air minum.

2.2.2 Amplop Sel Bakteri

Bakteri yang telah dikultur dapat dipisahkan secara struktural menjadi dua kelompok besar

berdasarkan arsitektur sel amplopnya: Gram positif atau Gram negatif (Gambar 2.3). Perbedaan

arsitektur utama ini membantu menentukan strategi untuk bertahan hidup di lingkungan. Misalnya,
dinding sel tebal bakteri Gram-positif, seperti pada Bacillus dan Clostridium, membantu mereka

menahan kondisi fisik keras yang ditemukan di lingkungan tanah. Di sisi lain, arsitektur sel amplop

yang lebih kompleks pada bakteri Gram-negatif seperti Pseudomonas dan Shewanella tampaknya

membantu mikroba ini dalam berinteraksi dengan permukaan mineral dan zat terlarut di lingkungan

untuk mendapatkan nutrisi yang dibutuhkan untuk metabolisme. Mulai dari sisi interior sel

pembungkus, kedua jenis bakteri ini memiliki membran sitoplasma yang tidak dapat ditembus oleh

banyak nutrisi yang dibutuhkan sel untuk pertumbuhan dan produksi energi (Gambar 2.4). Akibatnya,

tertanam di seluruh membran sitoplasmik adalah protein spanning membran khusus untuk

pengangkutan molekul masuk dan keluar sel. Protein ini mengubah membran sitoplasma menjadi

struktur semi permeabel yang memisahkan sitoplasma dari bagian luar sel.

Fungsi penting lainnya dari membran sitoplasma dan protein yang melekat adalah transportasi

elektron dan pembangkit energi untuk sel, serta biosintesis molekul struktural dan metabolit sekunder

seperti antibiotik yang diekspor dari sel. Pindah ke bagian luar amplop sel, kedua jenis bakteri

memiliki dinding sel yang terbuat dari peptidoglikan yang berada di luar membran sitoplasma. Salah

satu fungsi penting dari dinding sel adalah untuk mempertahankan bentuk dan integritas sel sehingga

menimbulkan berbagai morfologi bakteri mulai dari bacillus (batang) dan coccus (bundar) hingga

spirillum (memutar), vibrio (berbentuk koma) dan bahkan bakteri yang menguntit. Dinding sel terdiri

dari unit berulang asam N-acetylmuramic (NAM) dan N-acetylglucosamine (NAG) yang saling

menempel melalui ikatan silang peptida (Gambar 2.3). Jaringan NAMNAG ini membentuk struktur

berpori kaku yang secara bebas memungkinkan molekul sebesar, 15.000 MW untuk mendapatkan

akses ke atau

berdifusi menjauh dari membran sitoplasma. Pada bakteri Gramnegatif, dinding sel adalah lapisan

NAM-NAG tipis yang diapit antara ruang periplasmik dan membran luar (Gambar 2.3). Ruang

periplasma didefinisikan dengan baik dan mengandung protein transpor, protein pemberi sinyal dan

enzim degradatif yang mendukung pertumbuhan dan metabolisme. Melanjutkan perjalanan menuju
bagian luar amplop sel Gram-negatif, ada membran kedua yang disebut membran luar yang melekat

pada dinding sel oleh lipoprotein. Selebaran bagian dalam membrane luar secara struktural mirip

dengan membran sitoplasma, sedangkan selebaran luar mengandung lipopolisakarida imunogenik

(LPS) yang memanjang dari sel ke lingkungan. LPS menganugerahkan muatan negatif ke sel, dan

memiliki sifat antigenik (menyebabkan respons imun) dan endotoksik (berpotensi toksik bagi manusia

dan hewan). Membran luar memiliki berbagai fungsi. Ini bertindak sebagai penghalang difusi

terhadap molekul besar seperti

antibiotik; mengandung reseptor fag dan terlibat dalam proses konjugasi (pertukaran DNA); ia

memiliki sistem penyerapan nutrisi tertentu, mis., untuk zat besi, vitamin dan gula; mengandung pori-

pori difusi pasif yang memungkinkan masuknya substrat dengan berat molekul rendah; dan, akhirnya,

memberikan perlindungan untuk protein periplasma.

Pada bakteri Gram-positif, dinding sel terdiri dari banyak lapisan peptidoglikan yang ditumpuk untuk

membentuk struktur tebal. Selain itu, ada asam teichoic yang terikat secara kovalen yang bermuatan

negatif, polimer gliserol atau ribitol yang bergabung dengan gugus fosfat yang memanjang keluar dari

permukaan dinding sel. Mereka antigenik dan membantu memediasi interaksi sel, mis., adhesi

permukaan, dengan lingkungan dan mikroorganisme lainnya. Untuk bagian dalam dinding sel, ada

ruang periplasmik (jauh lebih tidak terdefinisi dengan baik daripada bakteri Gram-negatif), yang baru-

baru ini diidentifikasi dalam beberapa mikroba Grampositif, dan diduga terlibat dalam sintesis

peptidoglikan (Matias dan Beveridge, 2006).

2.2.3 Sitoplasma Bakteri

Replikasi sel dan sintesis protein berpusat di sitoplasma sel, matriks mirip gel yang kompleks yang

terdiri dari air, enzim, nutrisi, limbah dan gas, serta ribosom yang bertanggung jawab untuk sintesis
protein, kromosom melingkar tunggal, dan jumlah sirkuler kecil yang bervariasi. plasmid tambahan

berkisar hingga beberapa ribu pasangan basa (kbp) (Gambar 2.2). Kromosom terlokalisasi dalam

sitoplasma di daerah yang disebut nukleoid. Ukuran kromosom bakteri rata-rata 4 juta pasangan basa

(Mbp) dan mengkodekan beberapa ribu gen (lihat Kotak Informasi 2.2). Ini adalah fitur luar biasa dari

kemasan yang memungkinkan kromosom masuk ke dalam wilayah nukleoid. Ketika direntangkan,

kromosom memiliki panjang sekitar 1,3 mm dibandingkan dengan sel yang berukuran 1 2 μm.

Dengan demikian, sel menggunakan sejumlah protein yang diatur secara ketat termasuk nukleoid

kecil yang terkait ("seperti histone")

protein dan pemeliharaan struktural kompleks kromosom (SMC) untuk melilit, menekuk dan akhirnya

memadatkan kromosom sehingga masuk ke dalam sel, tetapi belum tersedia untuk replikasi,

terjemahan (sintesis messenger RNA) dan rekombinasi (penyusunan ulang gen)

(Thanbichler dan Shapiro, 2006). Prestasi ini bahkan lebih mengesankan ketika seseorang

menganggap bahwa dalam sel yang tumbuh aktif, mungkin ada dua hingga empat salinan kromosom

yang secara aktif direplikasi pada saat yang sama. Plasmid adalah sekuens DNA yang terpisah dari

kromosom. Biasanya, plasmid menyandikan gen yang tidak wajib untuk pertumbuhan dan

pembelahan sel tetapi itu sering membuat sel lebih kompetitif dalam niche tertentu di lingkungan.

Plasmid sering hanya dipertahankan jika ada tekanan selektif, seperti adanya antibiotik untuk

mempertahankan plasmid yang memberikan resistensi antibiotik. Hubungan antara plasmid dan

kromosom kompleks karena beberapa plasmid dapat berintegrasi ke dalam kromosom selama

replikasi dan berfungsi sebagai bagian dari kromosom. Selama replikasi kemudian, proses ini dapat

dibalik, dengan DNA plasmid dikeluarkan dan dibiarkan berfungsi sebagai entitas yang mereplikasi

diri di dalam sel. Beberapa fungsi yang lebih penting dari plasmid ditunjukkan dalam Kotak Informasi

2.3. Plasmid bersifat otonom karena jumlah salinan plasmid, atau jumlah plasmid yang identik per sel,

biasanya tidak tergantung pada jumlah salinan kromosom. Plasmid juga dapat dikeluarkan, yang

berarti bahwa elemen genetik aksesori tidak penting untuk pertumbuhan organisme di lingkungan
normalnya. Plasmid memiliki ukuran mulai dari 10 hingga 1000 kbp, dan bakteri dapat menampung

satu atau beberapa plasmid yang berbeda dengan jumlah salinan yang bervariasi. Jenis plasmid

ditunjukkan dalam Kotak Informasi 2.4. Ribosom adalah ciri khas lain dari sitoplasma. Ribosom

mentranskripsi RNA messenger menjadi protein yang membawa metabolisme dasar sel. Ribosom

terdiri dari subunit besar (50S) dan kecil (30S) yang masing-masing mengandung RNA ribosom

(rRNA) dan protein. Pentingnya RNA ribosomal diilustrasikan oleh sifat sangat kekal dari daerah gen

yang mengkodekan untuk rRNA. Faktanya, karena memiliki kombinasi daerah yang sangat lestari dan

sangat variabel, gen 16S rRNA yang mengkodekan untuk komponen 16S rRNA dari subunit kecil

(30S) dari ribosom saat ini digunakan untuk klasifikasi Bakteri dan Archaea.

2.2.4 Glycocalyx Bakteri Akhirnya, bagian luar sel dapat memiliki beberapa fitur penting. Beberapa

bakteri memiliki lapisan ekstraseluler terutama terdiri dari polisakarida, tetapi yang juga dapat

mengandung protein dan bahkan asam nukleat yang dikenal sebagai ekstraseluler atau eDNA. Lapisan

ini disebut glikokaliks, juga dikenal sebagai lapisan lendir (lebih difus dan tidak teratur) atau kapsul

(lebih jelas dan berbeda) (Gambar 2.5). Lapisan lengket yang dihasilkan memberikan perlindungan

terhadap pengeringan, pemangsaan, fagositosis, dan toksisitas kimia, seperti dari antimikroba, dan

bertindak sebagai alat pelekatan pada permukaan. Bakteri penghasil glikokaliks, seperti Pseudomonas

spp., Sering ditemukan berhubungan dengan biofilm dan tikar mikroba (Bagian 6.2.4). Bahan ini telah

ditemukan mengikat logam dan digunakan secara komersial dalam pengikatan dan pemindahan logam

berat dari aliran limbah industri (Bab 18).

2.2.5 Lampiran Bakteri

Beberapa struktur aksesori memanjang dari sel ke lingkungan sekitar sel. Pelengkap ini tidak ada di

semua jenis bakteri, tetapi mereka umum, dan mereka biasanya membantu bakteri dengan motilitas
atau perlekatan pada permukaan. Flagel (flagella jamak) adalah pelengkap kompleks yang digunakan

untuk motilitas (Gambar 2.6). Motilitas penting dalam membantu sel bakteri bergerak jarak pendek

(μm) menuju nutrisi

(Kemotaksis positif) dan jauh dari bahan kimia yang berpotensi berbahaya (kemotaksis negatif). Pili

dan fimbriae adalah pelengkap permukaan yang tidak terlibat dalam pergerakan. Fimbriae (fimbria

tunggal) adalah banyak pelengkap permukaan pendek. Bantuan fimbria dalam perlekatan sel ke

permukaan, dan juga penting untuk kolonisasi awal untuk pembentukan biofilm dan juga untuk

pelekatan sel untuk memulai proses infeksi. Pili (pilus tunggal) biasanya lebih sedikit daripada

fimbriae tetapi lebih panjang. Mereka hanya ditemukan pada bakteri Gram-negatif, dan terlibat dalam

proses kawin antar sel yang dikenal sebagai konjugasi (Gambar 2.7). Dalam proses ini pertukaran

DNA difasilitasi oleh pilus yang membentuk hubungan antara dua sel. Konjugasi pada bakteri

lingkungan penting karena meningkatkan keragaman mikroba, seringkali memungkinkan populasi

spesifik untuk “lebih cocok” di ceruk lingkungan mereka. Baru-baru ini telah ditemukan bahwa

beberapa bakteri juga membentuk filamen ekstraseluler yang konduktif (kawat nano). Selama

respirasi anaerob (Bagian 2.2.8), kawat nano mentransfer elektron langsung dari sel bakteri ke

akseptor elektron terminal fase padat (mis., besi oksida) dalam proses yang disebut transfer elektron

ekstraseluler langsung (DEET) (Bab 3 dan 18).

2.2.6 Endospora Bakteri

Beberapa bakteri Gram-positif, seperti Bacillus dan Clostridium spp., Menghasilkan endospora,

struktur berlapis-lapis yang mampu menahan kondisi buruk termasuk radiasi, sinar UV, panas,

pengeringan, nutrisi dan bahan kimia rendah, untuk memastikan kelangsungan hidup sel. Endospora

penting secara lingkungan karena mereka dapat tetap dalam keadaan tidak aktif secara metabolik

untuk jangka waktu yang lama hanya untuk berkecambah dan diaktifkan kembali ketika kondisi

menjadi baik untuk pertumbuhan.

2.2.7 Transfer Informasi Genetik

Mungkin kemampuan bakteri yang paling unik adalah kemampuan mereka untuk dengan cepat

merespons perubahan kondisi lingkungan. Ini dapat dikaitkan dengan pertumbuhannya yang cepat dan

fleksibilitas kromosom bakteri. Bakteri dengan mudah memasukkan DNA baru ke dalam genomnya

melalui rekombinasi homolog. Rekombinasi homolog melibatkan penyelarasan dua untai DNA

dengan urutan yang sama, persilangan antara dua untai DNA dan pemutusan dan perbaikan DNA

pada titik persilangan untuk menghasilkan pertukaran bahan antara dua untaian. Akuisisi DNA baru

umumnya terjadi melalui transfer gen lateral atau horizontal oleh salah satu dari tiga mekanisme —

konjugasi, transduksi, atau transformasi — yang memungkinkan pertukaran DNA kromosom dan

plasmid. Kepentingan relatif dari mekanisme transfer DNA ini masih belum diketahui tetapi semua

telah terbukti terjadi di lingkungan. Variasi dari ketiga metode ini dapat digunakan di laboratorium

untuk memodifikasi secara genetik suatu organisme. Konjugasi bergantung pada transfer sel-ke-sel

langsung dari DNA plasmid konjugatif melalui protein pilus (Gambar 2.7). Pilus diperluas dari sel

donor (mengandung plasmid konjugatif) ke sel penerima (tidak memiliki plasmid konjugatif). Plasmid

konjugatif mirip dengan plasmid lain karena dapat mengkode berbagai gen yang tidak penting, seperti

resistensi antibiotik atau gen degradasi. Namun, tidak seperti plasmid lain, plasmid konjugatif juga

mengkode gen tra, gen yang mengkode produksi pilus seks. Ketika sel donor bertemu dengan sel

penerima, pilus dibentuk dan memungkinkan untuk replikasi dan transfer salinan plasmid konjugatif

dari donor ke penerima. Setelah menerima plasmid, penerima sekarang menjadi sel donor yang

mampu menyebarkan plasmid dan gen yang sesuai ke sel penerima lain. Konjugasi diperkirakan

membutuhkan konsentrasi sel yang tinggi untuk meningkatkan kemungkinan pertemuan di antara

keduanya

sel donor dan penerima yang kompatibel. Konjugasi, karena itu tergantung pada plasmid, dianggap

memainkan peran penting dalam transfer cepat gen yang dikodekan plasmid, misalnya, resistensi
antibiotik, di antara populasi bakteri. Transduksi terjadi karena pengemasan materi genetik seluler

yang tidak disengaja selama replikasi bakteriofag di dalam sel inangnya (Gambar 2.8). Virus

transduksi mengorbankan beberapa genomnya sendiri sebagai pengganti materi genetik inang,

menghasilkan virus yang masih dapat menginfeksi sel penerima tetapi tidak dapat lagi mereplikasi.

Ketika virus transduksi menginfeksi sel penerima, materi genetik inang dimasukkan ke dalam genom

penerima. Karena virus penularan yang menginfeksi rusak replikasi, sel penerima terus tumbuh dan

bermetabolisme seperti biasa dengan perolehan gen baru. Materi genetik yang diambil dengan

mentransduksi virus mencerminkan berbagai gen, beberapa berguna untuk organisme penerima dan

yang lain tidak. Transduksi dapat terjadi pada konsentrasi sel yang lebih rendah karena proses ini

bergantung pada virus sebagai pembawa informasi genetik. Proses ini banyak digunakan dalam

bioteknologi untuk pengenalan gen ke dalam sel. Transformasi terjadi ketika sel bakteri memperoleh

DNA gratis dari media di sekitarnya (Gambar 2.9). Ketika sel-sel mati, mereka siap melepaskan

konten seluler termasuk materi genetik kromosom dan plasmid. Banyak dari bahan ini terdegradasi

dengan cepat oleh nukleasi di lingkungan, tetapi beberapa dapat diserap ke permukaan partikel tanah

dan bahan organik, yang dapat melindungi DNA dari degradasi untuk jangka waktu yang lama.

Sekitar satu dari setiap seribu sel dianggap kompeten atau mampu mengangkut DNA langsung ke sel.

Kompetensi adalah kemampuan sel untuk mengangkut DNA dari lingkungan luarnya di dalam sel dan

tergantung pada tahap pertumbuhan dan konsentrasi sel. Misalnya, kultur yang tumbuh secara

eksponensial dari 107 108 sel / mL Streptococcus pneumoniae mengeluarkan protein kompetensi

yang memulai produksi beberapa protein lain yang mengubah

sel menjadi satu yang mampu mengambil DNA eksternal, mis., melalui produksi protein transpor

spesifik-DNA. Penyerapan DNA adalah acak; Namun, ketika itu terjadi, DNA dapat menjadi

dimasukkan ke dalam genom organisme yang meningkatkan keragaman genetik.

2.2.8 Metabolisme Bakteri

Pertimbangan penuh metabolisme bakteri disediakan dalam buku pelajaran mikrobiologi umum. Di

sini kita hanya merangkum empat jenis utama metabolisme berdasarkan sumber energi dan karbon

yang digunakan untuk pertumbuhan (Tabel 2.2). Energi dapat diperoleh dari cahaya melalui

fotosintesis (fototrof), atau dari oksidasi bahan kimia organik atau anorganik (chemotroph). Karbon

diperoleh baik dari karbon dioksida (autotrof) atau dari senyawa organik seperti glukosa (heterotrof

atau organotrof). Dengan demikian, chemoheterotrophs (chemoorganotrophs) menggunakan senyawa

organik baik untuk energi dan untuk karbon, chemoautotrophs (chemolithotrophs) memperoleh energi

mereka dari oksidasi senyawa anorganik dan karbon mereka dari karbon dioksida, photoautotrof

memperoleh energi dari cahaya dan memperbaiki karbon dari karbon dioksida dan, akhirnya ,

photoheterotrophs memperoleh energi dari cahaya dan karbon dari senyawa organik. Ada dua cara di

mana bakteri dapat memanen energi untuk digunakan untuk membangun bahan sel baru, pernapasan

dan fermentasi. Dalam respirasi, sel menggunakan kombinasi fosforilasi tingkat substrat

(menyediakan sejumlah kecil ATP) dan fosforilasi oksidatif, yang menggabungkan siklus asam

trikarboksilat (siklus TCA) dan rantai transpor elektron (menyediakan sejumlah besar ATP) untuk

menghasilkan energi ATP dan mengurangi daya. Kunci untuk respirasi adalah akseptor elektron

terminal (TEA) yang digunakan untuk menerima elektron dari rantai transpor elektron. Dalam kondisi

aerobik, TEA adalah oksigen yang memaksimalkan jumlah energi yang dihasilkan; total bersih 38

mol ATP per mol glukosa dimetabolisme. Dalam kondisi anaerob, TEA alternatif seperti NO3 2, Fe

31, SO 4 22 atau CO2 digunakan. Namun, jumlah relatif energi yang dapat diturunkan dari

pengurangan akseptor elektron terminal alternatif lebih kecil daripada oksigen. Dengan demikian,

respirasi dalam kondisi anaerob selalu kurang efisien daripada dalam kondisi aerob (lebih sedikit

energi yang dihasilkan). Perlu dicatat bahwa beberapa TEA alternatif sangat dekat dengan oksigen

dalam jumlah energi yang dihasilkan, terutama nitrat. Dengan demikian, banyak bakteri adalah

anaerob fakultatif di mana jika ada oksigen mereka menggunakannya sebagai TEA, tetapi jika tidak

ada, mereka dapat menggunakan NO3 2 sebagai gantinya. Contoh yang baik dari genus fakultatif
adalah Pseudomonas. Meskipun anaerob fakultatif dapat menggunakan oksigen atau nitrat, kisaran

TEA yang dapat mereka gunakan terbatas. Misalnya, reduksi sulfat adalah anaerob obligat yang

berspesialisasi dalam menggunakan sulfat sebagai TEA. Fermentasi adalah proses anaerob yang

hanya menggunakan fosforilasi tingkat-substrat dengan generasi bersih 2 mol ATP per glukosa mol

(sehingga tidak ada penggunaan rantai transpor elektron atau kebutuhan untuk akseptor elektron

eksternal). Alih-alih, elektron dihambat di antara senyawa organik yang biasanya berakhir dengan

produksi asam organik atau alkohol yang menghasilkan jumlah energi yang sangat kecil. Jadi, dalam

fermentasi, produk akhir termasuk kombinasi CO2 dan asam organik dan alkohol. Fermentasi adalah

proses yang telah dimanfaatkan dalam pembuatan minuman beralkohol dan berbagai produk makanan

lainnya (cuka, zaitun, yogurt, roti, keju). Dalam mempertimbangkan metabolisme dalam hal buku teks

ini, penting untuk mempertimbangkan lingkungan dan jenis respirasi atau fotosintesis yang akan

terjadi mengingat lokal

ketersediaan oksigen. Bahkan, harus diakui bahwa tidak hanya ada atau tidak adanya oksigen di

lingkungan tetapi lebih merupakan rangkaian konsentrasi. Akibatnya, dalam satu ceruk kecil,

mungkin ada respirasi aerobik dan anaerobik (serta fermentasi). Masing-masing jenis metabolisme ini

memiliki kebutuhan energi dan keluaran energi yang dapat dihitung. Perhitungan ini ditunjukkan pada

Bab 3. Secara keseluruhan, karena sifat bakteri yang ada di mana-mana dan dampaknya terhadap

kesehatan dan kesejahteraan manusia, habitat, fungsi, dan pentingnya bakteri dijelaskan secara rinci di

seluruh buku pelajaran ini.

2.2.9 Archaea

Archaeans adalah mikroba yang terlihat agak mirip dengan bakteri dalam ukuran dan bentuk di bawah

mikroskop cahaya, tetapi mereka sebenarnya secara genetik dan biokimia sangat berbeda. Mereka

tampak sebagai bentuk kehidupan yang lebih sederhana, dan mungkin sebenarnya merupakan bentuk
kehidupan tertua di Bumi. Archaeans awalnya dianggap hanya untuk mendiami lingkungan yang

ekstrem, yang mengarah ke mereka digambarkan sebagai ekstrimofil, tetapi baru-baru ini mereka

telah terbukti ada di berbagai lingkungan normal atau non-ekstrim. Sebagai contoh, Fan et al. (2006)

mengidentifikasi arkeans yang serupa dari lingkungan nonekstrem di empat tanah murni Cina dan

Amerika. Signifikansi keberadaan arkeans di lingkungan non-ekstrem masih belum ditentukan.

Menariknya, beberapa aspek struktur dan metabolisme sel archaean mirip dengan yang ada pada sel

bakteri. Namun, ada perbedaan kunci dalam transkripsi genetik dan terjemahan yang sebenarnya lebih

mirip dengan eukariota daripada bakteri. Beberapa perbedaan struktural utama antara arkeans dan

bakteri diidentifikasi pada Tabel 2.3. Yang juga menarik adalah fakta bahwa lipid archaean

didasarkan pada rantai samping isoprenoid, yang merupakan unit 5 karbon yang juga ada dalam karet.

Archaeans memiliki dinding sel luar yang keras yang mengandung berbagai jenis asam amino dan

gula daripada yang ditemukan pada bakteri. Selaput sel juga berbeda dengan lipid gliserol-eter

daripada lipid gliserol-ester yang ditemukan pada bakteri. Ikatan eter secara kimiawi lebih tahan

daripada ikatan ester dan dapat membantu arkeans bertahan dari lingkungan yang ekstrem.

2.2.9.1 Habitat Archaean

Banyak arkeans adalah ekstrofil yang dapat bertahan hidup baik suhu panas atau dingin, atau salinitas

ekstrim, alkalinitas atau keasaman (Pikuta et al., 2007). Archaeans Nonextreme telah ditemukan di

berbagai lingkungan termasuk tanah, air laut atau bahkan limbah. Awalnya dianggap bahwa tidak ada

archaea patogen yang ada (Cavicchioli et al., 2003). Namun, arkeans kemudian dikaitkan dengan

infeksi klinis (Vianna et al., 2006). Arkean biasanya ditempatkan dalam tiga kelompok berdasarkan

habitat. Dua divisi utama archaea adalah Crenarchaeota (kebanyakan termofil) dan Euryarchaeota

(kebanyakan haloarchaeans dan methanogen). Halofil atau haloarchaeans ada di lingkungan salin.

Sebaliknya, methanogen hidup di lingkungan anaerob dan menghasilkan metana. Metanogen dapat

ditemukan di lingkungan bersuhu rendah, yang berbeda dengan termofil yang terletak di lingkungan
bersuhu tinggi seperti mata air panas di Taman Yellowstone (Kotak Informasi 2.5). Archaeans juga

ditemukan dalam jumlah tinggi di lingkungan laut dingin (Giovannoni dan Stingl, 2005).

2.2.9.2 Fungsi Archaean Banyak arkeans tetap nonculturable, dan ini, digabungkan ke periode waktu

yang relatif singkat sejak ditemukannya banyak arkeans, berarti bahwa informasi terbatas pada

fisiologi arkeologi, fungsi dan dampak pada siklus biokimia global. Meskipun demikian

keberadaannya yang luas dan peran utama mereka dalam lingkungan yang ekstrem menunjukkan

bahwa mereka cenderung sangat penting bagi ekosistem yang bukan ekosistem juga. Sebagai contoh,

baru-baru ini telah ditunjukkan bahwa arkeans yang mampu melakukan nitrifikasi didistribusikan

secara luas (Santoro et al., 2010), dan sebenarnya dapat mengendalikan proses nitrifikasi (bukan

bakteri) di beberapa ekosistem. Archaea juga telah terlibat sebagai mediator transfer gen horizontal

antara arkeans dan bakteri (Nelson et al., 1999). Jelas, informasi tentang archaea akan meningkat

secara dramatis dalam waktu dekat, khususnya informasi tentang archaeans yang ditemukan di

lingkungan non -treme.

2.2.10 The Planctomycetes, Verrucomicrobia dan Chlamydiae Superphylum Planctomycetes,

Verrucomicrobia dan Chlamydiae (PVC) membentuk filum diskrit dari domain Bakteri, dan memiliki

fitur yang sangat khas yang membedakannya dari filum lain. Secara struktural, dinding sel tidak

mengandung peptidoglikan, komponen universal dari sebagian besar mikroba prokariotik. Juga,

mereka mampu melakukan kompartementalisasi sel intraseluler, menggunakan membran internal dan

bahkan nukleoid yang terikat membran (Fuerst dan Sagulenko 2011). Selanjutnya, memanfaatkan

proses yang terkait dengan pembentukan vesikel internal, mereka memiliki kemampuan untuk

mengambil protein dari solusi eksternal, mirip dengan endositosis eukariotik (Lonhienne Thierry et
al., 2010). Secara keseluruhan, asal-usul karakteristik dan sifat eukariotik ini saat ini sedang

diperdebatkan, termasuk konsep bahwa Planctomycetes mungkin telah berevolusi dari nenek moyang

bersama universal terakhir (LUCA) seperti eukariotik (FuCA dan Sagulenko, 2011). Dengan

demikian Planctomycetes bisa menjadi perantara evolusi antara prokariota dan eukariota.

Planctomycetes telah diidentifikasi dari seluruh penjuru dunia, tetapi sangat lazim di tanah, air tawar

dan lingkungan laut (Buckley et al., 2006).

Selain itu, mereka telah diidentifikasi sebagai mendominasi komunitas mikroba biofilm yang terkait
dengan permukaan rumput laut coklat kelp di perairan laut (Bengtsson dan Øvrea ˚es, 2010).
Khususnya, tergantung pada waktu tahun, 24 53% dari semua bakteri dalam biofilm rumput laut
diidentifikasi sebagai Planctomycetes. Dua peran potensial untuk Planctomycetes dalam biofilm
termasuk siklus nutrisi C dan N. Planctomycetes memiliki gen yang menyandikan enzim untuk
transfer C1, tetapi peran gen ini saat ini sedang dalam perdebatan (Chistoserdova et al., 2004).
Beberapa Planctomycetes mampu melakukan reaksi anammox, yang melibatkan oksidasi ammonium
menjadi dinitrogen menggunakan nitrit sebagai akseptor elektron ketika karbon dioksida berkurang.
Metabolisme kemoautotrofik ini terjadi dalam kompartemen sel yang terikat membran yang disebut
anammoxosome, dalam beberapa hal mirip dengan mitokondria eukariotik. Dengan demikian, biofilm
dengan Planctomycetes dapat memiliki potensi untuk menghilangkan nitrogen dari air limbah (Kartal
et al., 2010). "Keseluruhan Planctomycetes menantang konsep kami tentang sel bakteri dan prokariota
sebagai tipe sel struktural, serta ide-ide kami tentang asal-usul inti eukariotik" (Fuerst, 2010).

2.3 EUKARYOT

Eukariota lebih kompleks daripada prokariota dan mengandung nukleus sejati dan organel sel yang

terikat membran. Kelompok penting mikroorganisme eukariotik lingkungan termasuk jamur, protozoa

dan ganggang.

2.3.1 Jamur

Sementara bakteri dapat mewakili mikroorganisme yang paling melimpah dalam hal jumlah individu,

jamur, yang merupakan kelompok mikroorganisme eukariotik yang secara fisik lebih besar,

memiliki biomassa terbesar. Dalam makalah tengara, 1,5 juta spesies jamur diperkirakan ada

(Hawksworth, 2001) dengan hanya 7% dari mereka diidentifikasi sejauh ini (Crous et al., 2006).

Secara tradisional, identifikasi jamur didasarkan pada morfologi, struktur spora dan komposisi asam

lemak membran. Namun, perkiraan yang lebih baru menggunakan metode sekuensing highthroughput
menunjukkan bahwa sebanyak 5,1 juta spesies jamur ada (Blackwell, 2011). Jamur ada di mana-mana

dan terutama ditemukan di lingkungan tanah di mana mereka dapat beradaptasi dengan berbagai

kondisi dan memiliki peran utama sebagai pengurai. Seperti halnya bakteri, beberapa jamur bersifat

patogen bagi manusia dan tanaman (pada kenyataannya, secara ekonomis, jamur adalah patogen

tanaman yang paling penting). Jamur lain penting dalam proses industri yang melibatkan fermentasi,

dan dalam bioteknologi untuk produksi senyawa antimikroba (Tabel 2.4). Secara metabolik, jamur

adalah chemoheterotrophs. Kebanyakan jamur bersifat aerob wajib, tetapi ragi adalah anaerob

fakultatif dan jamur zoosporik yang ditemukan pada ruminansia bersifat anaerob. Jamur anaerob ini

umumnya memfermentasi gula dan dengan demikian menghasilkan berbagai produk sampingan yang

bermanfaat, seperti etanol, asam asetat dan asam laktat, menjadikannya penting secara komersial

untuk produksi banyak makanan pokok (misalnya, yogurt, keju, roti, acar) dan produk beralkohol

seperti bir dan anggur. Selain metabolisme utama mereka yang mendukung biosintesis dan produksi

energi, jamur dikenal untuk menghasilkan metabolit sekunder (senyawa yang diproduksi selama fase

pertumbuhan stasioner). Metabolit sekunder ini telah merevolusi kedokteran, bioteknologi, dan

pertanian. Misalnya, jamur bertanggung jawab atas antimikroba seperti penicillin yang diproduksi

oleh Penicillium notatum, cephalosporin yang diproduksi oleh Cephalosporium acremonium dan

griseofulvin yang diproduksi oleh Penicillium griseofulvum. Sementara produksi jamur antimikroba

dalam kondisi in situ tidak dipahami dengan baik, dihipotesiskan bahwa mereka membantu

mengurangi persaingan dari mikroorganisme lain untuk mendapatkan nutrisi.

2.3.1.1 Struktur Jamur

Membran jamur dan dinding sel adalah struktur kompleks yang bertindak sebagai penghalang selektif

permeabel dan pelindung luar, masing-masing. Komposisi dari kedua struktur ini agak bervariasi di

antara genus, sebagian karena variasi besar dalam perilaku dan siklus hidup, habitat dan fisiologi yang

terlihat pada jamur. Sebagai eukariota, jamur memiliki organel terikat-membran di samping membran
sitoplasma yang terdiri dari lapisan ganda fosfolipid dengan protein diselingi untuk transportasi dan

degradasi. Membran jamur bisa sangat kompleks dengan perbedaan struktural dan komposisi yang

diamati pada membran organel dan pada tahap siklus hidup. Selain fosfolipid, membran jamur dapat

mencakup sterol, glikolipid dan sphingolipid, yang dapat digunakan untuk identifikasi jamur karena

perbandingan, jenis dan jumlah lipid dapat spesifik spesies. Dinding sel jamur adalah struktur

berlapis-lapis yang terdiri dari kitin, turunan glukosa N-asetilglukosamin (Gambar 2.10). Dinding sel

jamur juga bisa mengandung selulosa, galaktosa, chitosa dan mannans. Komponen dinding sel lainnya

termasuk protein dan lipid. Sama halnya dengan bakteri, dinding sel jamur terletak di luar membran

sitoplasma, melindungi membran dari kerusakan. Dinding sel juga menyediakan perancah untuk

struktur tiga dimensi karakteristik yang cukup kompleks dari beberapa jamur, misalnya jamur.

2.3.1.2 Keanekaragaman Jamur

Jamur dapat dibagi menjadi tiga kelompok umum berdasarkan deskripsi morfologis: jamur, jamur dan

ragi (Gambar 2.11). Jamur, seperti Aspergillus, Penicillium Rhizopus dan Pilobolus, adalah jamur

berfilamen yang ditemukan di banyak filum jamur. Setiap sel jamur berfilamen disebut hifa (jamak

hifa), yang tumbuh dalam massa untuk membentuk berkas hifa atau miselia. Beberapa hifa

memanjang dari miselium untuk membentuk hifa udara yang bertanggung jawab untuk pembentukan

spora atau konidia aseksual mulai dari 1 hingga 50 μm dengan diameter. Penampilan koloni jamur

yang kabur disebabkan oleh hifa udara dan warna koloni jamur adalah hasil dari pewarnaan spora.

Beberapa jamur menghasilkan spora seksual sebagai hasil reproduksi seksual. Meskipun tidak sekuat

spora bakteri, baik spora aseksual dan seksual dapat tahan terhadap suhu ekstrem, pengeringan dan

bahan kimia, dan sebagian besar bertanggung jawab atas terjadinya penyebaran jamur secara luas.

Jamur adalah bagian dari Basidiomycota, yang merupakan jamur berfilamen yang membentuk tubuh

buah besar yang disebut sebagai jamur. Miselia udara berkumpul untuk membentuk jamur

makroskopis, yang tujuan utamanya adalah penyebaran basidiospora seksual yang ditemukan di

bawah topi. Sisa jamur jamur berada di bawah tanah sebagai miselium yang memanjang ke luar untuk
penyerapan nutrisi. Baik jamur dan jamur adalah pengurai penting dari produk alami, seperti kayu,

kertas dan kain, seperti yang dibahas di bawah ini. Namun, kedua kelompok jamur tersebut dapat

menghasilkan zat ekstraseluler lengket yang mengikat partikel tanah satu sama lain untuk membentuk

agregat tanah yang stabil yang mengurangi erosi tanah (Bab 4). Dalam beberapa kasus, jamur

dianggap memainkan peran yang lebih penting dalam mengendalikan erosi daripada tanaman. Ragi

adalah jamur uniseluler yang mampu berfermentasi dalam kondisi anaerob. Yang paling penting

adalah Saccharomyces dan Candida, yang merupakan anggota Ascomycota. Sementara ragi tidak

menghasilkan spora, mereka subur di lingkungan yang bergula, dan terutama terkait dengan buah-

buahan, bunga, dan getah dari pohon. Dengan beberapa pengecualian di mana reproduksi seksual

terjadi, ragi

CHAPTER 3

Mikroorganisme melakukan serangkaian reaksi kimia terorganisir yang secara kolektif dikenal

sebagai metabolisme. Ada beberapa ribu reaksi potensial dalam sel mikroba, banyak di antaranya

digunakan untuk membuat sel baru. Reaksi-reaksi ini dikenal sebagai metabolisme pertumbuhan.

Reaksi lain disebut reaksi nongrowth, dan diperlukan untuk aktivitas seluler seperti pemeliharaan

kolam metabolit intraseluler, perbaikan struktur seluler, motilitas dan respons terhadap tekanan

lingkungan (Schaechter et al., 2006). Di laboratorium, kita dapat memanipulasi kondisi sehingga sel-

sel menjalani metabolisme pertumbuhan sebagian besar waktu. Di lingkungannya, ini adalah cerita
yang berbeda — kebanyakan mikroorganisme berada dalam kondisi nongrowth, hanya bertahan hidup

dan menunggu sumber nutrisi baru. Secara keseluruhan, metabolisme adalah proses kompleks yang

melibatkan berbagai reaksi anabolik (sintesis konstituen sel dan metabolit) dan katabolik (penguraian

konstituen dan metabolit sel). Pada akhirnya, reaksi biosintesis ini menghasilkan pembelahan sel

seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3.1. Dalam media kultur yang kaya homogen, dalam kondisi

ideal, sel dapat membelah dalam 10 menit. Sebaliknya, telah disarankan bahwa pembelahan sel dapat

terjadi selambat-lambatnya setiap 100 tahun di beberapa lingkungan terestrial bawah permukaan.

Pertumbuhan yang lambat tersebut adalah hasil dari kombinasi faktor termasuk fakta bahwa sebagian

besar lingkungan di bawah permukaan adalah miskin nutrisi dan heterogen. Akibatnya, sel cenderung

terisolasi, dan

tidak dapat berbagi nutrisi atau mekanisme perlindungan, dan karenanya memiliki tingkat

pertumbuhan yang lebih lambat. Sebagian besar informasi yang tersedia mengenai pertumbuhan

mikroorganisme adalah hasil dari studi laboratorium terkontrol menggunakan kultur murni

mikroorganisme. Ada dua pendekatan untuk mempelajari pertumbuhan dalam kondisi yang terkendali

seperti itu: kultur batch dan kultur berkelanjutan. Dalam kultur batch, pertumbuhan organisme tunggal

atau sekelompok organisme, yang disebut konsorsium, dievaluasi menggunakan media yang telah

ditentukan di mana sejumlah substrat (makanan) ditambahkan pada awalnya. Dalam kultur

berkelanjutan, terdapat aliran media dan substrat yang stabil sehingga jumlah substrat yang tersedia

selalu tetap sama. Pertumbuhan baik dalam kondisi kultur batch dan kontinyu telah ditandai dengan

baik secara fisiologis dan juga dijelaskan secara matematis. Informasi ini telah digunakan untuk

mengoptimalkan produksi komersial berbagai produk mikroba termasuk antibiotik, vitamin, asam

amino, enzim, ragi, cuka dan minuman beralkohol. Bahan-bahan ini sering diproduksi dalam batch

besar (hingga 500.000 liter), juga disebut fermentasi skala besar. Sayangnya, sulit untuk memperluas

pengetahuan kita tentang pertumbuhan di bawah kondisi laboratorium yang terkendali ke pemahaman
pertumbuhan di tanah alami atau lingkungan air, di mana tingkat kompleksitas yang lebih tinggi

ditemui (Gambar 3.2). Kompleksitas ini muncul dari suatu angka

GAMBAR

faktor, termasuk berbagai jenis permukaan padat, lingkungan mikro yang telah mengubah sifat fisik

dan kimia, status nutrisi terbatas dan konsorsium mikroorganisme yang berbeda semua bersaing untuk

pasokan nutrisi terbatas yang sama (lihat Bab 4). Dengan demikian, tantangan saat ini yang dihadapi

ahli mikrobiologi lingkungan adalah memahami pertumbuhan mikroba di lingkungan alam.

Pemahaman seperti itu akan memfasilitasi kemampuan kita untuk memprediksi laju siklus nutrisi

(Bab 16), respons mikroba terhadap gangguan antropogenik lingkungan, interaksi mikroba dengan

kontaminan organik dan logam (Bab 17 dan 18) dan kelangsungan hidup dan pertumbuhan patogen di

lingkungan ( Bab 22). Dalam bab ini, kita mulai dengan ulasan pertumbuhan di bawah kondisi budaya

murni, dan kemudian membahas bagaimana ini dibandingkan dengan pertumbuhan di lingkungan.

3.1 PERTUMBUHAN DALAM BUDAYA MURNI DALAM BENTENG Biasanya, untuk

memahami dan menentukan pertumbuhan isolat mikroba tertentu, sel ditempatkan dalam media cair

di mana nutrisi dan kondisi lingkungan dikendalikan. Jika media memasok semua nutrisi yang

diperlukan untuk parameter pertumbuhan dan lingkungan optimal, peningkatan jumlah atau massa

bakteri dapat diukur sebagai fungsi waktu untuk mendapatkan kurva pertumbuhan. Beberapa fase

pertumbuhan yang berbeda dapat diamati dalam kurva pertumbuhan (Gambar 3.3). Ini termasuk: fase

lag; fase eksponensial atau log; fase diam; dan fase kematian. Masing-masing fase ini mewakili

periode pertumbuhan yang berbeda yang dikaitkan dengan perubahan fisiologis khas dalam kultur sel.
Seperti yang akan dilihat pada bagian berikut, tingkat pertumbuhan yang terkait dengan setiap fase

sangat berbeda.

3.1.1 Fase Lag

Fase pertama yang diamati dalam kondisi batch adalah fase lag di mana tingkat pertumbuhan pada

dasarnya nol. Ketika inokulum ditempatkan ke dalam media segar, pertumbuhan dimulai setelah

periode waktu yang disebut fase lag. Menurut definisi, fase fase transisi ke fase eksponensial setelah

populasi awal telah berlipat ganda (Yates and Smotzer, 2007). Fase lag diduga disebabkan oleh

adaptasi fisiologis sel terhadap kondisi kultur. Ini mungkin melibatkan persyaratan waktu untuk

induksi RNA messenger spesifik (mRNA), dan sintesis protein berikutnya untuk memenuhi

persyaratan kultur baru. Fase lag mungkin juga disebabkan oleh kepadatan awal organisme yang

rendah yang menghasilkan pengenceran exoenzymes (enzim yang dilepaskan dari sel), dan nutrisi

yang bocor dari sel yang tumbuh. Biasanya, bahan-bahan tersebut dibagi oleh sel dalam jarak dekat.

Tetapi ketika kepadatan sel rendah, bahan-bahan ini diencerkan dan tidak diambil dengan mudah.

Akibatnya, inisiasi pertumbuhan dan pembelahan sel, dan transisi ke fase pertumbuhan eksponensial

mungkin tertunda. Fase jeda biasanya berlangsung dari beberapa menit hingga beberapa jam. Panjang

fase lag dapat dikontrol sampai batas tertentu karena tergantung pada jenis medium dan juga pada

ukuran inokulum awal. Misalnya, jika inokulum diambil dari kultur fase eksponensial dalam kaldu

kedelai trypticase (TSB), dan ditempatkan ke dalam media TSB segar pada konsentrasi 106 sel / ml di

bawah kondisi pertumbuhan yang sama (suhu, kecepatan guncangan), akan ada tidak ada fase jeda

yang terlihat. Namun, jika inokulum diambil dari kultur fase diam,

GRAFIKKK

akan ada fase lag karena sel fase stasioner menyesuaikan dengan kondisi baru, dan bergeser secara

fisiologis dari sel fase stasioner ke sel fase eksponensial. Demikian pula, jika inokulum ditempatkan
ke dalam media selain TSB, misalnya, media garam mineral dengan glukosa sebagai sumber karbon

tunggal, fase jeda dapat diamati sementara sel-sel menyesuaikan secara fisiologis untuk mensintesis

enzim yang sesuai untuk katabolisme glukosa. Akhirnya, jika ukuran inokulum kecil, misalnya 104

sel / ml, dan seseorang mengukur aktivitas, seperti hilangnya substrat, fase jeda akan diamati hingga

populasi mencapai sekitar 106 sel / ml. Ini diilustrasikan pada Gambar 3.4, yang membandingkan

degradasi fenantrena dalam biakan yang diinokulasi dengan 107 dan dengan 104 unit pembentuk

koloni (CFU) per ml. Meskipun laju degradasi yang dicapai serupa dalam kedua kasus (bandingkan

kemiringan masing-masing kurva), fase lag adalah 1,5 hari ketika ukuran inokulum rendah digunakan

(104 CFU / ml), berbeda dengan hanya 0,5 hari ketika inokulum yang lebih tinggi adalah digunakan

(107 CFU / ml).

3.1.2 Fase Eksponensial

Fase kedua pertumbuhan yang diamati dalam sistem batch adalah fase eksponensial. Fase

eksponensial ditandai oleh periode pertumbuhan eksponensial - pertumbuhan paling cepat yang

mungkin terjadi dalam kondisi yang ada dalam sistem batch. Selama pertumbuhan eksponensial, laju

peningkatan sel dalam kultur sebanding dengan jumlah sel yang ada pada waktu tertentu. Ada

beberapa cara untuk mengekspresikan konsep ini baik secara teoritis maupun matematis. Salah satu

caranya adalah membayangkan bahwa selama pertumbuhan eksponensial, jumlah sel meningkat

dalam perkembangan geometri 20,2 1,2 2,2 4 sampai, setelah n pembelahan, jumlah sel adalah 2n

(Gambar 3.5). Ini dapat dinyatakan secara kuantitatif sebagai: X 52nX0 (Persamaan 3.1)

dimana:

X0 5 konsentrasi awal sel X5 konsentrasi setelah waktu t5 jumlah generasi atau pembelahan sel

Dari Persamaan. 3.1 berikut bahwa:

Pada X 5nln 21ln X0 (Persamaan 3.2)

Selama fase pertumbuhan eksponensial, jika jumlah sel pada awalnya, dan pada waktu tertentu

sesudahnya, diketahui, jumlah generasi dapat dihitung dari Persamaan. 3.3.

n5

Di X 2ln X0 0: 693

(Persamaan 3.3)

Contoh Perhitungan 3.1 menunjukkan bahwa jika seseorang memulai dengan jumlah sel yang rendah,

pertumbuhan eksponensial pada awalnya tidak menghasilkan jumlah sel yang besar. Namun, ketika

sel menumpuk setelah beberapa generasi, jumlah sel baru dengan masing-masing pembelahan sel

meningkat secara dramatis.

ITUNGANNNNNN !!!!

ADA EXAMPLE 3.1

3.1.2.1 Rata-Rata Waktu Generasi vs. Tingkat Pertumbuhan Spesifik Dua istilah yang digunakan

untuk menggambarkan pertumbuhan pada fase eksponensial adalah waktu generasi dan laju

pertumbuhan spesifik. Waktu pembangkitan mengacu pada waktu yang diperlukan untuk

penggandaan sel sedangkan laju pertumbuhan spesifik adalah laju pertumbuhan maksimum yang

dapat dicapai mengingat kondisi lingkungan yang ada (substrat tak terbatas, suhu, dll.). Ketika

substrat menjadi membatasi atau produk sampingan beracun menumpuk, sel akan meninggalkan fase

eksponensial dan, sejalan dengan itu, laju pertumbuhan spesifik akan menurun. Dalam istilah

matematika dalam fase eksponensial: dX dt 5μX (Persamaan 3.4) dimana: perubahan dx / dt5 dalam

sel X selama waktu t μ5 laju pertumbuhan spesifik dinyatakan sebagai waktu resiprokal (jam21)

EXAMPLE 3.2 !!!!!!

Dengan integrasi:
X = X0 5eμt (Persamaan 3.5)

Mengambil log natural (ln) dari kedua sisi:

Pada X = Xo 5ln X 2ln Xo 5μt ‘μ5 Pada X 2ln X0 t

(Persamaan 3.6)

Dengan demikian, laju pertumbuhan spesifik dalam fase eksponensial adalah kemiringan kurva

pertumbuhan. Lihat Contoh Perhitungan 3.3 untuk ilustrasi tentang cara menentukan tingkat

pertumbuhan spesifik. Untuk menghitung waktu pembuatan (g), kami mempertimbangkan kasus

khusus di mana X0 digandakan. Dalam kasus paling sederhana, kita dapat mempertimbangkan kapan

satu sel menjadi dua sel dan X52 sedangkan X0 51: ‘μ5 0: 69320 g‘ μ5 0: 693

3.1.3 Fase Stationary

Fase ketiga pertumbuhan adalah fase diam. Fasa diam dalam kultur batch dapat didefinisikan sebagai

keadaan tidak ada pertumbuhan bersih, yang dapat dinyatakan dengan persamaan berikut:

dX dt

50 (Persamaan. 3.8)

Meskipun tidak ada pertumbuhan bersih dalam fase diam, sel-sel masih tumbuh dan membelah.

Pertumbuhan cukup seimbang dengan jumlah sel yang sekarat sama. Ada beberapa alasan mengapa

kultur batch dapat mencapai fase diam. Salah satu alasannya adalah bahwa karbon dan sumber energi

atau nutrisi penting menjadi terbatas. Ketika sumber karbon habis, itu tidak berarti bahwa semua

pertumbuhan berhenti. Ini karena sel yang sekarat dapat melisiskan dan menyediakan sumber nutrisi

yang didaur ulang. Pertumbuhan yang dihasilkan dari sel-sel mati disebut metabolisme endogen.
Metabolisme endogen terjadi sepanjang siklus pertumbuhan, tetapi dapat diamati dengan baik selama

fase diam ketika pertumbuhan diukur dalam hal penyerapan oksigen atau evolusi karbon dioksida.

Dengan demikian, dalam banyak kurva pertumbuhan seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3.6, fase

diam sebenarnya dapat menunjukkan sejumlah kecil pertumbuhan. Sekali lagi, pertumbuhan ini

terjadi setelah substrat dimanfaatkan, dan mencerminkan penggunaan sel-sel mati sebagai sumber

karbon dan energi. Alasan kedua bahwa fase stasioner dapat diamati adalah bahwa produk limbah

menumpuk hingga titik di mana mereka mulai menghambat pertumbuhan sel atau beracun bagi sel.

Ini umumnya hanya terjadi pada kultur dengan kepadatan sel yang tinggi. Terlepas dari alasan

mengapa sel memasuki fase stasioner, pertumbuhan dalam fase stasioner disebut sebagai

pertumbuhan yang tidak seimbang karena lebih mudah bagi sel untuk mensintesis beberapa

komponen daripada yang lain. Ketika beberapa komponen menjadi semakin terbatas, sel-sel akan

tetap tumbuh dan membelah selama mungkin. Sebagai akibat dari stres nutrisi ini, sel-sel fase

stasioner umumnya lebih kecil dan lebih bulat daripada sel-sel dalam fase eksponensial. Pada

akhirnya, karena penggunaan kembali beberapa komponen sel tidak 100% efisien, lebih banyak sel

mati daripada sel baru yang diproduksi, dan biakan akan memasuki fase kematian.

3.1.4 Fase Kematian

Fase terakhir dari kurva pertumbuhan adalah fase kematian, yang ditandai dengan hilangnya sel-sel

yang dapat dikultur. Bahkan dalam fase kematian mungkin ada sel-sel individual yang

memetabolisme dan membelah, tetapi lebih banyak sel yang hilang daripada yang diperoleh sehingga

ada kerugian bersih sel-sel yang hidup. Fase kematian sering bersifat eksponensial, meskipun laju

kematian sel biasanya lebih lambat daripada laju kematian sel

EXAMPLE 3.3 !!!!

pertumbuhan selama fase eksponensial. Fase kematian dapat dijelaskan dengan persamaan berikut:

dX dt

52kdX (Persamaan 3.9)

di mana kd 5 angka kematian spesifik. Perlu dicatat bahwa cara pertumbuhan sel diukur dapat

mempengaruhi bentuk kurva pertumbuhan. Misalnya, jika pertumbuhan diukur dengan kepadatan

optik

alih-alih dengan jumlah lempeng (bandingkan dua kurva pada Gambar 3.3), timbulnya fase kematian

tidak mudah terlihat. Demikian pula, jika seseorang memeriksa kurva pertumbuhan yang diukur

dalam evolusi karbon dioksida yang ditunjukkan pada Gambar 3.6, sekali lagi tidak mungkin untuk

melihat fase kematian. Namun, ini adalah pendekatan yang biasa digunakan untuk mengukur

pertumbuhan, karena biasanya, fase pertumbuhan yang paling menarik bagi ahli mikrobiologi

lingkungan adalah fase lag, fase eksponensial dan waktu untuk dimulainya fase diam.

ADA KURVAAA

3.1.5 Pengaruh Konsentrasi Substrat terhadap Pertumbuhan

Sejauh ini kita telah membahas masing-masing fase pertumbuhan dan telah menunjukkan bahwa

setiap fase dapat dijelaskan secara matematis (lihat Persamaan 3.1, 3.8 dan 3.9). Kita juga bisa

menulis persamaan untuk memungkinkan deskripsi seluruh kurva pertumbuhan. Persamaan seperti itu

menjadi semakin kompleks. Sebagai contoh, salah satu deskripsi pertama dan paling sederhana adalah

persamaan Monod, yang dikembangkan oleh Jacques Monod pada tahun 1940-an:

μ5

μmaxS Ks 1S
(Persamaan 3.10)

di mana: μ5 laju pertumbuhan spesifik (1 / kali) μmaks 5 laju pertumbuhan spesifik maksimum (1 /

waktu) untuk biakan S5 konsentrasi substrat (massa / volume) Ks 5 konstanta setengah saturasi

(massa / volume) juga dikenal sebagai konstanta afinitas

Persamaan 3.10 dikembangkan dari serangkaian percobaan yang dilakukan oleh Monod. Hasil

percobaan ini menunjukkan bahwa pada konsentrasi substrat yang rendah, laju pertumbuhan menjadi

fungsi dari konsentrasi substrat (perhatikan bahwa Persamaan 3.1 hingga 3.9 tidak tergantung pada

konsentrasi substrat). Jadi, Monod merancang Persamaan. 3.10 untuk menggambarkan hubungan

antara laju pertumbuhan spesifik dan konsentrasi substrat. Ada dua konstanta dalam persamaan ini,

μmax, laju pertumbuhan spesifik maksimum, dan Ks, konstanta halfsaturation, yang didefinisikan

sebagai konsentrasi substrat di mana pertumbuhan terjadi pada setengah nilai μmax.

Baik μmax dan Ks mencerminkan sifat fisiologis intrinsik dari jenis mikroorganisme tertentu. Mereka

juga tergantung pada substrat yang digunakan dan pada suhu pertumbuhan (lihat Kotak Informasi

3.1). Monod diasumsikan secara tertulis Persamaan. 3.10 bahwa tidak ada nutrisi selain substrat yang

membatasi dan tidak ada produk sampingan metabolisme yang menumpuk. Seperti yang ditunjukkan

pada Persamaan. 3.11, persamaan Monod dapat dinyatakan dalam hal jumlah sel atau massa sel (X)

dengan menyamakannya dengan Persamaan. 3.4: dX dt 5 μmaxSX Ks 1S (Persamaan 3.11)

Persamaan Monod memiliki dua kasus pembatas (lihat Gambar 3.7). Kasus pertama adalah pada

konsentrasi substrat tinggi di mana S..Ks. Dalam hal ini, seperti yang ditunjukkan pada Persamaan.

3,12, laju pertumbuhan spesifik μ pada dasarnya sama dengan μmax. Ini menyederhanakan persamaan

dan hubungan yang dihasilkan adalah nol orde atau independen dari konsentrasi substrat: untuk ScKs:

dX dt 5μmaxX (Persamaan 3.12) Dalam kondisi ini, pertumbuhan akan terjadi pada tingkat

pertumbuhan maksimum. Ada beberapa contoh di mana pertumbuhan ideal seperti yang dijelaskan

oleh Persamaan. 3.12 dapat terjadi. Salah satu contoh tersebut adalah dalam kondisi awal yang
ditemukan dalam kultur murni dalam labu batch ketika substrat dan tingkat nutrisi tinggi. Lain adalah

di bawah kondisi budaya berkelanjutan, yang dibahas lebih lanjut dalam Bagian 3.2. Harus ditekankan

bahwa jenis pertumbuhan ini cenderung langka di bawah kondisi alam di lingkungan tanah atau air, di

mana substrat atau nutrisi lain biasanya membatasi. Kasus pembatas kedua terjadi pada konsentrasi

substrat rendah di mana S ,, Ks seperti yang ditunjukkan pada Persamaan. 3.13. Dalam hal ini ada

ketergantungan tingkat pertama pada konsentrasi media (Gambar 3.7)

untuk S {Ks: dX dt

μmaxSX Ks

(Persamaan 3.13)

Seperti yang ditunjukkan pada Persamaan. 3,13, ketika konsentrasi substrat rendah, pertumbuhan

(dX / dt) tergantung pada konsentrasi substrat. Karena konsentrasi substrat ada di dalam pembilang,

karena konsentrasi substrat berkurang, laju pertumbuhan juga akan berkurang. Jenis pertumbuhan ini

biasanya ditemukan dalam sistem labu batch pada akhir kurva pertumbuhan ketika hampir semua

substrat telah dikonsumsi. Ini juga merupakan jenis pertumbuhan yang biasanya lebih diharapkan di

bawah kondisi yang ditemukan di lingkungan alami, di mana substrat dan nutrisi membatasi.

Persamaan Monod juga dapat dinyatakan sebagai fungsi pemanfaatan substrat mengingat

pertumbuhan terkait dengan pemanfaatan substrat oleh konstanta yang disebut hasil sel (Persamaan

3.14):

dS dt

52

1Y

dX dt

KOTAK INFORMASI 3.1

KURVAA

dimana Y5 menghasilkan sel (massa / massa). Koefisien hasil sel didefinisikan sebagai jumlah satuan

massa sel yang diproduksi per satuan jumlah substrat yang dikonsumsi. Dengan demikian, semakin

efisien substrat terdegradasi, semakin tinggi nilai koefisien hasil sel (lihat Bagian 3.3 untuk lebih

jelasnya). Koefisien hasil sel tergantung pada struktur substrat yang digunakan dan sifat fisiologis

intrinsik mikroorganisme yang mengalami degradasi. Seperti yang ditunjukkan di bawah ini,

Persamaan. 3.11 dan 3.14 dapat dikombinasikan untuk mengekspresikan pertumbuhan mikroba dalam

hal hilangnya substrat: dS dt 52 1 Y μmaxSX Ks 1S (Persamaan 3.15) Gambar 3.8 menunjukkan satu

set kurva pertumbuhan yang dibangun dari konstanta yang tetap. Data pertumbuhan yang digunakan

untuk menghasilkan angka ini dikumpulkan dengan menentukan protein sebagai ukuran peningkatan

pertumbuhan sel (lihat Bab 11). Data pertumbuhan kemudian digunakan untuk memperkirakan

konstanta pertumbuhan μmax, Ks dan Y. Baik Y dan μmax diestimasi langsung dari data. Ks

diperkirakan menggunakan model matematika yang melakukan analisis regresi nonlinier dari solusi

simultan untuk persamaan Monod untuk massa sel (Persamaan 3.11) dan substrat (Persamaan 3.14).

Rangkaian konstanta ini kemudian digunakan untuk memodelkan atau mensimulasikan kurva

pertumbuhan yang mengekspresikan pertumbuhan dalam hal evolusi CO2 dan hilangnya substrat.

Model semacam itu berguna karena dapat membantu: (1) memperkirakan konstanta pertumbuhan

seperti Ks yang sulit ditentukan secara eksperimen; dan (2) dengan cepat memahami bagaimana

perubahan dalam salah satu parameter eksperimental memengaruhi pertumbuhan tanpa melakukan

serangkaian eksperimen yang panjang dan menjemukan.

3.2 BUDAYA BERKELANJUTAN Sejauh ini, kami telah fokus pada deskripsi teoritis dan
matematis tentang pertumbuhan kultur batch, yang saat ini sangat penting secara ekonomi dalam hal

produksi berbagai produk mikroba. Berbeda dengan kultur batch, kultur kontinu adalah sistem yang

dirancang untuk operasi jangka panjang. Kultur berkelanjutan dapat dioperasikan dalam jangka

panjang karena merupakan sistem terbuka (Gambar 3.9), dengan umpan terus-menerus dari larutan

influen yang mengandung nutrisi dan substrat. Ini juga mengandung saluran terus-menerus dari solusi

efluen yang dimilikinya

sel, metabolit, produk limbah dan semua nutrisi dan substrat yang tidak digunakan. Kapal yang

digunakan sebagai wadah pertumbuhan dalam kultur berkelanjutan disebut bioreaktor atau chemostat.

Dalam chemostat, seseorang dapat mengontrol laju aliran dan mempertahankan konsentrasi substrat

yang konstan, serta memberikan kontrol kontinyu terhadap tingkat pH, suhu dan oksigen. Ini

memungkinkan kontrol laju pertumbuhan, yang dapat digunakan untuk mengoptimalkan produksi

produk mikroba tertentu. Misalnya, metabolit primer atau produk yang terkait dengan pertumbuhan,

seperti etanol, diproduksi dengan laju aliran atau pengenceran tinggi yang merangsang pertumbuhan

sel. Di Sebaliknya, metabolit sekunder atau produk yang berhubungan dengan nongrowth seperti

antibiotik diproduksi pada laju aliran rendah atau pengenceran yang mempertahankan jumlah sel yang

tinggi. Kultur chemostat juga digunakan untuk membantu dalam studi genom fungsional

pertumbuhan, pembatasan nutrisi dan respon stres pada tingkat seluruh organisme. Keuntungan dari

chemostat dalam penelitian tersebut adalah penghilangan efek pertumbuhan sekunder secara konstan

yang dapat menutupi atau mengubah perubahan fisiologis halus dalam kondisi kultur batch

(Hoskisson dan Hobbs, 2005). Laju pengenceran dan konsentrasi substrat yang berpengaruh adalah

dua parameter yang dikontrol dalam chemostat untuk mempelajari pertumbuhan mikroba atau untuk

mengoptimalkan produksi metabolit. Dinamika kedua parameter ini ditunjukkan pada Gambar 3.10.

Dengan mengendalikan laju pengenceran, seseorang dapat mengontrol laju pertumbuhan (μ) dalam

chemostat, yang ditunjukkan dalam grafik ini sebagai waktu penggandaan (ingat bahwa selama fase
eksponensial, laju pertumbuhan sebanding dengan jumlah sel yang ada). Dengan mengendalikan

konsentrasi substrat yang berpengaruh, seseorang dapat mengontrol jumlah sel yang dihasilkan atau

hasil sel dalam kemostat karena jumlah sel yang dihasilkan akan berbanding lurus dengan jumlah

substrat yang disediakan. Karena laju pertumbuhan dan jumlah sel dapat dikontrol secara independen,

chemostats telah menjadi alat penting untuk studi fisiologi pertumbuhan mikroba. Mereka juga

berguna dalam pengembangan jangka panjang budaya dan konsorsium yang digunakan untuk

kontaminan organik yang beracun dan sulit untuk didegradasi. Chemostats juga dapat menghasilkan

produk mikroba lebih efisien daripada fermentasi batch. Ini karena chemostat pada dasarnya dapat

menahan kultur pada fase pertumbuhan eksponensial untuk periode waktu yang lama. Terlepas dari

keunggulan ini, kemoterapi belum banyak digunakan KURVA 3.8 FOTO 3.9

menghasilkan produk komersial karena seringkali sulit untuk mempertahankan kondisi steril dalam

jangka waktu yang lama. Dalam chemostat, media pertumbuhan mengalami pengenceran konstan

sehubungan dengan sel-sel karena masuknya larutan nutrisi (Gambar 3.9). Kombinasi pertumbuhan

dan pengenceran dalam chemostat pada akhirnya akan menentukan pertumbuhan. Jadi, dalam

chemostat, perubahan biomassa dengan waktu adalah:

dX dt

5μX 2DX (Persamaan 3.16)

dimana:

X5 massa sel (massa / volume) μ5 laju pertumbuhan spesifik (1 / kali) D5 laju pengenceran (1 /

waktu)

Pemeriksaan Persamaan. 3.16 menunjukkan bahwa kondisi tunak (tidak ada kenaikan atau penurunan

biomassa) akan tercapai ketika μ5D. Jika .D.D, pemanfaatan substrat akan melebihi pasokan substrat,

menyebabkan laju pertumbuhan melambat hingga sama dengan laju pengenceran. Jika μ, D, jumlah

media yang ditambahkan akan melebihi jumlah yang digunakan. Oleh karena itu, tingkat
pertumbuhan akan meningkat hingga sama dengan tingkat pengenceran. Dalam kedua kasus,

diberikan waktu, kondisi mapan akan ditetapkan di mana: μ5D (Persamaan 3.17)

Keadaan stabil seperti itu dapat dicapai dan dipertahankan selama tingkat pengenceran tidak melebihi

tingkat kritis,

Dc. Tingkat pengenceran kritis dapat ditentukan dengan menggabungkan Persamaan. 3.10 dan 3.17:

Dc 5μmax S Ks 1S (Persamaan 3.18)

Melihat Persamaan. 3,18, dapat dilihat bahwa efisiensi operasi chemostat dapat dioptimalkan dalam

kondisi di mana S..Ks, dan karenanya Dc μmax. Tetapi harus diingat bahwa ketika chemostat

beroperasi pada Dc, jika laju pengenceran meningkat lebih lanjut, laju pertumbuhan tidak akan dapat

meningkat (karena sudah pada μmax) untuk mengimbangi peningkatan laju pengenceran. Hasilnya

akan membasuh sel dan penurunan efisiensi operasi chemostat. Dengan demikian, Dc adalah

parameter penting karena jika chemostat dijalankan pada laju pengenceran kurang dari Dc, efisiensi

operasi tidak dioptimalkan; sedangkan jika tingkat pengenceran melebihi Dc, washout sel akan terjadi

seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3.10.

3.3 PERTUMBUHAN DI LINGKUNGAN

Bagaimana pertumbuhan di lingkungan alami terkait dengan pertumbuhan dalam labu atau dalam

budaya berkelanjutan? Ada beberapa upaya untuk mengklasifikasikan bakteri dalam sistem tanah

berdasarkan karakteristik pertumbuhan dan afinitasnya untuk substrat karbon. Yang pertama adalah

oleh Sergei Winogradsky (1856 1953), "bapak mikrobiologi tanah," yang memperkenalkan sistem

klasifikasi ekologi

organisme autochthonous versus zymogenous. Mantan dimetabolisme perlahan-lahan di tanah,

memanfaatkan nutrisi yang dikeluarkan perlahan-lahan dari bahan organik tanah sebagai substrat.
Yang terakhir ini disesuaikan dengan interval dormansi ketika ketersediaan substrat rendah, atau

untuk pertumbuhan yang cepat setelah penambahan substrat segar atau perubahan ke tanah. Selain

dua kategori ini, ada organisme allochthonous, yang merupakan organisme yang baru saja

dimasukkan ke dalam tanah dan biasanya bertahan hidup hanya untuk periode waktu yang singkat

(Gambar 3.11). Terminologi saat ini membedakan mikroba tanah sebagai oligotrof, yang lebih suka

konsentrasi substrat rendah, atau copiotrof, yang lebih suka konsentrasi substrat tinggi. Ini mirip

dengan konsep seleksi r dan K. Organisme yang merespons nutrisi tambahan dengan laju

pertumbuhan yang cepat ditetapkan sebagai ahli strategi r, sedangkan ahli strategi K memiliki tingkat

pertumbuhan dan angka yang rendah namun konsisten dalam lingkungan nutrisi yang rendah. Pada

kenyataannya, komunitas tanah biasanya memiliki kontinum mikroorganisme dengan berbagai tingkat

kebutuhan nutrisi mulai dari ahli strategi r, atau copiotroph, hingga ahli strategi K, atau oligotrof. Laju

pertumbuhan maksimum tipikal (μmax) dan konstanta afinitas (Ks) untuk kedua kelompok mikroba

ini diberikan dalam Kotak Informasi 3.1. Ketika mempertimbangkan mikroba oligotrofik di

lingkungan, tidak mungkin mereka menunjukkan tahap pertumbuhan yang diamati dalam labu batch

dan kultur berkelanjutan.

FOTO 3.11

Mikroba ini memetabolisme secara perlahan, dan sebagai hasilnya memiliki waktu generasi yang

panjang. Seringkali, mereka menggunakan energi yang diperoleh dari metabolisme hanya untuk

pemeliharaan sel. Di sisi lain, organisme copiotrophic mungkin menunjukkan tingkat metabolisme

yang tinggi dan mungkin pertumbuhan eksponensial untuk periode yang singkat, atau dapat

ditemukan dalam keadaan tidak aktif. Perhatikan juga bahwa pertumbuhan eksponensial biasanya

tidak bertahan lama di lingkungan. Sebaliknya, bakteri sering bergantian antara periode pertumbuhan

dan pertumbuhan, yaitu, terus-menerus memasuki dan meninggalkan fase stasioner (Schaechter et al.,

2006). Sel dorman sering bulat dan kecil (sekitar 0,3 μm) dibandingkan dengan spesimen

laboratorium yang sehat, yang berkisar dari 1 hingga 2 μm. Sel yang tidak aktif dapat menjadi aktif
tetapi tidak dapat dikultur (VBNC) dengan waktu karena kondisi kelaparan yang lama atau karena sel

menjadi rusak secara reversibel (Roszak dan Collwell, 1987). Mikroba VBNC sulit dikultur karena

stres dan kerusakan sel. Mikroba spesifik mungkin juga sulit dikultur karena beberapa alasan, yang

dibahas dalam Bagian 10.3.1. Pendekatan baru untuk peningkatan budidaya bakteri tanah

didefinisikan dalam Bagian 10.3.1.1. Kedua kasus ini berkontribusi pada fakta bahwa penghitungan

langsung dari sampel lingkungan, yang mencakup semua sel yang layak, seringkali satu atau dua

urutan besarnya lebih tinggi dari jumlah yang dapat dibiakkan, yang mencakup hanya sel yang

mampu tumbuh pada media kultur yang digunakan. Ketika kultur tanah dilapisi pada media padat,

subset dari komunitas yang didominasi oleh copiotroph dengan cepat mengambil keuntungan dan

mulai melakukan metabolisme secara aktif. Dalam arti tertentu, ini mirip dengan reaksi oleh mikroba

dalam labu batch ketika nutrisi ditambahkan. Studi yang menggunakan metodologi yang bergantung

pada kultur dan tidak tergantung pada kultur pada sampel yang sama telah menunjukkan bahwa kultur

bakteri dari tanah sebenarnya memilih spesies yang kurang berlimpah, atau anggota “biosfer langka

tanah” (Shade et al., 2012) (lihat juga Kasus Studi 4.2 dan Bagian 10.3.1.2). Dengan demikian,

mikroba ini dapat menunjukkan tahap pertumbuhan yang dijelaskan dalam Bagian 3.2 untuk kultur

batch dan berkelanjutan, tetapi pola tahapannya sangat berbeda seperti yang dijelaskan pada bagian

berikut.

3.3.1 Fase Lag

Fase lag yang diamati dalam lingkungan alami bisa jauh lebih lama daripada fase lag yang biasanya

diamati dalam kultur batch. Dalam beberapa kasus, fase jeda yang lebih lama ini mungkin disebabkan

oleh sangat sedikit populasi awal yang mampu memetabolisme substrat tambahan. Perhatikan juga

bahwa bahan kimia yang manusia anggap sebagai kontaminan organik dapat menjadi sumber substrat
yang berguna untuk pertumbuhan bagi mikroba-mikroba tersebut dengan sekumpulan enzim yang

diperlukan untuk menurunkan kontaminan. Dalam hal ini, tidak ada hilangnya kontaminan maupun a

peningkatan jumlah sel yang signifikan akan diamati selama beberapa generasi. Perhatikan bahwa

dalam budaya murni, transisi antara fase lag dan eksponensial didefinisikan terjadi setelah populasi

awal meningkat dua kali lipat. Namun, ini adalah definisi yang sulit untuk diterapkan di lingkungan,

di mana sulit untuk secara akurat mengukur penggandaan subset kecil dari komunitas mikroba yang

menanggapi penambahan nutrisi termasuk kontaminan. Atau, populasi yang mampu memetabolisme

substrat mungkin tidak aktif atau terluka, dan memerlukan waktu untuk pulih secara fisiologis dan

melanjutkan aktivitas metabolisme. Lebih lanjut menyulitkan pertumbuhan di lingkungan adalah fakta

bahwa waktu generasi biasanya jauh lebih lama daripada yang diukur dalam kondisi laboratorium

yang ideal. Hal ini disebabkan kombinasi ketersediaan nutrisi yang terbatas dan kondisi lingkungan

seperti suhu atau kelembaban yang tidak optimal untuk mikroba tertentu. Dengan demikian, tidak

biasa untuk mengamati periode jeda berbulan-bulan atau bahkan bertahun-tahun setelah aplikasi awal

pestisida antropogenik yang baru disintesis, untuk degradasi yang signifikan untuk diamati. Namun,

begitu lingkungan telah terpapar pestisida baru dan mengembangkan komunitas untuk degradasinya,

degradasi aplikasi pestisida yang berhasil akan terjadi dengan periode jeda yang semakin pendek.

Fenomena ini disebut aklimasi atau adaptasi, dan telah diamati dengan aplikasi berturut-turut dari

banyak pestisida termasuk herbisida 2,4-asam asam klorida daun lebar (2,4-D) (Newby et al., 2000).

Penjelasan kedua untuk periode jeda panjang di lingkungan adalah bahwa komunitas dengan mikroba

yang secara genetik mampu memanfaatkan sumber karbon tertentu mungkin awalnya tidak ada dalam

populasi yang ada. Situasi ini mungkin memerlukan mutasi atau peristiwa transfer gen untuk

memperkenalkan gen degradatif yang sesuai ke dalam mikroba asli. Sebagai contoh, salah satu kasus

transfer gen yang terdokumentasi pertama di dalam tanah adalah transfer plasmid pJP4 dari organisme

yang diperkenalkan ke populasi tanah asli. Pemindahan plasmid menghasilkan degradasi herbisida

2,4-D yang cepat dan lengkap dalam mikrokosmos (Studi Kasus 3.1). Dalam studi ini, transfer gen ke
penerima tanah adat diikuti oleh pertumbuhan dan kelangsungan hidup transconjugants pada tingkat

yang cukup signifikan untuk mempengaruhi degradasi. Masih ada beberapa studi seperti itu, dan

kemungkinan dan frekuensi transfer gen di lingkungan adalah topik yang saat ini sedang

diperdebatkan.

3.3.2 Fase Eksponensial

Di lingkungan, fase kedua pertumbuhan, pertumbuhan eksponensial, terjadi hanya untuk periode

waktu yang sangat singkat setelah penambahan substrat. Substrat tersebut dapat berupa residu

tanaman, serasah vegetatif, residu akar atau kontaminan yang ditambahkan atau tumpah ke

lingkungan. Setelah penambahan substrat, itu adalah sel zymogenous, banyak

yang awalnya tidak aktif, yang paling cepat merespon nutrisi tambahan. Setelah penambahan substrat,

sel-sel aktif ini menjadi aktif secara fisiologis dan secara singkat memasuki fase eksponensial sampai

substrat digunakan, atau sampai beberapa faktor pembatas menyebabkan penurunan degradasi

substrat. Dengan demikian, dalam banyak sampel lingkungan, bakteri bergantian antara periode

pendek pertumbuhan eksponensial atau seimbang dan pertumbuhan nongrowth atau tidak seimbang

berikutnya (Schaechter et al., 2006). Dengan demikian, bakteri tersebut dapat secara konstan

meninggalkan dan memasuki kembali fase diam. Seperti yang ditunjukkan pada Tabel 3.1, jumlah sel

yang dapat dikultur dengan cepat meningkatkan satu hingga dua orde magnitudo dalam menanggapi

penambahan 1% glukosa. Dalam percobaan ini, empat tanah yang berbeda dibiarkan tidak diobati atau

diubah dengan glukosa 1% dan diinkubasi pada suhu kamar selama 1 minggu. Karena tingkat nutrisi

dan faktor-faktor lain, mis., Suhu atau kelembaban, jarang ideal, sel-sel di lingkungan jarang

mencapai tingkat pertumbuhan yang sama dengan μmax. Dengan demikian, tingkat pertumbuhan di

lingkungan lebih lambat daripada tingkat pertumbuhan yang diukur dalam kondisi laboratorium. Ini

diilustrasikan dalam Tabel 3.2, yang membandingkan laju metabolisme atau degradasi gandum dan
jerami gandum di lingkungan laboratorium dengan laju degradasi di lingkungan alami. Ini termasuk:

tanah tropis Nigeria yang mengalami periode kering; tanah Inggris yang terpapar iklim sedang, basah;

dan tanah dari Saskatoon, Kanada, yang mengalami musim dingin dan musim panas yang kering.

Seperti yang ditunjukkan pada Tabel 3.2, tingkat relatif degradasi jerami dalam kondisi laboratorium

dua kali lebih cepat di tanah Nigeria, delapan kali lebih cepat daripada di tanah Inggris dan 18 kali

lebih cepat daripada di tanah Kanada. Contoh ini menggambarkan pentingnya pemahaman bahwa ada

perbedaan besar antara tingkat degradasi di laboratorium dan di lingkungan alami. Pemahaman ini

sangat penting ketika mencoba untuk memprediksi tingkat degradasi kontaminan di lingkungan.

3.3.3 Fase Stasioner dan Kematian

Fase diam di laboratorium adalah periode waktu di mana ada pertumbuhan sel aktif yang cocok

dengan kematian sel. Dalam kultur batch, jumlah sel meningkat dengan cepat ke level setinggi 1010

hingga 1011 CFU / ml. Pada titik ini, substrat digunakan sepenuhnya atau limbah metabolit

menghambat pertumbuhan lebih lanjut. Ingatlah bahwa sebagian besar sel hanya akan mencapai fase

eksponensial untuk periode waktu singkat karena keterbatasan nutrisi dan tekanan lingkungan.

Sebaliknya, mereka cenderung tidak aktif atau dalam kondisi pemeliharaan. Sel-sel yang mengalami

pertumbuhan sebagai respons terhadap perubahan nutrisi akan dengan cepat memanfaatkan sumber

makanan yang ditambahkan. Namun, bahkan dengan sumber makanan tambahan, jumlah budaya

jarang melebihi 108 hingga 109 CFU / g tanah kecuali mungkin pada beberapa permukaan akar. Pada

titik ini, sel-sel akan mati atau, untuk memperpanjang kelangsungan hidup, mereka

CASE STUDY

Biodegradasi kontaminan dalam tanah membutuhkan keberadaan gen degradatif yang sesuai dalam

populasi tanah. Jika gen degradatif tidak ada dalam populasi tanah, durasi fase lag untuk degradasi
kontaminan dapat berkisar dari bulan ke tahun. Salah satu strategi untuk merangsang biodegradasi

adalah "memperkenalkan" mikroba yang merusak ke dalam tanah. Sayangnya, kecuali ada tekanan

selektif untuk memungkinkan organisme yang diperkenalkan untuk bertahan hidup dan tumbuh, itu

akan mati dalam beberapa minggu sebagai akibat dari stres abiotik dan persaingan dari mikroba asli.

DiGiovanni et al. (1996) menunjukkan bahwa alternatif untuk "mikroba yang diperkenalkan" adalah

"gen yang diperkenalkan." Dalam penelitian ini mikroba yang diperkenalkan adalah Ralstonia

eutrophus JMP134. JMP134 membawa plasmid 80-kb, pJP4, yang mengkode enzim awal yang

diperlukan untuk degradasi herbisida 2,4-D. Serangkaian mikrokosmos tanah dibuat dan

terkontaminasi dengan 2,4-D. Dalam mikrokosmos kontrol, ada degradasi lambat 2,4-D yang tidak

lengkap selama periode 9 minggu (lihat gambar). Dalam set mikrokosmos kedua, JMP134

ditambahkan untuk memberikan inokulum akhir 105 CFU / g tanah kering. Dalam mikrokosmos ini,

degradasi cepat 2,4-D terjadi setelah a

Fase lag 1 minggu dan 2,4-D benar-benar terdegradasi setelah 4 minggu. Para ilmuwan memeriksa

populasi degradasi mikrokosmos 2,4-D dengan sangat hati-hati selama penelitian ini. Apa yang

mereka temukan mengejutkan. Mereka tidak dapat memulihkan mikroba JMP134 yang layak setelah

minggu pertama. Namun, selama minggu 2 dan 3 mereka mengisolasi dua organisme baru yang dapat

menurunkan 2,4-D. Setelah diperiksa lebih dekat, kedua organisme, Pseudomonas glathei dan

Burkholderia caryophylli, dan ditemukan membawa plasmid pJP4! Akhirnya, selama minggu ke 5

degrader 2,4-D ketiga diisolasi, Burkholderia cepacia. Isolat ini juga membawa plas-mid pJP4.

Penambahan 2,4-D ke mikrokosmos mengakibatkan degradasi herbisida yang cepat, terutama oleh

isolat ketiga, B. cepacia. Meskipun jelas dari penelitian ini bahwa plasmid pJP4 ditransfer dari

mikroba yang diperkenalkan ke beberapa populasi asli, tidak jelas bagaimana transfer terjadi. Ada dua

kemungkinan: kontak sel ke sel dan transfer plasmid melalui konjugasi atau kematian, dan lisis sel

JMP134 untuk melepaskan plasmid pJP4 yang kemudian diambil oleh populasi asli, suatu proses yang

disebut transformasi.
TABEL 3.1

dapat memasuki kembali fase dorman sampai sumber nutrisi baru tersedia. Dengan demikian, periode

fase diam stasioner cenderung sangat pendek, mirip dengan pertumbuhan eksponensial. Sebaliknya,

fase kematian dalam sampel lingkungan tentu dapat diamati, setidaknya dalam hal jumlah yang dapat

dikultur. Begitu nutrisi tambahan dikonsumsi, sel-sel hidup dan mati menjadi mangsa protozoa yang

bertindak sebagai predator mikroba. Bacteriophage juga dapat menginfeksi dan melisiskan bagian

signifikan dari komunitas bakteri yang hidup. Sel-sel mati juga dengan cepat diambil oleh mikroba

lain di sekitarnya, yang menggunakan kembali substrat karbon dan nitrogen yang tersedia. Dengan

demikian, jumlah sel yang dapat dikultur meningkat sebagai respons terhadap penambahan nutrisi

(lihat Tabel 3.1), tetapi akan menurun lagi secepat tingkat latar belakang setelah semua nutrisi telah

digunakan.

3.4 SALDO PERTUMBUHAN MASSA

Selama pertumbuhan biasanya ada peningkatan massa sel yang tercermin dalam peningkatan jumlah

sel. Dalam hal ini, dapat dikatakan bahwa sel-sel sedang memetabolisme substrat dalam kondisi

pertumbuhan. Namun, dalam beberapa kasus, ketika konsentrasi substrat atau nutrisi lain terbatas,

pemanfaatan substrat terjadi tanpa produksi sel baru. Dalam hal ini, energi dari pemanfaatan substrat

digunakan untuk memenuhi persyaratan pemeliharaan sel dalam kondisi nongrowth. Tingkat energi

yang dibutuhkan untuk memelihara sel disebut energi pemeliharaan (Neidhardt et al., 1990). Dalam

kondisi pertumbuhan atau tidak, jumlah energi yang diperoleh oleh mikroorganisme melalui oksidasi

substrat tercermin dalam jumlah

massa sel yang diproduksi, atau hasil sel (Y). Seperti dibahas dalam Bagian 3.1.5, koefisien hasil sel

didefinisikan sebagai jumlah massa sel yang diproduksi per jumlah substrat yang dikonsumsi.

Meskipun hasil sel adalah konstan, nilai hasil sel tergantung pada substrat yang digunakan. Secara

umum, semakin berkurang substrat, semakin besar jumlah energi yang dapat diperoleh melalui

oksidasi. Sebagai contoh, secara umum diasumsikan bahwa sekitar setengah dari karbon dalam

molekul gula atau asam organik akan digunakan untuk membangun massa sel baru, dan setengahnya

akan berevolusi sebagai CO2, sesuai dengan hasil sel sekitar 0,4. Perhatikan bahwa molekul glukosa

(C6H12O6) sebagian teroksidasi karena molekul tersebut mengandung enam atom oksigen. Kita

dapat membandingkan ini dengan hasil sel yang sangat rendah 0,05 untuk pentaklorofenol, yang

sangat teroksidasi karena keberadaan lima atom klor, dan hasil sel yang sangat tinggi 1,49 untuk

oktadekana, yang sepenuhnya berkurang (Gambar 3.12). Seperti yang ditunjukkan contoh-contoh ini,

beberapa substrat mendukung tingkat pertumbuhan dan produksi massa sel yang lebih tinggi daripada

yang lain. Kita bisa mengeksplorasi lebih jauh mengapa ada perbedaan dalam hasil sel untuk ketiga

substrat ini. Saat mikroba berevolusi, jalur katabolik standar telah dikembangkan untuk substrat yang

mengandung karbohidrat dan protein. Untuk jenis media ini, sekitar setengah dari karbon digunakan

untuk membangun massa sel baru. Ini diterjemahkan menjadi hasil sel sekitar 0,4 untuk gula seperti

glukosa (lihat Contoh Perhitungan 3.4). Namun, sejak industrialisasi dimulai pada akhir 1800-an,

banyak molekul baru telah diproduksi yang tidak ada jalur katabolik standar. Pentachlorophenol

adalah contoh molekul semacam itu. Bahan ini telah diproduksi secara komersial sejak 1936, dan

merupakan salah satu bahan kimia utama yang digunakan untuk merawat kayu dan tiang listrik. Untuk

memanfaatkan molekul seperti pentachlorophenol, yang muncul di lingkungan relatif baru-baru ini

pada skala evolusi, mikroba harus mengubah struktur kimia untuk memungkinkan penggunaan jalur

katabolik standar. Untuk pentachlorophenol, yang memiliki lima ikatan karbon klorin, ini artinya

EXAMPLE 3.4
bahwa mikroba harus mengeluarkan banyak energi untuk memutus ikatan karbon halogen yang kuat

sebelum substrat dapat dimetabolisme untuk menghasilkan energi. Karena begitu banyak energi yang

diperlukan untuk menghilangkan klorin dari pentaklorofenol, relatif sedikit energi yang tersisa untuk

membangun massa sel baru. Ini menghasilkan nilai hasil sel yang sangat rendah. Sebaliknya, mengapa

sel menghasilkan sangat tinggi untuk hidrokarbon seperti oktana? Octadecane adalah hidrokarbon

khas yang ditemukan dalam produk minyak bumi (lihat Bab 17). Karena minyak bumi adalah

campuran kuno dari molekul yang terbentuk di Bumi awal, jalur katabolik standar ada untuk sebagian

besar komponen minyak bumi, termasuk oktadekana. Nilai hasil sel untuk pertumbuhan pada

octadecane tinggi karena octadecane adalah molekul jenuh (molekul tidak mengandung oksigen,

hanya ikatan hidrogen karbon). Hidrokarbon yang sangat tereduksi menyimpan lebih banyak energi

daripada molekul yang teroksidasi sebagian seperti glukosa (glukosa mengandung enam molekul

oksigen). Energi ini dilepaskan selama metabolisme, memungkinkan mikroba untuk mendapatkan

lebih banyak energi dari degradasi oktadekana daripada dari degradasi glukosa. Ini pada gilirannya

tercermin dalam nilai hasil sel yang lebih tinggi.

3.4.1 Kondisi Aerobik

Di bawah kondisi aerob, mikroorganisme memetabolisme substrat dengan proses yang dikenal

sebagai respirasi aerob. Itu

oksidasi lengkap substrat dalam kondisi aerobik diwakili oleh persamaan keseimbangan massa:

ðC6H12O6Þ substrat 1 6ðO2Þ oksigen - 6ðCO2Þ karbon dioksida 1 6ðH2OÞ air (Persamaan 3.19)

Dalam Persamaan. 3,19, substrat adalah karbohidrat seperti glukosa, yang dapat diwakili oleh rumus

C6H12O6. Oksidasi glukosa oleh mikroorganisme lebih kompleks daripada yang diperlihatkan dalam
persamaan ini karena beberapa karbon substrat digunakan untuk membangun massa sel baru, dan

karenanya tidak sepenuhnya teroksidasi. Dengan demikian, oksidasi glukosa mikroba aerob dapat

lebih lengkap dijelaskan dengan persamaan keseimbangan massa berikut: sedikit lebih kompleks:

substrat aðC6H12O6Þ

1 bðNH3Þ sumber nitrogen

1 cðO2Þ oksigen

massa sel dðC5H7NO2Þ

1 eðCO2Þ karbon dioksida

1 fðH2OÞ air

(Persamaan 3.20)

di mana a, b, c, d, e dan f mewakili angka mol. Harus ditekankan bahwa proses degradasi adalah sama

apakah substrat mudah digunakan (glukosa) atau hanya digunakan secara perlahan seperti dalam

kasus kontaminan seperti benzena. Persamaan 3.20 berbeda dari Persamaan. 3.19 dalam dua cara: ini

mewakili produksi massa sel baru, diperkirakan dengan rumus C5H7NO2, dan untuk

menyeimbangkan persamaan, ia memiliki sumber nitrogen pada sisi reaktan, yang ditampilkan di sini

sebagai amonia (NH3).

Persamaan keseimbangan massa memiliki sejumlah aplikasi praktis. Dapat digunakan untuk

memperkirakan jumlah oksigen atau nitrogen yang dibutuhkan untuk pertumbuhan dan pemanfaatan

substrat tertentu. Ini berguna untuk pengolahan air limbah (Bab 25), untuk produksi produk mikroba

bernilai tinggi (mis., Antibiotik atau vitamin) dan untuk remediasi situs yang terkontaminasi (lihat

Bab 17 dan Contoh Perhitungan 3.5).

3.4.2 Kondisi anaerob

Jumlah oksigen di atmosfer (21%) memastikan degradasi aerobik untuk proporsi besar bahan organik

yang diproduksi setiap tahun. Dengan tidak adanya oksigen, substrat organik dapat termineralisasi

menjadi karbon dioksida dengan fermentasi atau dengan respirasi anaerob, meskipun ini adalah proses

yang kurang efisien daripada respirasi aerob (lihat Kotak Informasi 3.2). Secara umum, metabolisme

anaerob terbatas pada ceruk jenuh air seperti sedimen, badan air yang terisolasi di dalam danau dan

lautan, dan lingkungan mikro di tanah. Degradasi anaerob membutuhkan akseptor elektron alternatif,

baik senyawa organik untuk fermentasi, atau salah satu dari serangkaian akseptor elektron anorganik

untuk respirasi anaerob (Tabel 3.3). Selama respirasi anaerob, akseptor elektron terminal yang

digunakan tergantung pada ketersediaan, dan mengikuti urutan yang sesuai dengan afinitas elektron

akseptor elektron. Contoh akseptor elektron alternatif dalam urutan penurunan afinitas elektron

adalah: nitrat (kondisi pereduksi nitrat); mangan (kondisi pereduksi mangan); besi (kondisi pereduksi

besi); sulfate (kondisi pereduksi sulfat); dan karbonat (kondisi metanogenik). Baru-baru ini, akseptor

elektron terminal tambahan telah diidentifikasi, di antaranya arsenate, arsenite, selenate, dan uranium

IV (Stolz et al., 2006). Ini mungkin penting di lingkungan di mana mereka dapat ditemukan dalam

kelimpahan.

Seringkali, dalam kondisi anaerob, senyawa organik terdegradasi oleh kelompok interaktif atau

konsorsium mikroorganisme. Individu dalam konsorsium masing-masing melakukan reaksi khusus

yang berbeda yang bersama-sama mengarah pada mineralisasi lengkap senyawa (Stams et al., 2006).

Langkah terakhir degradasi anaerob adalah metanogenesis, yang terjadi ketika akseptor elektron

anorganik lainnya seperti nitrat dan sulfat habis. Metanogenesis menghasilkan produksi metana dan

merupakan jenis metabolisme terpenting dalam sedimen danau air tawar anoksik. Metanogenesis juga

penting dalam pengolahan anaerobik lumpur limbah, di mana pasokan nitrat atau sulfat sangat kecil

dibandingkan dengan input substrat organik. Dalam hal ini, meskipun konsentrasi nitrat dan sulfat

rendah, mereka sangat penting untuk pembentukan dan pemeliharaan potensi elektron yang cukup

rendah yang memungkinkan

proliferasi komunitas mikroba metanogenik yang kompleks. Persamaan keseimbangan massa sangat

mirip dengan yang untuk respirasi aerob dapat ditulis untuk respirasi anaerob. Sebagai contoh,

persamaan berikut dapat digunakan untuk menggambarkan transformasi bahan organik menjadi

metana (CH4) dan CO2:

CnHaOb 1 n2

a2

b 4 H2O

n2

a8

b 4 CO2 1 n 2

a8

b 4 CH4 (Persamaan 3.21)

di mana n, a dan b mewakili angka mol. Perhatikan bahwa setelah biodegradasi terjadi, karbon

substrat ditemukan dalam bentuk yang paling teroksidasi, CO2, atau dalam bentuk yang paling

berkurang, CH4. Ini disebut disproporsionasi karbon organik. Rasio metana terhadap karbon dioksida

yang ditemukan dalam campuran gas yang dihasilkan dari degradasi anaerob tergantung pada keadaan

oksidasi substrat yang digunakan. Karbohidrat dikonversi menjadi CH4 dan CO2 dalam jumlah yang

kira-kira sama. Substrat yang lebih tereduksi seperti metanol atau lipid menghasilkan jumlah metana
yang relatif lebih tinggi, sedangkan substrat yang lebih teroksidasi seperti asam format atau asam

oksalat menghasilkan metana yang relatif lebih sedikit.

CHAPTER 8

8.1 TANAH DAN SEDIMEN

Tanah adalah lingkungan terputus-putus, heterogen yang mengandung sejumlah besar organisme

beragam. Seperti dijelaskan dalam Bab 4, komunitas mikroba tanah bervariasi dengan kedalaman dan

jenis tanah, dengan horizon permukaan tanah umumnya memiliki lebih banyak organisme daripada

horizon bawah permukaan. Masyarakat juga bervariasi dari satu situs ke situs lainnya, dan bahkan di

dalam situs karena variasi microsite alami yang dapat memungkinkan mikroorganisme yang sangat

berbeda untuk hidup berdampingan secara berdampingan. Karena variabilitas yang besar dalam

masyarakat, seringkali perlu mengambil lebih dari satu sampel untuk mendapatkan sampel mikroba

yang representatif di lokasi tertentu. Oleh karena itu, strategi pengambilan sampel secara keseluruhan
akan tergantung pada banyak faktor, termasuk tujuan analisis, sumber daya yang tersedia, dan

karakteristik lokasi. Pendekatan yang paling akurat adalah dengan mengambil banyak sampel di

dalam lokasi tertentu dan melakukan analisis terpisah dari masing-masing sampel. Namun, dalam

banyak kasus, waktu dan upaya dapat dilestarikan dengan menggabungkan sampel yang diambil

untuk membentuk sampel komposit yang dianalisis, sehingga membatasi jumlah analisis yang perlu

dilakukan. Pendekatan lain yang sering digunakan adalah mengambil sampel situs secara berurutan

waktu dari lokasi kecil yang ditentukan untuk menentukan efek temporal pada mikroba. Karena

begitu banyak pilihan yang tersedia, penting untuk menggambarkan strategi pengambilan sampel

untuk memastikan bahwa jaminan kualitas ditangani. Ini dilakukan dengan mengembangkan rencana

proyek penjaminan kualitas (QAPP) sesuai dengan pedoman yang ditunjukkan dalam Kotak Informasi

8.1.

8.1.1 Strategi dan Metode Pengambilan Sampel untuk Tanah Permukaan

Sampel tanah curah mudah diperoleh dengan sekop atau, lebih baik lagi, auger tanah (Gambar 8.1).

Auger tanah lebih tepat daripada sekop sederhana karena mereka memastikan bahwa sampel diambil

dengan kedalaman yang sama persis pada setiap kesempatan. Ini penting, karena beberapa faktor

tanah dapat sangat bervariasi dengan kedalaman, seperti oksigen, kadar air, kadar karbon organik, dan

suhu tanah. Auger tangan sederhana berguna untuk mengambil sampel tanah dangkal dari daerah

yang tidak jenuh. Dengan kondisi yang tepat, hand auger dapat digunakan untuk mengambil sampel

hingga kedalaman 180 cm dalam peningkatan 30 cm. Namun, ada beberapa tanah

Kotak Informasi 8.1 Spesifikasi Pengumpulan dan Penyimpanan untuk Rencana Proyek Penjaminan
Mutu (QAPP) QAPP melibatkan penggambaran rincian strategi pengambilan sampel, metode
pengambilan sampel, dan penyimpanan selanjutnya dari semua sampel. QAPP biasanya juga
mencakup rincian dari analisis mikroba yang diusulkan untuk dilakukan pada sampel tanah. l Strategi
pengambilan sampel: Jumlah dan jenis sampel, lokasi, kedalaman, waktu, interval l Metode
pengambilan sampel: Teknik dan peralatan spesifik yang akan digunakan l Penyimpanan sampel:
Jenis wadah, metode pengawetan, waktu penahanan maksimum
terlalu padat atau mengandung terlalu banyak batuan untuk memungkinkan pengambilan sampel
sedalam ini. Saat mengambil sampel untuk analisis mikroba, pertimbangan harus diberikan pada
kontaminasi yang dapat terjadi ketika auger didorong ke dalam tanah. Dalam hal ini, mikroba yang
menempel pada sisi auger saat dimasukkan ke dalam tanah dan didorong ke bawah dapat mencemari
inti selanjutnya yang diambil. Untuk meminimalkan kontaminasi tersebut, seseorang dapat
menggunakan spatula steril untuk mengikis lapisan luar inti dan menggunakan bagian dalam inti
untuk analisis. Kontaminasi juga dapat terjadi di antara sampel, tetapi ini dapat dihindari dengan
membersihkan auger setelah setiap sampel diambil. Prosedur pembersihan melibatkan mencuci auger
dengan air, kemudian membilasnya dengan etanol 75% atau 10% pemutih, dan akhirnya membilasnya
dengan air steril. Sampel komposit dapat diperoleh dengan mengumpulkan jumlah tanah yang sama
dari sampel yang diambil di area yang luas dan menempatkannya dalam ember atau kantong plastik.
Seluruh massa tanah kemudian dicampur dan menjadi sampel komposit. Untuk mengurangi volume
sampel yang akan disimpan, sebagian sampel komposit dapat dihilangkan, dan ini menjadi sampel
untuk dianalisis. Dalam semua kasus, sampel harus disimpan di es sampai diolah dan dianalisis.

Dalam beberapa kasus, serangkaian plot atau ladang eksperimental perlu disampel untuk menguji efek
perubahan tanah, seperti pupuk, lumpur pestisida atau limbah cair, pada komunitas mikroba. Dalam
hal ini, sampel tanah harus diambil dari masing-masing dari beberapa plot atau bidang untuk
membandingkan kontrol plot yang tidak diolah dengan plot yang telah menerima amandemen.
Sebagai contoh, seorang peneliti mungkin tertarik pada pengaruh pupuk nitrogen anorganik pada
populasi nitrifikasi tanah. Penyelidik kemudian akan sampel plot yang tidak diubah (kontrol) untuk
perbandingan dengan plot yang telah diperlakukan dengan pupuk anorganik. Contoh lain adalah kasus
di mana tanah yang diubah dengan lumpur limbah diambil sampelnya untuk analisis patogen virus
berikutnya. Dalam salah satu contoh, banyak sampel atau ulangan selalu memberikan perkiraan yang
lebih halus dari parameter yang menarik. Namun, kerja lapangan bisa mahal dan jumlah sampel yang
diambil harus ditimbang dengan biaya analisis dan dana yang tersedia. Dalam contoh yang diberikan,
rencana pengambilan sampel dua dimensi dapat digunakan untuk menentukan jumlah dan lokasi
sampel yang diambil. Dalam pengambilan sampel dua dimensi, setiap plot diberi koordinat spasial
dan menetapkan titik pengambilan sampel dipilih sesuai dengan rencana yang telah ditetapkan.
Beberapa pola pengambilan sampel dua dimensi yang khas, termasuk pengambilan sampel acak,
transek, dua tahap dan kisi, diilustrasikan dalam Gambar 8.2. Pengambilan sampel acak melibatkan
pemilihan titik-titik acak dalam plot yang diinginkan, yang kemudian disampel menjadi kedalaman
yang ditentukan. Pengambilan sampel transek melibatkan pengumpulan sampel dalam satu arah.
Misalnya, pengambilan sampel transek mungkin berguna di daerah tepi sungai, di mana transek dapat
dipilih berdekatan dengan streambed dan pada sudut kanan ke streambed. Dengan cara ini, pengaruh
aliran pada komunitas mikroba dapat dievaluasi. Dalam pengambilan sampel dua tahap, suatu area
dipecah menjadi subunit biasa yang disebut unit primer. Dalam setiap unit primer,

subsampel dapat diambil secara acak atau sistematis. Pendekatan ini mungkin berguna ketika situs

terdiri dari lereng bukit dan dataran tinggi, dan ada kemungkinan ada perbedaan antara unit-unit

primer. Contoh terakhir dari pola pengambilan sampel adalah pengambilan sampel grid, di mana

sampel diambil secara sistematis secara berkala pada jarak yang tetap. Jenis pengambilan sampel ini

berguna untuk memetakan suatu daerah ketika sedikit yang diketahui tentang variabilitas dalam tanah.

Pengambilan sampel dua dimensi tidak memberikan informasi apa pun tentang perubahan komunitas
mikroba dengan kedalaman. Oleh karena itu, pengambilan sampel tiga dimensi digunakan ketika

informasi mengenai kedalaman diperlukan. Informasi mendalam seperti itu sangat penting ketika

mengevaluasi lokasi yang telah terkontaminasi oleh pembuangan yang tidak tepat, atau tumpahan

kontaminan. Pengambilan sampel tiga dimensi dapat sesederhana mengambil sampel dengan

peningkatan kedalaman 50 cm hingga kedalaman 200 cm, atau dapat melibatkan pengeboran beberapa

ratus meter ke zona vadose bawah permukaan. Untuk pengambilan sampel bawah permukaan,

peralatan khusus diperlukan, dan penting untuk memastikan bahwa sampel di bawah permukaan tidak

terkontaminasi oleh tanah permukaan. Akhirnya, perhatikan bahwa ada zona khusus tanah yang

berada di bawah pengaruh akar tanaman. Ini dikenal sebagai rizosfer, yang merupakan minat khusus

bagi ahli mikrobiologi tanah dan ahli patologi tanaman karena peningkatan aktivitas mikroba dan

interaksi mikroba tanaman tertentu (lihat Bab 16). Tanah Rhizosphere ada sebagai kontinum dari

permukaan akar (rhizoplane) ke titik di mana akar tidak memiliki pengaruh pada sifat mikroba

(umumnya 2 10 mm). Dengan demikian, volume tanah rizosfer bervariasi dan sulit untuk diambil

sampelnya. Biasanya, akar digali dengan hati-hati dan diguncang dengan lembut untuk

menghilangkan tanah curah atau non-rhizosfer. Tanah yang menempel pada akar tanaman kemudian

dianggap sebagai tanah rizosfer. Meskipun ini adalah mekanisme pengambilan sampel kasar, itu tetap

utuh sampai hari ini. Akibatnya, pengambilan sampel rhizosphere tetap menjadi keterbatasan

eksperimental utama, terlepas dari kecanggihan analisis mikroba yang kemudian dilakukan.

8.1.2 Strategi dan Metode Pengambilan Sampel untuk Bawah Permukaan

Pendekatan mekanis menggunakan rig pengeboran diperlukan untuk pengambilan sampel lingkungan

bawah permukaan. Ini secara signifikan meningkatkan biaya pengambilan sampel, terutama untuk

permukaan bawah laut yang dalam. Akibatnya, beberapa inti telah diambil di bawah permukaan yang

dalam, dan upaya coring ini telah melibatkan tim peneliti besar (lihat Studi Kasus 4.4). Pendekatan

yang digunakan untuk pengambilan sampel baik lingkungan bawah permukaan yang dalam atau
dangkal tergantung pada apakah permukaan bawahnya jenuh atau tidak jenuh. Untuk sistem tak jenuh,

pengeboran putar udara dapat digunakan untuk mendapatkan sampel dari kedalaman hingga beberapa

ratus meter (Chapelle, 1992). Di udara

pengeboran berputar, kompresor besar digunakan untuk memaksa udara turun pipa bor, keluar mata

bor, dan naik di luar lubang bor (Gambar 8.3). Saat barel inti memotong ke bawah, udara berfungsi

untuk meniup potongan bor keluar dari lubang dan juga untuk mendinginkan barel inti. Ini penting,

karena jika barel inti terlalu panas, mikroba dalam sampel dapat disterilkan secara efektif, sehingga

menyulitkan analisis mikroba berikutnya. Dalam pengeboran udara normal, sejumlah kecil air yang

mengandung surfaktan diinjeksikan ke aliran udara untuk mengendalikan debu dan membantu

mendinginkan mata bor. Namun, ini meningkatkan kemungkinan kontaminasi, sehingga inti seperti

yang dibor di Dataran Sungai Ular Idaho (lihat Bagian 4.6.2.1) telah dibor dengan udara saja

(Colwell, 1989). Untuk menjaga agar inti barel tetap dingin, coring dilakukan dengan sangat lambat

untuk menghindari panas berlebih. Untuk membantu menjaga kondisi steril dan mencegah

kontaminasi dari udara permukaan, semua udara yang digunakan dalam proses coring disaring melalui

filter 0,3 µm efisiensi tinggi partikulat udara (HEPA) filter (lihat Bagian 5.8.2). Segera setelah inti

dikumpulkan, permukaan lapisan dikikis dengan spatula steril, dan kemudian subcore diambil

menggunakan jarum suntik plastik steril 60 ml dengan ujung dilepas. Sampel segera dibekukan dan

dikirim ke laboratorium, di mana analisis mikroba dimulai dalam 18 jam pengumpulan. Lingkungan

bawah permukaan jenuh adalah sampel yang agak berbeda karena sedimen jauh lebih sedikit

kohesif daripada yang ditemukan di daerah tak jenuh. Oleh karena itu, lubang bor harus dipegang

terbuka agar inti yang utuh dapat diambil dan dihilangkan pada setiap kedalaman yang diinginkan.

Untuk pengambilan sampel kedalaman hingga 30 m, bor auger batang berlubang dengan sampel

tabung dorong digunakan secara luas (Gambar 8.4). Auger terdiri dari tabung hampa dengan sedikit

berputar di ujung yang mengebor lubang. Bagian luar casing auger berlubang terbalik ulir sehingga

stek didorong ke atas dan keluar dari lubang saat hasil pengeboran. Saat lubang bor dibor, selubung
auger dibiarkan di tempat untuk menjaga lubang bor terbuka. Jadi, selongsong bertindak sebagai

selongsong ke mana tabung kedua, tabung inti, dimasukkan untuk mengumpulkan sampel ketika

kedalaman yang diinginkan telah tercapai. Barel inti pada dasarnya adalah tabung steril yang

ditempatkan di ujung auger-batang berongga, didorong ke bawah untuk mengumpulkan sampel

sedimen, dan kemudian diambil. Pengeboran kemudian dapat melanjutkan ke kedalaman yang

diinginkan berikutnya dan proses coring diulang. Setiap inti yang dikumpulkan ditutup, dibekukan,

dan dikirim ke laboratorium untuk dipelajari. Untuk menghindari kontaminasi sampel, bagian luar inti

dikikis habis atau inti dapat disubktur.

Untuk core yang lebih dalam dari 30 m, mud rotary coring digunakan (Chapelle, 1992). Dalam hal ini,
lubang itu lagi bosan menggunakan bit yang berputar. Namun, cairan pengeboran digunakan untuk
menghilangkan potongan lubang bor dan untuk memberikan tekanan pada dinding lubang bor agar
tidak runtuh. Pengeboran lumpur berputar telah digunakan untuk mendapatkan sampel sedimen
hingga 1000 m di bawah permukaan tanah. Contoh inti semacam itu diambil dari sedimen bawah
permukaan yang dalam di Dataran Pesisir Tenggara di South Carolina (lihat Studi Kasus 4.4). Selama
coring ini, sampel diambil dari kedalaman mulai dari 400 hingga 500 m. Untuk memastikan integritas
inti yang diperoleh, cairan pengeboran dibubuhi dua pelacak, kalium bromida dan pewarna rhodamin.
Penggunaan dua pelacak ini memungkinkan para peneliti untuk mengevaluasi seberapa jauh cairan
pengeboran telah menembus ke dalam inti. Setiap area inti yang terkontaminasi pelacak harus
dibuang. Inti diambil dalam liner plastik, dibekukan, dan dikirim untuk analisis segera. Penting untuk
menekankan bahwa coring baik lingkungan jenuh atau tidak jenuh adalah proses yang sulit

untuk beberapa alasan. Pertama, mungkin perlu bertahun-tahun untuk merencanakan dan memperoleh

dana untuk melanjutkan dengan inti seperti yang dijelaskan di sini untuk Dataran Sungai Ular dan

Dataran Pantai Tenggara. Pengeboran dan pemulihan sampel yang sebenarnya adalah masalah teknik

yang kecanggihannya hanya disentuh pada bagian ini. Juga perlu diingat bahwa inti yang diperoleh

tidak selalu benar-benar mewakili sedimen yang darinya diambil. Sebagai contoh, inti 1-m dapat

dikompresi secara signifikan dalam proses coring sehingga sulit untuk mengidentifikasi secara tepat

kedalaman dari mana ia diambil. Kesulitan kedua dalam mendapatkan sampel yang representatif

adalah karena heterogenitas horizontal dalam bahan bawah permukaan. Heterogenitas seperti itu dapat

berarti bahwa dua sampel yang diambil terpisah beberapa meter mungkin memiliki karakteristik fisik,
kimia, dan mikrobiologis yang sangat berbeda. Akhirnya, untuk analisis mikroba tidak cukup hanya

dengan mengambil sampel; logistik penyimpanan sampel dan analisis harus dipertimbangkan juga.

8.1.3 Pengolahan dan Penyimpanan Sampel

Analisis mikroba harus dilakukan sesegera mungkin setelah pengumpulan tanah untuk meminimalkan

efek penyimpanan pada komunitas mikroba. Setelah dipindahkan dari lapangan, komunitas mikroba

dalam sampel dapat dan akan berubah terlepas dari metode penyimpanannya. Penurunan jumlah

mikroba dan aktivitas mikroba telah dilaporkan bahkan ketika sampel tanah disimpan dalam kondisi

lembab lapangan pada suhu 4 C hanya selama 3 bulan (Stotzky et al., 1962). Menariknya dalam

penelitian ini, meskipun komunitas bakteri berubah, komunitas actinomycete tetap tidak berubah.

Langkah pertama dalam analisis mikroba sampel tanah permukaan biasanya melibatkan pengayakan

melalui mesh 2 mm untuk menghilangkan batu besar dan puing-puing. Namun, untuk melakukan ini,

sampel harus sering dikeringkan dengan udara untuk memudahkan pengayakan. Ini dapat diterima

selama kadar air tanah tidak menjadi terlalu rendah, karena ini juga dapat mengubah komunitas

mikroba (Sparkling dan Cheshire, 1979). Setelah pengayakan, penyimpanan jangka pendek harus

pada suhu 4 C sebelum analisis. Jika sampel disimpan, perawatan harus diambil untuk memastikan

bahwa sampel tidak mengering dan bahwa kondisi anaerob tidak berkembang, karena ini juga dapat

mengubah komunitas mikroba. Penyimpanan hingga 21 hari tampaknya membuat sebagian besar sifat

mikroba tanah tidak berubah (Wollum, 1994), tetapi sekali lagi waktu merupakan hal yang paling

penting sehubungan dengan analisis mikroba. Perhatikan bahwa pengambilan sampel tanah

permukaan secara rutin tidak memerlukan prosedur steril. Tanah-tanah ini terus-menerus terpapar ke

atmosfer, sehingga diasumsikan bahwa paparan seperti itu selama pengambilan sampel dan

pemrosesan tidak akan mempengaruhi hasil secara signifikan. Perawatan yang lebih harus diambil

dengan memproses sampel bawah permukaan karena tiga alasan. Pertama, mereka memiliki budaya

yang lebih rendah

menghitung, yang berarti bahwa kontaminan mikroba luar dapat secara signifikan mempengaruhi

jumlah yang dihitung. Kedua, sedimen bawah permukaan tidak secara rutin terpapar ke atmosfer, dan

kontaminan mikroba di atmosfer secara substansial berkontribusi pada jenis mikroba yang ditemukan.

Ketiga, lebih mahal untuk mendapatkan sampel di bawah permukaan, dan seringkali tidak ada

kesempatan kedua dalam pengumpulan. Sampel bawah permukaan yang diperoleh dengan coring

segera dibekukan dan dikirim kembali ke laboratorium sebagai inti utuh atau diproses di lokasi coring.

Dalam kedua kasus, bagian luar inti biasanya dikikis menggunakan spatula steril atau subcore diambil

menggunakan jarum suntik plastik berdiameter lebih kecil. Sampel kemudian ditempatkan dalam

kantong plastik steril dan dianalisis segera atau dibekukan untuk analisis di masa depan.

8.1.3.1 Mengolah Sampel Tanah dan Sedimen untuk Bakteri

Analisis Berbasis Budaya Metode analisis tradisional untuk komunitas mikroba biasanya melibatkan

pengujian budaya menggunakan metodologi pelarutan dan pelapisan pada media selektif dan

diferensial atau pengujian jumlah langsung (lihat Bab 10). Penghitungan langsung menawarkan

informasi tentang jumlah total bakteri yang ada, tetapi tidak memberikan informasi tentang jumlah

atau keragaman populasi yang ada dalam komunitas. Hitungan lempeng memungkinkan penghitungan

total populasi budaya atau populasi budaya terpilih, dan karenanya memberikan informasi tentang

populasi yang berbeda yang ada. Namun, karena kurang dari 1% dari bakteri tanah mudah dibiakkan

(Amann et al., 1995), informasi budaya hanya menawarkan sebagian dari gambar. Fraksi sebenarnya

dari komunitas yang dapat dibudidayakan tergantung pada media yang dipilih untuk jumlah budaya.

Setiap media tunggal akan dipilih untuk populasi yang paling cocok untuk media tertentu itu. Dengan

demikian, pilihan media sangat penting dalam menentukan hasil yang diperoleh. Ini diilustrasikan

oleh data pada Tabel 8.1, yang menunjukkan bahwa sementara penghitungan langsung dari

serangkaian sampel sedimen yang mencakup kedalaman 5 m adalah serupa, jumlah yang dapat

dibiakkan bervariasi tergantung pada jenis media yang digunakan. Media kaya nutrisi, PTYG, terbuat
dari pepton, trypticase, ekstrak ragi dan glukosa, secara konsisten memberikan jumlah yang satu

sampai tiga kali lipat lebih rendah daripada jumlah dari dua media bergizi rendah yang diuji. Ini

adalah pengenceran PTYG 1:20 dan agar-agar ekstrak tanah yang dibuat dari suspensi 1: 2 permukaan

tanah. Data-data ini mencerminkan fakta bahwa sebagian besar mikroba tanah ada dalam kondisi

terbatas nutrisi atau oligotrofik.

Analisis DNA Komunitas Dalam beberapa tahun terakhir, keuntungan mempelajari DNA komunitas

yang diekstraksi dari sampel tanah menjadi jelas

(lihat Bab 13). Pendekatan berbasis nonkultur ini dianggap lebih mewakili kehadiran masyarakat

aktual daripada pendekatan berbasis budaya. Selain memberikan informasi tentang jenis populasi

yang ada, pendekatan ini juga dapat memberikan informasi tentang potensi genetik mereka. Seperti

halnya teknik apa pun, ada batasan pada data yang dapat diperoleh dengan ekstraksi DNA. Oleh

karena itu, banyak peneliti sekarang menggunakan ekstraksi DNA dalam hubungannya dengan jumlah

langsung dan budaya untuk memaksimalkan data yang diperoleh dari sampel lingkungan. Awalnya,

dua pendekatan dikembangkan untuk isolasi DNA bakteri dari sampel tanah. Yang pertama

didasarkan pada fraksinasi bakteri dari tanah diikuti oleh lisis sel dan ekstraksi DNA (Holben, 1994).

Metode kedua melibatkan lisis situ bakteri di dalam matriks tanah dengan ekstraksi DNA selanjutnya

yang dilepaskan dari sel (Kotak Informasi 8.2). Setelah pengembangan kedua pendekatan ini, in situ

lisis telah menjadi prosedur ekstraksi yang umum digunakan terutama karena lebih mudah dan lebih

cepat, karena menghasilkan DNA yang lebih representatif, dan karena kit komersial membuatnya

lebih mudah untuk memurnikan DNA. Metode lisis in situ melibatkan pelisisan sel-sel bakteri di

dalam tanah dan melepaskan DNA mereka sebelum ekstraksi DNA dari sampel. Metodologi Lisis

biasanya melibatkan kombinasi perawatan fisik dan kimia. Untuk bakteri, perawatan fisik telah

melibatkan siklus pencairan beku dan / atau sonikasi atau pemukulan manik-manik, dan perawatan

kimia sering menggunakan deterjen seperti natrium dodecyl sulfate (SDS) dan / atau enzim seperti
lisozim atau proteinase (Selengkapnya ´ et al ., 1994). Setelah lisis, puing-puing sel dan partikel tanah

dihilangkan dengan presipitasi dan sentrifugasi, dan DNA dalam supernatan diendapkan dengan

etanol. DNA dapat dimurnikan lebih lanjut dengan penyerapan ke kolom buatan sendiri atau

komersial yang dikemas dengan resin penukar ion atau gel yang selanjutnya dapat dibilas untuk

menghilangkan bahan humat yang dapat menghambat analisis DNA. Pemurnian lebih lanjut dapat

dicapai dengan ekstraksi fenol kloroform / isoamil alkohol, diikuti sekali lagi oleh endapan etanol

(Xia et al., 1995). Sampel murni DNA diperlukan untuk memungkinkan analisis molekuler berikutnya

seperti dengan reaksi berantai polimerase (PCR) (lihat Bab 13). Namun, terlepas dari metodologi

pemurnian apa yang digunakan, setiap langkah dalam proses pemurnian menyebabkan hilangnya

DNA. Dengan demikian, DNA murni diperoleh hanya dengan mengorbankan hasil DNA. Kit

komersial, yang telah mengoptimalkan prosedur yang dijelaskan di atas, sekarang tersedia untuk

diproses

tanah untuk DNA komunitas. Contoh dari kit tersebut adalah Ultracleant Soil DNA Isolation Kit

(MoBio) dan Fast DNA Spin for Soil (MP Biomedis) (Gambar 8.5). Biasanya, kit ini menggunakan

teknologi pemukulan manik fisik yang diikuti oleh lisis kimia mikroba dan selanjutnya ekstraksi dan

pemurnian DNA. Kit ini bahkan dapat digunakan untuk mengekstraksi DNA dari sampel lingkungan

bahan organik tinggi termasuk kompos, sedimen, pupuk kandang dan biosolid. Tetapi dalam kasus ini,

pemurnian tambahan dari DNA yang diekstraksi mungkin diperlukan sehubungan dengan kit. Salah

satu pendekatan yang umum adalah berulang kali membilas DNA dengan guanidine tiosianat saat

diserap ke kolom ekstraksi yang disediakan oleh kit. Secara keseluruhan, kit komersial ini secara

dramatis meningkatkan kemudahan dan kecepatan ekstraksi DNA komunitas dari tanah. Perhatikan

bahwa ada juga kit yang tersedia untuk mengekstraksi DNA komunitas dari sampel air, mis., Kit

DNA Air UltraCleant. Meskipun lisis langsung menggunakan kit komersial memiliki banyak

keuntungan, ia juga memiliki beberapa masalah. Penyerapan DNA dari sel yang dilisiskan oleh tanah

liat atau koloid humik dapat mengurangi hasil DNA yang diekstraksi (Ogram et al., 1987). Masalah
lain yang terkait dengan lisis langsung adalah membedakan bebas dari DNA seluler. DNA bebas

dilepaskan dari mikroba yang melisis secara alami beberapa saat sebelum ekstraksi DNA kadang-

kadang dapat dilindungi dari degradasi oleh penyerapan ke partikel tanah (Lorentz dan Wackernagel,

1987). DNA ini dapat diekstraksi bersama dengan DNA dari sel-sel yang layak. Selain itu, DNA yang

diisolasi dengan lisis langsung cenderung dicukur secara acak karena prosedur pemukulan manik

yang terkait dengan sebagian besar kit ekstraksi. Akhirnya, sebagian besar kit akan melisiskan semua

mikroorganisme tanah termasuk jamur dan protozoa. Dengan demikian, DNA yang diekstraksi tidak

terbatas pada DNA bakteri. Untungnya, jamur (105 per gram) dan protozoa (104 per gram) ada pada

jumlah yang jauh lebih rendah di sebagian besar tanah,

dan dengan demikian tidak akan berkontribusi secara signifikan pada DNA yang diperoleh dari

108.10 bakteri per gram, bahkan memungkinkan untuk ukuran genom yang lebih besar dari protozoa.

Setelah sampel DNA yang dimurnikan diperoleh dari sampel tanah, dapat diukur dengan spektroskopi

ultraviolet (UV) atau fluorometry. Biasanya, pembacaan UV dibuat pada panjang gelombang 260 dan

280 nm, dari mana kemurnian dan kuantitas DNA dapat diperkirakan (Informasi Kotak 8.3). Salah

satu batasan kuantifikasi oleh spektroskopi UV adalah pembacaan akan dipengaruhi oleh senyawa apa

pun yang menyerap pada 260 nm. Kuantifikasi oleh fluorometry lebih sensitif dan lebih spesifik,

tetapi tidak memungkinkan evaluasi kemurnian ekstrak diperoleh dengan membandingkan bacaan

pada 260 dan 280 nm. Konsentrasi DNA serendah 1 picogram per μl dapat diukur dengan fluorometer

menggunakan pewarna picogreen. Setelah jumlah DNA per massa tanah diketahui, perkiraan dapat

dibuat dari komunitas mikroba. Untuk bakteri seperti Escherichia coli, kromosom khas mengandung 4

5 juta pasangan basa, setara dengan sekitar 9 fg (9310215 g) DNA. Namun, jumlah DNA per sel

bervariasi dan perkiraan lainnya lebih rendah, sekitar 4 fg per sel. Jumlah DNA per sel juga dapat

bervariasi karena replikasi kromosom terjadi lebih cepat daripada pembelahan sel, menghasilkan dua

atau tiga kromosom per sel (Krawiec dan Riley, 1990). Estimasi DNA teoretis ini dapat digunakan

untuk menghubungkan total DNA yang diekstraksi dengan jumlah mikroba dalam sampel. Tabel 8.2
menunjukkan total DNA yang diekstraksi dari empat tanah yang diamandemen dengan glukosa.

Jumlah DNA yang diperoleh meningkat dengan jumlah bahan organik tanah (lempung lanau dan

lempung), mungkin karena komunitas bakteri berkelanjutan yang lebih besar. DNA yang diekstraksi

juga menurun di tanah yang mengandung banyak tanah (lempung liat), kemungkinan besar karena

penyerapan DNA oleh koloid tanah (Ogram et al., 1987). Secara keseluruhan, pengaruh amandemen

dapat dilihat dari waktu ke waktu ketika komunitas mikroba semakin besar melalui pertumbuhan,

menghasilkan DNA yang lebih dapat diekstraksi. Jumlah teoritis sel bakteri yang diwakili oleh DNA

yang diekstraksi dapat dihitung seperti diilustrasikan di bawah ini. Misalnya, pada saat nol untuk

tanah lempung lempung:

DNA50 yang diekstraksi: 12 μg = g tanah

Extracted DNA50:12 µg=g soil

Karena itu, jika setiap sel memiliki 4 fg DNA:

Jumlah sel5

0: 12310 g21 DNA = g tanah 4310 g215 DNA = sel 53: 03107 sel = g tanah

Nilai yang sama pada waktu nol untuk tanah lainnya adalah 1,63108 sel / g tanah (tanah berpasir),

3,33108 sel / g tanah (tanah lempung), dan 4,53109 sel / g tanah (tanah lempung).

8.1.3.2 Mengolah Sampel Tanah untuk Hifa dan Spora Jamur

Seperti halnya bakteri, juga tidak mungkin untuk membudidayakan semua spesies jamur yang hidup

dari sampel tanah atau sedimen. Metode budaya untuk jamur dijelaskan dalam Bagian 10.5. Namun,

beberapa pendekatan telah dikembangkan untuk isolasi langsung hifa jamur atau spora dari tanah.

Yang pertama adalah metodologi pencucian tanah. Ini melibatkan volume tanah kecil yang jenuh

dengan air steril. Agregat tanah digerakkan dengan lembut terbuka dengan semburan air yang halus,

yang memungkinkan partikel tanah yang lebih berat untuk mengendap dan partikel yang lebih halus

akan tertuang. Prosedur ini diulang beberapa kali sampai hanya partikel yang lebih berat yang tersisa.
Ini kemudian disebarkan dalam film air steril dan diperiksa di bawah mikroskop bedah. Jarum steril

atau forsep yang sangat halus kemudian dapat digunakan untuk mendapatkan hifa jamur yang diamati.

Untuk spora, pendekatan yang berbeda dapat digunakan. Sampel tanah ditempatkan dalam kotak steril

terpisah yang masing-masing berisi sejumlah saringan ukuran bertingkat. Sampel tanah dicuci dengan

kuat di setiap kotak, dan tanah dengan ukuran yang ditentukan dipertahankan pada setiap ayakan.

Spora ditentukan secara empiris dengan pelapisan cucian berturut-turut (dua menit per cucian) dari

masing-masing saringan. Karena hifa dipertahankan oleh saringan, setiap koloni jamur yang muncul

harus karena adanya spora. Informasi tentang jamur hadir sebagai hifa dapat diperoleh dengan

melapisi dicuci

partikel ditahan oleh saringan. Namun, metode pencucian ini bersifat padat karya, dan mengandalkan

trial and error dalam hal fraksi ukuran mana yang paling relevan sehubungan dengan ukuran spora

individu.

8.1.3.3 Pemrosesan Lumpur, Tanah dan Sedimen untuk Virus

Untuk menilai sepenuhnya dan memahami risiko dari patogen di lingkungan, perlu untuk menentukan

keberadaannya dalam lumpur limbah (biosolids), tanah yang menerapkan air limbah atau lumpur, atau

sedimen laut yang mungkin dipengaruhi oleh pembuangan air limbah atau pembuangan lumpur.

Faktanya, Badan Perlindungan Lingkungan A.S. saat ini membutuhkan pemantauan lumpur untuk

enterovirus untuk jenis aplikasi tanah tertentu. Untuk mendeteksi virus pada padatan, pertama-tama

perlu untuk mengekstraknya dengan proses yang akan menyebabkan desorpsi dari padatan. Seperti

halnya filter mikropori (lihat Bagian 8.2.2.1), virus diyakini terikat pada padatan ini dengan

kombinasi gaya elektrostatik dan hidrofobik (lihat Bab 15). Untuk memulihkan virus dari padatan,

ditambahkan zat-zat yang akan memecah kekuatan-kekuatan atraktif ini, yang memungkinkan virus

untuk dipulihkan dalam cairan elusi (Gerba dan Goyal, 1982; Berg, 1987). Prosedur yang paling

umum untuk lumpur melibatkan pengumpulan 500 1000 ml lumpur dan menambahkan AlCl3 dan
HCl untuk menyesuaikan pH ke 3,5. Dalam kondisi ini, virus mengikat padatan lumpur, yang

dihilangkan dengan sentrifugasi, dan kemudian disuspensikan kembali dalam larutan ekstrak daging

sapi pada pH netral untuk mengelusi virus. Eluat kemudian dikonsentrasikan kembali dengan

flokulasi protein dalam ekstrak daging sapi pada pH 3,5, diresuspensi dalam 20 50 ml, dan

dinetralkan. Masalah utama dengan konsentrat lumpur limbah disiapkan dengan cara ini adalah bahwa

mereka sering mengandung zat beracun untuk kultur sel. Diagram rincian prosedur ini ditunjukkan

pada Gambar 8.6. Teknik ekstraksi serupa digunakan untuk pemulihan virus dari tanah dan sedimen

air (Hurst et al., 2007).

8.2 AIR

8.2.1 Strategi dan Metode Pengambilan Sampel untuk Air

Pengambilan sampel air lingkungan untuk analisis mikroba selanjutnya agak lebih mudah daripada

pengambilan sampel tanah, karena berbagai alasan. Pertama, karena air cenderung lebih homogen

daripada tanah, ada sedikit variabilitas situs-ke-situs antara dua sampel yang dikumpulkan dalam

lingkungan yang sama. Kedua, seringkali secara fisik lebih mudah untuk mengumpulkan sampel air

karena dapat dilakukan dengan pompa dan saluran selang. Dengan demikian, volume air yang

diketahui dapat dikumpulkan dari kedalaman yang diketahui dengan relatif mudah. Jumlah air

dikumpulkan tergantung pada sampel lingkungan yang dievaluasi, tetapi dapat bervariasi dari 1 ml

hingga 1000 liter. Strategi pengambilan sampel juga tidak terlalu rumit untuk sampel air. Dalam

banyak kasus, karena air bersifat mobile, sejumlah sampel massal dikumpulkan dari titik yang sama

dalam berbagai interval waktu. Strategi seperti itu akan berguna, misalnya, dalam pengambilan

sampel sungai atau instalasi pengolahan air minum. Untuk perairan laut, sampel sering dikumpulkan

secara berurutan dalam waktu, dalam bidang minat yang ditentukan. Meskipun pengumpulan sampel
air relatif mudah, pemrosesan sampel sebelum analisis mikroba bisa lebih sulit. Volume sampel air

yang diperlukan untuk deteksi mikroba kadang-kadang bisa menjadi sulit karena jumlah mikroba

cenderung lebih rendah dalam sampel air daripada dalam sampel tanah (lihat Bab 6). Oleh karena itu,

strategi telah dikembangkan untuk memungkinkan konsentrasi mikroba dalam sampel air. Untuk

mikroba yang lebih besar termasuk bakteri dan parasit protozoa, sampel sering disaring untuk

menjebak dan memusatkan organisme. Untuk bakteri ini sering melibatkan filtrasi menggunakan filter

membran 0,45-µm (lihat Bab 10). Untuk parasit protozoa, filter serat berserat kasar digunakan. Untuk

virus, sampel air juga disaring, tetapi karena partikel virus sering kali terlalu kecil untuk terperangkap

secara fisik, pengumpulan partikel virus tergantung pada kombinasi interaksi elektrostatik dan

hidrofobik dari virus dengan filter. Persyaratan berbeda untuk pemrosesan sampel air untuk analisis

virus, bakteri dan protozoa diuraikan dalam dua bagian berikutnya.

8.2.2 Mengolah Sampel Air untuk Analisis Virus

Deteksi dan analisis virus dalam sampel air seringkali sulit karena jumlah rendah yang ditemui dan

berbagai jenis yang mungkin ada. Ada empat langkah dasar dalam analisis virus: pengumpulan

sampel, elusi, rekonsentrasi, dan deteksi virus. Untuk pengumpulan sampel, seringkali diperlukan

untuk mengalirkan air dalam volume besar (100 hingga 1000 liter) melalui filter karena jumlah virus

yang rendah. Virus terkonsentrasi dari air dengan adsorpsi ke filter. Pemulihan virus dari filter

melibatkan elusi virus dari filter pengumpulan, serta langkah rekonsentrasi untuk mengurangi volume

sampel sebelum pengujian. Deteksi virus dapat dilakukan melalui kultur sel atau metode molekuler

seperti PCR. Namun, kedua metode ini dapat dihambat dengan adanya zat beracun di dalam air yang

terkonsentrasi bersama dengan partikel virus. Banyak strategi telah dikembangkan untuk mengatasi

kesulitan yang terkait dengan analisis virus, tetapi mereka sering memakan waktu, tenaga yang

intensif dan mahal. Misalnya, biaya deteksi enterovirus berkisar dari $ 600 hingga $ 1000 per sampel
untuk air minum. Masalah lain dengan analisis virus adalah bahwa ketepatan dan keakuratan metode

yang digunakan menderita dari sejumlah besar langkah yang terlibat. Secara khusus, efisiensi

pemulihan virus yang terkait dengan setiap langkah tergantung pada jenis virus yang sedang

dianalisis. Sebagai contoh, virus hepatitis A mungkin tidak terkonsentrasi seefisien rotavirus dengan

proses yang sama. Variabilitas juga dihasilkan dari sensitivitas ekstrim dari tes ini. Metode untuk

mendeteksi virus dalam air telah dikembangkan yang dapat mendeteksi sedikitnya satu unit

pembentuk plak dalam 1000 liter air. Berdasarkan berat-ke-berat dengan air, ini adalah sensitivitas

deteksi satu bagian pada 1018. Sebagai perbandingan, batas sensitivitas metode paling analitik yang

tersedia untuk senyawa organik adalah sekitar 1 μg / liter. Ini sesuai dengan satu bagian dalam 109.

8.2.2.1 Pengumpulan Sampel

Analisis virus dilakukan pada berbagai jenis air. Jenis-jenis air yang diuji meliputi air minum, air

permukaan dan air tawar, air laut dan air limbah. Perairan ini sangat bervariasi dalam komposisi kimia

fisiknya, dan mengandung zat yang larut atau tersuspensi dalam larutan, yang dapat mengganggu

kemampuan kita untuk menggunakan berbagai metode konsentrasi. Kesesuaian metode konsentrasi

virus tergantung pada kemungkinan kepadatan virus, batasan volume metode konsentrasi untuk jenis

air dan adanya zat yang mengganggu. Volume sampel kurang dari 1 liter mungkin cukup untuk

pemulihan virus dari limbah mentah dan primer. Untuk air minum dan relatif

di perairan yang tidak tercemar, tingkat virus kemungkinan sangat rendah sehingga ratusan atau

mungkin ribuan liter harus diambil sampelnya untuk meningkatkan kemungkinan deteksi virus.

Berbagai metode yang digunakan untuk konsentrasi virus dari air ditunjukkan pada Tabel 8.3.

Sebagian besar metode yang digunakan untuk konsentrasi virus tergantung pada adsorpsi virus ke

permukaan, seperti filter atau endapan mineral, meskipun hydroextraction dan ultrafiltration telah

digunakan (Gerba, 1987). Sistem lapangan

untuk konsentrasi virus biasanya terdiri dari penggunaan pompa untuk mengalirkan air melalui filter

(dengan laju 20 hingga 40 liter per menit), rumah filter dan flowmeter (Gambar 8.7A). Seluruh sistem

biasanya dapat terkandung dalam peti es berkapasitas 20 liter. Filter yang paling umum digunakan

untuk pengumpulan virus dari air dalam volume besar adalah filter mikro adsorpsi elusi, lebih dikenal

sebagai VIRADEL (untuk virus adsorpsi-elusi). VIRADEL

melibatkan melewati air melalui filter yang diserap oleh virus. Ukuran pori dari filter jauh lebih besar

dari virus, dan adsorpsi terjadi oleh kombinasi interaksi elektrostatik dan hidrofobik (Iker et al.,

2012). Tersedia dua jenis filter umum: elektronegatif (muatan permukaan negatif) dan elektropositif

(muatan permukaan positif). Filter elektronegatif terdiri dari ester selulosa atau fiberglass dengan

pengikat resin organik. Karena filter bermuatan negatif, garam kationik (MgCl2 atau AlCl3) harus

ditambahkan sebagai tambahan untuk menurunkan pH menjadi 3,5. Ini mengurangi muatan negatif

bersih yang biasanya terkait dengan virus yang memungkinkan adsorpsi dimaksimalkan (lihat Bab 2).

Penyesuaian pH seperti itu bisa rumit, karena membutuhkan modifikasi air sebelum penyaringan dan

penggunaan bahan dan peralatan tambahan seperti pH meter. Filter electronegative yang paling umum

digunakan adalah Filterite. Secara umum, ini digunakan sebagai cartridge lipit 10-inci (25,4 cm)

dengan nilai ukuran pori nominal 0,22 - atau 0,45-μm. Filter elektronegatif ideal ketika memusatkan

virus dari air laut dan air dengan jumlah bahan organik dan kekeruhan yang tinggi (Gerba et al.,

1978). Filter elektropositif dapat terdiri dari fiberglass atau selulosa yang mengandung resin polimer

organik bermuatan positif (1MDS), atau serat nano alumina (NanoCeram), yang menciptakan muatan

permukaan positif bersih untuk meningkatkan adsorpsi virus yang bermuatan negatif. Filter ini

menyerap virus secara efisien pada rentang pH yang luas tanpa memerlukan garam polivalen. The

1MDS kurang efisien dengan air laut atau air dengan pH melebihi 8,0 8.5 (Sobsey dan Glass, 1980).

1MDS Virozorb elektropositif secara khusus diproduksi untuk konsentrasi virus dari air. Metode filter

VIRADEL mengalami sejumlah keterbatasan. Materi tersuspensi dalam air cenderung menyumbat
filter, dengan demikian membatasi volume yang dapat diproses dan mengganggu proses elusi. Bahan

organik terlarut dan koloid di beberapa perairan dapat mengganggu adsorpsi virus ke filter, mungkin

dengan bersaing dengan virus untuk situs adsorpsi. Akhirnya, efisiensi konsentrasi bervariasi

tergantung pada jenis virus, mungkin karena perbedaan titik isoelektrik virus, yang mempengaruhi

muatan bersih virus pada pH apa pun.

8.2.2.2 Contoh Pemilihan dan Rekonsiliasi Virus yang teradsorpsi biasanya dielusi dari permukaan
filter dengan menyaring tekanan sejumlah kecil (1 2 liter) larutan elusi melalui filter. Eluen biasanya
berupa cairan proteinase yang sedikit basa seperti ekstrak daging sapi 1,5% yang disesuaikan dengan
pH 9,5 (Gambar 8.7B). Peningkatan pH meningkatkan muatan negatif pada permukaan virus dan
filter, yang menghasilkan desorpsi virus dari filter. Bahan organik dalam ekstrak daging sapi juga
bersaing dengan virus untuk adsorpsi pada filter, selanjutnya membantu desorpsi. Volume 1 hingga 2
liter elutant masih terlalu besar untuk memungkinkan analisis virus sensitif, dan oleh karena itu
langkah konsentrasi kedua (rekonsentrasi) digunakan untuk mengurangi volume hingga 20 30 ml
sebelum pengujian. Proses rekonsentrasi elusi ditunjukkan secara rinci dalam Gambar 8.8. Secara
keseluruhan, metode ini dapat memulihkan enterovirus dengan efisiensi 30 50% dari 400 hingga 1000
liter volume air (Gerba et al., 1978; Sobsey dan Glass, 1980).

8.2.2.3 Deteksi Virus Beberapa opsi tersedia untuk deteksi virus dan dijelaskan secara rinci di Bagian
10.7. Secara singkat, virus dapat dideteksi dengan inokulasi sampel ke dalam sel hewan

kultur diikuti dengan pengamatan sel untuk efek sitopatogenik (CPE) atau dengan penghitungan zona
bening atau unit pembentuk plak (PFU) dalam monolayer sel yang diwarnai dengan pewarna vital
(mis., pewarna yang hanya menodai sel hidup yang tidak terinfeksi virus). Metode PFU
memungkinkan lebih memadai jumlah virus karena mereka dapat dengan mudah disebutkan. PCR
juga dapat digunakan untuk mendeteksi virus secara langsung baik dalam konsentrat sampel atau
kultur sel hewan. Prosedur keseluruhan untuk pengambilan sampel dan deteksi virus dalam air
ditunjukkan pada Gambar 8.8.

8.2.3 Mengolah Sampel Air untuk Deteksi Bakteri

Mengolah sampel air untuk bakteri jauh lebih sederhana daripada pemrosesan yang diperlukan untuk

virus. Biasanya, bakteri dikumpulkan dan dicacah dengan salah satu dari dua prosedur berbeda:

filtrasi membran dan metodologi nomor yang paling memungkinkan (MPN). Filtrasi membran, sesuai

namanya, bergantung pada pengumpulan dan konsentrasi bakteri melalui filtrasi. Dalam metode

MPN, sampel umumnya tidak diproses sebelum analisis. Dalam kedua prosedur, bakteri dideteksi
melalui metode kultur menggunakan teknik penyaringan MPN atau membran, yang dijelaskan dalam

Bab 10.

8.2.4 Mengolah Sampel Air untuk Deteksi Parasit Protozoa

Seperti halnya virus enterik, virus ini hanya membutuhkan sedikit parasit protozoa untuk

menyebabkan infeksi pada manusia. Akibatnya, volume besar air ledeng (10 liter atau lebih) atau air

permukaan (10 hingga 100 liter) perlu disampel untuk mendeteksi jumlah yang rendah. Langkah

pertama biasanya melibatkan pengumpulan kista atau ookista dengan penyaringan pada cartridge

berlipat atau filter busa (Schaefer, 2007). Selama filtrasi, kista atau ookista terperangkap pada filter

dengan pengecualian ukuran (Gambar 8.9). Biasanya, pompa berjalan pada laju aliran 2 liter per menit

digunakan untuk mengumpulkan sampel. Filter ditempatkan dalam kantong plastik, disegel, disimpan

di es dan dikirim ke laboratorium untuk diproses dalam 72 jam. Di laboratorium, kista dan ookista

diekstraksi. Dalam kasus filter cartridge (Envirocheck, Pall Filter, Ann Arbor), buffer elusi (solusi

laureth-12, buffer Tris, EDTA dan antifoam) ditambahkan ke kartrid filter, dan ditempatkan pada

shaker dan gelisah selama lima menit untuk melepaskan kista atau ookista. Ini diikuti oleh pelet

protozoa dengan sentrifugasi dan resuspensi dalam buffer. Dalam kasus filter busa (Filta-Max,

IDEXX, Westbrook, ME), larutan elusi buffer fosfat dan 0,01% Tween 20 ditambahkan, dan protozoa

diperas dari filter fleksibel dengan plunger. Sebagian besar materi partikulat sering terkonsentrasi

bersama dengan kista dan ookista, dan membutuhkan pemurnian lebih lanjut dengan pemisahan

imunomagnetik (IMS). Dalam proses ini, kista dan ookista menempel pada antibodi spesifik yang

terkait dengan manik-manik magnetik (Dynal, Inc., Lake Success, NY), dan manik-manik (dengan

organisme yang menempel) dikeluarkan dari larutan. Setelah pemisahan kista dan ookista dari manik-

manik, mereka ditangguhkan dalam volume kecil buffer, ditempatkan ke dalam sumur, diwarnai

dengan antibodi monoklonal fluoresen dan dilihat dengan mikroskop epifluoresensi (Gambar 8.10).
Badan fluoresen dengan ukuran dan bentuk yang benar diidentifikasi dan diperiksa dengan mikroskop

perbedaan kontras untuk

8.3 UDARA

8.3.1 Perangkat Pengambilan Sampel untuk Pengumpulan Sampel Udara

Banyak perangkat telah dirancang untuk pengumpulan bioaerosol (lihat Bab 5). Memilih perangkat

pengambilan sampel yang tepat didasarkan pada banyak faktor, seperti ketersediaan, biaya, volume

udara yang akan disampel, mobilitas, efisiensi pengambilan sampel (untuk jenis bioaerosol tertentu)

dan kondisi lingkungan tempat pengambilan sampel akan dilakukan. Faktor lain yang harus

diperhitungkan, terutama ketika pengambilan sampel untuk mikroorganisme, adalah keseluruhan

efisiensi pengambilan sampel biologis perangkat. Faktor ini terkait dengan pemeliharaan viabilitas

mikroba selama dan setelah pengambilan sampel. Pada bagian ini, beberapa jenis sampler yang umum

digunakan dijelaskan berdasarkan metode pengambilan sampel mereka: pelampiasan, impaksi,

sentrifugasi, filtrasi dan deposisi. Pelampiasan adalah penjebakan partikel-partikel udara dalam

matriks cair; impaksi adalah pengendapan paksa partikel udara pada permukaan padat; sentrifugasi

adalah pengendapan paksa partikel-partikel di udara menggunakan gaya gravitasi inersia; filtrasi

adalah penjebakan partikel-partikel yang terbawa melalui udara dengan pengecualian ukuran; dan

pengendapan adalah kumpulan partikel-partikel udara yang hanya menggunakan gaya pengendapan

yang terjadi secara alami. Perangkat yang paling umum digunakan untuk pengambilan sampel udara

mikroba adalah: semua kaca impeller AGI-30 (Ace Glass, Vineland, NJ); impinger SKC (SKC-West

Inc., Fullerton, CA, A.S.); dan Anderson enam tahap

sampler impaksi (6-STG, Andersen Instruments Incorporated, Atlanta, GA).

8.3.1.1 Pelampiasan
AGI-30 (Gambar 8.12) dan impingers kaca SKC (Gambar 8.13) beroperasi dengan menarik udara

melalui saluran masuk yang serupa bentuknya dengan saluran hidung manusia. Udara ditransmisikan

melalui media cair di mana partikel-partikel udara menjadi terkait dengan fluida dan kemudian

terperangkap. Impingers biasanya terpisah pada laju aliran 12,5 L / mnt pada ketinggian 1,5 m, yang

merupakan tinggi rata-rata pernapasan untuk manusia. Mereka mudah digunakan, murah, portabel,

dapat diandalkan, mudah disterilkan dan memiliki efisiensi pengambilan sampel biologis yang tinggi

dibandingkan dengan banyak perangkat pengambilan sampel lainnya. Penumbuk cenderung sangat

efisien untuk partikel dalam kisaran 0,8 hingga 15 μm. Volume media pengumpulan yang biasa

adalah 20 ml, dan durasi pengambilan sampel yang khas adalah sekitar 20 menit, yang mencegah

penguapan selama pengambilan sampel dalam iklim hangat, atau pembekuan media cair saat

pengambilan sampel pada suhu yang lebih rendah. Biosampler SKC lebih mahal karena sifat halus

kaca yang ditiup yang mengurangi kerusakan mikroba selama pelampiasan (Brooks et al., 2005). Fitur

lain dari proses pelampiasan adalah bahwa mikroorganisme cair dan tersuspensi dapat terkonsentrasi

atau diencerkan, tergantung pada persyaratan untuk analisis. Media pelampiasan cairan juga dapat

dibagi menjadi beberapa subsampel untuk menguji berbagai mikroorganisme dengan metode kultur

dan molekuler standar seperti yang dijelaskan dalam Bab 10 dan 13. Media pelampiasan juga dapat

dioptimalkan untuk meningkatkan efisiensi pemulihan biologis relatif. Ini penting, karena selama

pengambilan sampel mikroorganisme yang ada di udara, yang sudah dalam keadaan tertekan karena

berbagai tekanan lingkungan seperti radiasi ultraviolet (UV) dan pengeringan, dapat ditekan lebih

lanjut jika media yang sesuai tidak digunakan untuk pemulihan. Sampling media berkisar dari yang

sederhana sampai yang kompleks. Media sederhana adalah 0,85% NaCl, yang merupakan media

pengambilan sampel yang seimbang secara osmotik yang digunakan untuk mencegah syok osmotik

dari organisme yang ditemukan. Media yang lebih kompleks adalah pepton (1%), yang digunakan

sebagai media resusitasi untuk organisme yang mengalami stres. Akhirnya, pengayaan atau media

pertumbuhan yang didefinisikan dapat digunakan untuk sampel secara selektif untuk jenis organisme
tertentu. Kelemahan utama ketika menggunakan impingers ini adalah bahwa tidak ada diskriminasi

ukuran partikel, yang mencegah karakterisasi akurat dari ukuran partikel udara yang dikumpulkan.

8.3.1.2 Impaksi

Tidak seperti impingers, Andersen enam-tahap impler sampler (Andersen 6-STG) menyediakan

ukuran partikel yang akurat

PELAJARI GAMBARNYA
FIG 8.12 8.14

diskriminasi (Gambar 8.14). Ini digambarkan sebagai multilevel, multiorifice, penentu kaskade.

Andersen 6STG dikembangkan oleh Ariel A. Andersen pada tahun 1958 dan beroperasi pada laju

aliran input 28,3 L / mnt. Prinsip operasi umum adalah bahwa udara dihisap melalui port pengambilan

sampel dan menyerang pelat agar. Partikel yang lebih besar dikumpulkan pada lapisan pertama, dan

setiap tahap berturut-turut mengumpulkan partikel yang lebih kecil dan lebih kecil dengan

meningkatkan kecepatan aliran dan akibatnya potensi impaksi. Bentuk sampler Andersen tidak sesuai

dengan bentuk saluran pernapasan manusia, tetapi distribusi ukuran partikel dapat langsung

berhubungan dengan distribusi ukuran partikel yang terjadi secara alami di paru-paru hewan. Stadium

bawah sesuai dengan alveoli dan stadium atas ke saluran pernapasan atas. Sampler Andersen terbuat

dari stainless steel dengan cawan Petri kaca, memungkinkan sterilisasi, kemudahan transportasi, dan

keandalan. Ini berguna pada kisaran ukuran partikel yang sama seperti untuk impingers (0,8 hingga

lebih dari 10 μm), yang sesuai dengan kisaran partikel yang dapat dihirup. Ini lebih mahal daripada

impingers, dan efisiensi pengambilan sampel biologis agak lebih rendah karena metode pengumpulan,

yang impaksi pada permukaan agar. Analisis virus yang dikumpulkan oleh impaksi juga agak sulit,

karena setelah impaksi, virus harus dicuci dari permukaan media impaksi dan dikumpulkan sebelum

pengujian. Sebaliknya, bakteri atau mikroorganisme lainnya dapat ditanam langsung di permukaan
agar. Sebagai alternatif, mikroba ini dapat dicuci dari permukaan dan diuji dengan menggunakan

metodologi standar lain seperti yang dijelaskan dalam Bab 10. Keuntungan tunggal terbesar dari

sampler Andersen 6-STG adalah bahwa penentuan ukuran partikel dapat diperoleh. Jadi, itu dua

sampler referensi (pelanggar dan Andersen 6STG) saling melengkapi kekurangan masing-masing.

8.3.1.3 Sentrifugasi

Sampler sentrifugal menggunakan pola aliran melingkar untuk meningkatkan tarikan gravitasi dalam

perangkat pengambilan sampel untuk menyimpan partikel. Siklon, perangkat saluran masuk

tangensial dan aliran balik, adalah tipe yang paling umum (Gambar 8.15). Sampler ini dapat mencicipi

berbagai volume udara (1.400 L / mnt), tergantung pada ukuran unit. Unit beroperasi dengan

menerapkan suction ke tabung outlet, yang menyebabkan udara masuk ke ruang atas unit pada suatu

sudut. Aliran udara jatuh ke dalam pola aliran tangensial yang khas, yang secara efektif mensirkulasi

udara di sekitar dan ke bawah di sepanjang permukaan bagian dalam rumah kaca kerucut. Sebagai

hasil dari peningkatan gaya sentrifugal yang dikenakan pada partikel-partikel di aliran udara, partikel-

partikel tersebut diendapkan. Berbentuk kerucut

ruang atas terbuka ke ruang bawah yang lebih besar, di mana sebagian besar pengendapan partikel ini

terjadi. Meskipun unit-unit ini mampu menangkap beberapa partikel berukuran terhirup, untuk

menjebak mikroorganisme secara efisien, perangkat harus dikombinasikan dengan beberapa jenis

aliran fluida terukur yang bertindak sebagai media perangkap. Unit ini, ketika digunakan oleh

seseorang yang mahir, dapat efektif untuk pengambilan sampel udara mikrobiologis. Ini relatif murah,

mudah disterilkan dan portabel, tetapi tidak memiliki efisiensi pengambilan sampel biologis yang

tinggi dan kemampuan ukuran partikel. Analisis dilakukan dengan menaikkan sampler dengan media

eluen, pengumpulan eluen dan pengujian selanjutnya dengan metodologi standar.

8.3.1.4 Filtrasi dan Endapan

Metode filtrasi dan deposisi keduanya banyak digunakan untuk pengambilan sampel mikroba karena

alasan biaya dan portabilitas. Pengambilan sampel filter membutuhkan sumber vakum dan melibatkan

aliran udara melalui filter, di mana partikel-partikelnya terperangkap. Filter membran dapat memiliki

ukuran pori bervariasi yang cenderung membatasi laju aliran. Setelah dikumpulkan, filter dicuci untuk

menghilangkan organisme sebelum dianalisis. Pengambilan sampel filtrasi untuk mikroorganisme

sangat tidak disarankan karena memiliki efisiensi pengambilan sampel keseluruhan yang rendah dan

tidak portabel. Namun, dalam banyak kasus, biaya rendah menjadikannya metode yang menarik. Satu

kasus di mana penyaringan secara rutin digunakan adalah dalam pengambilan sampel untuk airborne

lipopolysaccharide (LPS). Prosedur pengambilan sampel dan analisis untuk kadar LPS di udara

sedikit berbeda dari metode yang digunakan untuk analisis mikroorganisme di udara. Cara

pengambilan sampel yang paling efisien biasanya pengumpulan filter menggunakan polivinil klorida

atau filter membran serat kaca. Analisis kuantifikasi biasanya dilakukan dengan menggunakan uji

kromatogenik Limulus amebocyte lisat (Hurst et al., 2007). Sistem ini menggunakan Limulus

amebosit lisat yang diperoleh dari sel darah kepiting tapal kuda (Brooks et al., 2006). Lisat

mengandung sistem koagulasi terkait-enzim, yang diaktifkan oleh kehadiran LPS. Dengan

penambahan substrat, dan menggunakan pendaran, sistem ini dapat mengukur jumlah LPS lingkungan

dengan membandingkan dengan kurva standar. Pengambilan sampel pengendapan sejauh ini

merupakan metode pengambilan sampel yang termudah dan paling hemat biaya. Pengambilan sampel

pengendapan dapat dilakukan hanya dengan membuka lempeng agar dan mengeksposnya ke angin,

yang menghasilkan impaksi langsung, pengendapan gravitasi dan gaya pengendapan lainnya. Masalah

dengan metode pengambilan sampel ini adalah: efisiensi sampling keseluruhan rendah karena

bergantung pada deposisi alami, tidak ada tingkat pengambilan sampel yang ditentukan atau ukuran

partikel dan kesulitan intrinsik dalam pengujian untuk beberapa mikroorganisme dengan kondisi
pertumbuhan yang bervariasi. Analisis mikroorganisme yang dikumpulkan oleh pengendapan sampel

mirip dengan analisis sampel impaksi.

8.4 DETEKSI MIKROORGANISME TENTANG FOMIT

Fomites adalah benda mati yang mungkin terkontaminasi oleh organisme menular dan selanjutnya

melayani dalam penularannya. Pakaian, piring, mainan, meja dan jarum suntik adalah contoh dari alat

yang biasa digunakan. Fomites dapat memiliki ukuran mulai dari sekecil partikel debu rumah tangga,

hingga sebesar seluruh permukaan lantai. Kompleksitas dapat bervariasi dari permukaan datar, hingga

instrumen medis yang halus. Keterlibatan fomites dalam penularan penyakit telah diketahui jauh

sebelum identifikasi beberapa mikroorganisme patogen. Lebih dari 100 tahun yang lalu, penyebaran

cacar di kalangan pekerja binatu bukanlah hal biasa. Pada tahun 1908, wabah cacar ditelusuri ke kapas

impor yang terkontaminasi virus variola di kulit atau keropeng (Inggris, 1984). Fomites juga diyakini

penting dalam penularan virus pernapasan, seperti rhinovirus. Wabah virus hepatitis B, biasanya virus

yang ditularkan melalui darah yang terkait dengan transfusi darah, dikaitkan dengan kartu komputer

sebagai kemungkinan agen transfer. Kartu-kartu ini, ketika ditangani, menimbulkan luka kecil di

ujung jari, memungkinkan transmisi dan masuknya patogen ke inang baru (Pattison et al., 1974).

Pertumbuhan bakteri patogen enterik di sepon rumah tangga dan pada peralatan atau permukaan yang

digunakan untuk persiapan makanan juga telah diakui sebagai rute penting untuk mentransfer

organisme ini ke makanan atau permukaan lainnya. Inokulasi sendiri juga dapat terjadi ketika jari-jari

yang memegang spons atau perkakas dibawa ke mulut.

Fomites dapat terkontaminasi mikroorganisme patogen melalui kontak langsung dengan sekresi atau

cairan tubuh yang infeksius, tangan yang kotor, makanan yang terkontaminasi, atau mengendap dari

udara. Agar fomites berfungsi sebagai kendaraan penyakit mikroba, organisme harus dapat bertahan

hidup dalam hubungannya dengan fomites, dan berhasil ditransfer ke host. Kelangsungan hidup

organisme pada permukaan dipengaruhi oleh suhu, kelembaban, penguapan, pengeringan, cahaya,
radiasi ultraviolet, sifat fisik dan kimia permukaan dan zat di mana organisme ditangguhkan. Patogen

enterik dan pernapasan dapat bertahan hidup dari menit hingga minggu pada fomites, tergantung pada

jenis organisme dan faktor-faktor yang disebutkan sebelumnya (Boone dan Gerba, 2007).

Pengambilan sampel fomites sangat penting dalam industri manufaktur makanan untuk menilai

praktik sanitasi, dan umum digunakan dalam industri makanan dan industri kesehatan untuk

mengevaluasi efikasi pembersihan dan desinfeksi. Ini juga berguna dalam penyelidikan epidemiologis

dan evaluasi desinfektan permukaan keras. Pendekatan yang paling umum digunakan untuk

mendeteksi bakteri pada fomites melibatkan lempeng agar Rodac dan teknik swab rinse. Hidangan

Rodac adalah cawan Petri di mana agar memenuhi seluruh piring untuk menghasilkan permukaan

cembung, yang kemudian

ditekan ke permukaan untuk dijadikan sampel. Media selektif dapat digunakan untuk isolasi

kelompok organisme tertentu (mis., Media m-FC untuk fecal coliforms). Setelah inkubasi, koloni

dihitung dan dilaporkan sebagai unit pembentuk koloni (CFU) per cm2. Metode bilas swab

dikembangkan pada tahun 1917 untuk mempelajari kontaminasi bakteri pada peralatan makan

(Inggris, 1984). Metode ini juga cocok untuk pengambilan sampel virus. Kapas steril dibasahi dengan

penyangga atau larutan lain dan digosokkan pada permukaan untuk disampel. Ujung kapas kemudian

ditempatkan secara aseptik dalam wadah dengan larutan pengumpulan steril, wadah dikocok dan

cairan pembilas diuji pada media kultur yang sesuai, atau dengan teknik molekuler seperti metode

PCR. Pendekatan lain untuk pengambilan sampel permukaan adalah penggunaan spons, sistem vakum

menggunakan filter HEPA dan film agar (Peti-flim, 3M Corporation, Minneapolis, MN), dan bahkan

laboratorium Kimwipes (Yan et al., 2007). Spons, sistem vakum, dan tisu memungkinkan

pengambilan sampel pada area yang jauh lebih besar daripada swab. Dalam praktiknya, biasanya 100

cm2 disampel dengan swab atau spons.