ISOLASI DNA KROMOSOMAL DAN PLASMID DARI BAKTERI Escerechia coli

Khurin’in (1112095000006)¹
drh. Bhintarti S. Hastari, M.Biomed²
Festy Aulyaur Rahmah, S.Si²
Nugroho Adi Maulana³
Indina Reihannisha³

¹Mahasiswa Biologi, Fakultas Sains dan Teknologi, UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
²Dosen praktikum Biologi Molekular
³Asisten praktikum Biologi Mlekular
Jl. Ir. H. Juanda No.95 Ciputat 15412 Indonesia

Hurin.rin02@gmail.com
17 Oktober 2014

ABSTRAK

Larutan merupakan salah satu bahan penting dalam laboratorium biologi molekular. Larutan terlibat
langsung pada berbagai proses dalam teknik biologi molekular seperti isolasi DNA dan penggunaan
serta pemilahan larutan menentukan tingkat keberhasilan isolasi DNA yang didapat. Oleh karenanya
sebagai praktikan laboratorium biologi molekular perlu untuk mengetahui bagaimana mempersiapkan
bahan-bahan yang digunakan dalam berbagai teknik biomolekular serta cara pembuatannya. Sejumlah
larutan penting yang terlibat dalam isolasi DNA, diantaranya 5 M NaOH, O,5 M EDTA– Na2 pH 8 50
mL, 1 M Tris-HCL pH 7,5 50 mL, 25% larutan sukrosa 10 mL, 20% SDS (Sodium Dodesil Sulfat) mL, 5
N NaCl mL telah berhasil dibuat sebagai persiapan untuk proses isolasi DNA selanjutnya, dengan
menggunakan berbagai formula sehingga didapat larutan dengan konsentrasi yang diperlukan.

Kata kunci : Bahan, Isolasi

I. DASAR TEORI berdasarkan berat molekul komponennya.

Isolasi DNA merupakan langkah molekul yang mempunyai berat molekul besar
mempelajari DNA. salah satu prinsip isolasi akan berada di bagian bawah tabung dan
DNA yaitu dengan sentrifugasi. sentrifugasi molekul ringan akan berada pada bagian atas
merupakan teknik untuk memisahkan campuran tabung (Mader, 1993).
 Bakteri mengandung lebih banyak DNA
dibanding virus. Kromosom E. Coli merupakan
molekul DNA sirkular rantai ganda yang
mengandung 4.639.221 pasang basa dengan
panjang kira-kira 1,7 mm, 850x lebih panjang
dibanding sel E. Coli. Disamping
kromosom, beberapa bakteri juga mengandung
DNA ekstrakromosom yang disebut DNA
plasmid. DNA plasmid juga berbentuk sirkular
dengan ukuran yang jauh lebih kecil dibanding
DNA kromosom. Beberapa plasmid
bergabung dengan DNA kromosom
kemudian dapat dipotong lagi dengan tepat pada
peristiwa rekombinasi. DNA plasmid hanya
berukuran 1.000-100.000 pasang basa. Plasmid
membawa informasi genetik dan mengalami
replikasi untuk menghasilkan plasmid yang
identik dan diturunkan selama pembelahan sel
(Gaffar, 2007).
Prinsip isolasi DNA kromosom yaitu
memisahkan DNA kromosom atau DNA genom
dari komponen-komponen sel lain. Sumber DNA
bisa dari tanaman, kultur mikroorganise, atau sel
manusia. Membran sel dilisis
menambahkan detergen untuk membebaskan
isinya, kemudian pada ekstrak sel tersebut
ditambahkan protease (yang
mendegradasi protein) dan RNase
berfungsi untuk mendegradasi RNA), sehingga
yang tinggal adalah DNA. Selanjutnya ekstrak
tersebut dipanaskan sampai suhu 90ºC untuk
menginaktifasi enzim yang mendegradasi DNA
(DNase). Larutan DNA kemudian di presipitasi
dengan etanol dan bisa dilarutkan lagi dengan air
(Gaffar, 2007).
DNA plasmid merupakan wadah yang
digunakan untuk kloning gen, sehingga DNA
plasmid harus di pisahkan dari DNA kromosom.
DNA plasmid mempunyai ukuran yang jauh
lebih kecil daripada DNA kromosom. Untuk
memisahkan DNA plasmid, maka memerlukan
perlakuan yang sedikit berbeda dengan prosedur
isolasi DNA kromosom. Pertama, membran sel
DNA dilisis dengan penambahan detergen. Proses ini
membebaskan DNA kromosom, DNA plasmid,
RNA, protein dan komponen lain. DNA
kromosom dan protein diendapkan dengan
penambahan potasium. DNA + protein +
dapat potasium yang mengendap dipisahkan dengan
dan cara sentrifugasi. Supernatan yang mengandung
DNA plasmid, RNA dan protein yang tersisa
dipisahkan. Kemudian ditambahkan RNase dan
protese untuk mendegradasi RNA dan protein.
Akhirnya DNA plasmid dapat dipresipitasi
menggunakan etanol (Gaffar, 2007).
II. MATERI DAN METODE
Praktikum isolasi DNA kromosomal dan
plasmid dari bakteri Escherechia coli ini
dilaksanakan pada hari Jum’at, 27 September
2014 pkl. 13.30-16.00 WIB di Laboritorium
dengan Biologi Dasar Pusat Laboritorium Terpadu
Fakultas Sains dan Teknologi UIN Syarif
Hidayatullah Jakarta.
berfungsi Alat-alat yang digunakan yaitu mikropipet,
(yang sentrifuga, vortex, waterbath, inkubator, freezer,
yellow tips, blue tips, tabung mikro 1,5 mL, PD
column dan collection tube (2 mL).
Bahan-bahan yang digunakan yaitu kultur
bakteri E. coli, EDTA 50 mM, larutan sukrosa
25%, EDTA 0,5 m p H 8, lisozim 10 mg/ml,
NaCl 5 M, SDS 20%, proteinase-K 5 mg/mL,
kloroform, etanol dingin, buffer TE, buffer PD1,
RNAse A, buffer PD2, buffer PD3, buffer W1,
buffer wash, etanol absolut, buffer elusi,
Isolasi DNA Kromosomal Bakteri Tahap III. Neutralization
Kultur bakteri sebanyak 1,5 mL Ditambahkan 300 ʯL buffer PD3
disentrifugasi dengan kecepatan 4250 rpm pada kemudian dibolak-balik tabung 10 x (tanpa
suhu 4ºC selama 40 menit, lalu disuspensikan menggunakan vortex), kemudian disentrifug
kembali pelet yang didapat dengan 60 ʯL EDTA pada 14.000 – 16.000 x g selama 3 menit.
50 mM, dan kemudian disentrifugasi dengan Tahap V. DNA Binding
kecepatan 4250 rpm pada suhu 4ºC selama 15 PD column ditempatkan dalam 2 mL
menit. 40 ʯL arutan sukrosa 25% dan 10,5 ʯL collection tube, lalu dituang supernatan dari
EDTA 0,5 M p H 8 ditambahkan pada pelet yang tahap 7 dan selanjutnya disentrifuga pada
diperoleh, lalu ditambahkan dengan 1,5 ʯL 14.000-16.000 x g selama 30 detik. Cairan pada
lisozim 10 mg/mL dan diinkubasi pada suhu collection tube 2 mL dibuang lalu dipasang
37ºC selama 1 jam. Ditambahkan 18 ʯL NaCl 5 kembali PD column pada collection tube 2 mL.
M, 10,5 ʯL EDTA 0,5 M, 22,5 ʯL SDS 20%, dn Tahap VI. Wash
1,5 ʯL proteinase-K 5 mg/mL dan divortex. 600 ʯL wash buffer (dipastikan etanol telah
Sediaan kemudian diinkubasi pada suhu 50ºC ditambahkan) ditambahkan kedalam PD column
selama 1 jam dan ditambahkan kloroform (1:1) kemudian disentrifuga pada 14.000-16.000 x g
lalu dikocok perlahan selama 20 menit. selama 30 detik. Dibuang cairan dalam
Selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan collection tube 2 mL, lalu disentrifuga pada
4250 rpm pada suhu 4ºC selama 30 menit. 14.000-16.000 x g selama 3 menit untuk
Supernatan dipindahkan (larutan yang terlihat mengeringkan PD column.
bening) ke tabung baru yang berisi 2x volume Tahap VII. DNA elution
etanol dingin, lalu disentrifugasi dengan 50 ʯL buffer elusi ditambahkan ke
kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit dan bagian tengah PD column matrix, lalu dibiarkan
kemudian ditambahka pelet dengan 30 ʯL buffer selama minimal 2 menit agar buffer elusi
TE. terserap dengan sempurna. Setelah itu
disentrifuga pada 14.000-16.000 x g selama 2
Isolasi DNA Plasmid dengan Metode Spin menit untuk mendapatkan DNA murni.
Column Dituangkan kembali cairan dalam collection tube
Tahap I. Harvesting 2 m L ke bagian tengah PD column matrix.
1,5 mL kultur sel bakteri disiapkan dalam Kemudian disentrifuga pada 14.000-16.000 x g
tabung mikro 1,5 mL lalu disentrifuga pada selama 2 menit untuk mendapatkan DNA murni.
14.000 – 16.000 x g selama 1 menit kemudian
dibuang supernatan. III. HASIL DAN PEMBAHASAN
Tahap II. Resuspensi Isolasi DNA kromosomal dari bakteri
200 ʯL buffer PD1 (pastikan RNAse A E.coli, tahap pertama yaitu dilakukan kultivasi
telah ditambahkan) ditambahkan kedalam tabung bakteri E.coli pada media Luria-Bertani broth.
mikro kemudian divortex. Luria-Bertani broth ini merupakan media
Tahap III. Lysis selektif, yaitu selain mengandung nutrisi juga
mengandung ampisilin sehingga merangsang (supernatan)
E.coli resisten antibiotik dan menghambat Interfasa : protein
kontaminan yang peka ampisilin (Hadioetomo, dan zat-zat sisa
1993). Adapun hasil dari tahapan selanjutnya atau sampah
dalam isolasi DNA kromosomal dan plasmid Fasa organik :
dari bakteri E.coli dapat dilihat pada tabel 3.1 kloroform dan
dan 3.2. senyawa-senyawa
organik terikat
Tabel 3.1. Hasil isolasi DNA kromosomal Pemekatan Etanol Pelet atau

bakteri E.coli DNA presipitat DNA

kromosomal
Tahap Bahan Hasil
Kultivasi Media Luria- Kultur sel bakteri murni
Bertani broth E.coli
Resuspens 60 ʯL EDTA DNA tersuspensi Tabel 3.2 . Hasil isolasi DNA plasmid bakteri
i 50 mM E.coli
Lisis sel Tahap awal Supernatan DNA,
Tahap Bahan Hasil
pelisisan dan natan berisi Kultivasi Media Luria- Kultur sel
(dinding sel): kontaminan (harvesting) Bertani broth bakteri E.coli
40 ʯL sukrosa (penyusun sel) Resuspensi 200 ʯL bufer DNA tersuspensi

25%, 10,5 ʯL dan zat-zat sisa (resuspenso PD 1 dan

EDTA 0,5 M larutan pelisisan n) RNAse

Lisis (lysis) 200 ʯL bufer Supernatan
pH 8, 1,5 ʯL sel
PD 2 DNA, dan natan
lisozim 10
berisi
mg/mL
kontaminan
Tahap
(penyusun sel)
pelisisan
dan zat-zat sisa
kedua
larutan pelisisan
(membran sel)
sel
: 18 ʯL NaCl Netralisasi 300 ʯL bufer Supernatan
0,5 M, 10,5 (neutralizati PD 3 DNA, dan natan
ʯL EDTA 0,5 on) berisi zat-zat
M, 22,5 ʯL sisa larutan
SDS 20%, 1,5 pelisisan sel
ʯL (PD 2)
Proteinase-K Purifikasi Supernatan Tiga fasa:

5 mg/mL (DNA DNA elusion Fasa Atas :

Purifikasi Kloroform Tiga fasa: binding – dan PD column DNA murni dan
Fasa Atas : DNA DNA dalam 2 mL air (supernatan)
murni dan air elusion) collection tube Interfasa :
 protein dan zat- 10 mg/mL dan diinkubasi pada suhu 37ºC
zat sisa atau selama 1 jam. Pemberian lisozim berfungsi
sampah untuk merusak dinding sel bakteri secara
Fasa organik : enzimatis. Sedangkan inkubasi dan pengaturan
kloroform dan suhu bertujuan untuk mengoptimalkan kerja
senyawa- enzim lisozim.
senyawa organik Tahap lisis sel pada isolasi DNA
terikat kromosom bakteri yaitu dengan ditambahkan
Pemekatan 600 ʯL bufer supernatan DNA NaCl, EDTA dan SDS serta proteinase-K.
DNA wash dan plasmid murni Penambahan NaCl ini yaitu untuk
(Wash) etanol menghilangkan polisakarida yang mungkin
terdapat pada sel bakteri. EDTA berfungsi untuk
Isolasi Kromosomal DNA Bakteri E.Coli
mencegah koagulasi DNA dan menjaga struktur
Tahap pertama setelah dilakukannya
DNA sehingga tidak rusak. Proteinase-K
kultivasi yaitu resuspensi sel bakteri. Setelah
berfungsi untuk mendenaturasikan protein secara
disentrifugasi dengan kecepatan 4250 rpm pada
enzimatis, sehingga protein terpresipitasi. SDS
suhu 4ºC selama 20 menit, pelet yang didapat
merupakan salah satu jenis deterjen yang dapat
kemudian disuspensikan kembali dengan
mengikat atau menyelimuti protein membran
menambahkan 60 ʯL EDTA 50 Mm, lalu
sehingga terpisah dari bilayer lipid. Deterjen
disentrifugasi kembali. Penambahan EDTA ini
memiliki kemampuan melarutkan lipid sebagai
untuk mencegah koagulasi DNA sehingga DNA
komponen membran sel, karena memiliki sifat
didapat sebagai supernatan dan dapat dipisahkan
amfipatik (Lubis dan Melviana, 2013). Proses
dengan natannya.
melarutkan atau memecah komponen membran
Tahap selanjutnya pada isolasi DNA
sel tersebut dikenal dengan istilah solubilisasi
kromosomal ditambahkan sukrosa 25% dan 10,5
membran sel (Prasetyo, 2009).
ʯL EDTA 0,5 M p H 8. Fungsi penambahan
Tahap selanjutnya yaitu tahap purifikasi
EDTA pada tahap ini yaitu untuk mengikat
atau pemurnian DNA yang diisolasi. Pada tahap
kation-kation divalen seperti Mg2+ dan Ca2+.
ini ditambahkan kloroform yaitu agar pelarut
Kedua ion ini berfungsi sebagai kofaktor yang
organik ini secara signifikan dapat
esensial bagi aktivitas Dnase dalam mencacah
mendenaturasi protein dan melarutkan
molekul DNA. Selain itu, ion Mg dan Ca
komponen lipid, selain itu kloroform juga
diketahui berperan penting dalam memelihara
menstabilkan zona interfase yang berisi
integritas dan kestabilan membrane plasma
kontaminan DNA. Pada penambahan kloroform
bakteri sehingga kerja EDTA juga berfungsi
ini akan menghasilkan tiga fasa yaitu paling atas
membantu destabilisasi membran. Sedangkan
adalah DNA dan air, fasa kedua protein dan sisa-
Menurut Triana, dkk. (2012) penambahan
sisa kontaminan atau sampah dari sel yang
sukrosa berperan dalam melisiskan dinding sel
disebut juga zona interfase, dan fasa ketiga
bakteri. Selanjutnya dtambahkan dengan lisozim
adalah kloroform seta senyawa-senyawa organik
yang diikatnya sehingga disebut juga fasa
organik. Fase ini memisahkan DNA dengan
kontaminannya sehingga DNA yang didapat
merupakan DNA murni, selain itu juga
memudahkan pengambilan DNA yang terdapat
di fasa paling atas akibat adanya penambahan
kloroform.
Tahap berikutnya adalah pemekatan
DNA. Cara sederhana dan murah untuk
memisahkan DNA dari larutan dapat dilakukan
dengan presipitasi etanol. Prosedur dasarnya
adalah etanol absolut ditambahkan ke larutan
DNA. Proses presipitasi etanol umumnya dapat
dibantu dengan penambahan garam. Setelah
perlakuan itu, DNA akan terpresipitasi dan dapat
dipeletkan dengan sentrifugasi. Selanjutnya pelet
DNA dicuci dengan etanol 70%. Kemudian pelet
dikeringkan dan setelah itu dilarutkan kembali ke
dalam air atau buffer tris EDTA (TE). Lalu
disimpan pada suhu -20ºC, suhu ini mendukung
DNA dalam bentuk presipitat.
Isolasi DNA Plasmid Bakteri E.coli
Metode yang digunakan dalam isolasi
DNA plasmid E.coli yaitumetode spin column.
Metode ini merupakan metode yang lebih mudah
dilakukan karena larutan-larutan yang digunakan
sudah tersedia dalam bentuk campuran PD
column sehingga pengerjaan pun lebih cepat,
akan tetapi metode ini relatif mahal. Pada
metode ini terdiri dari 7 tahap yaitu harvesting,
resuspension, lysis, neutralization, DNA binding,
Wash, dan DNA elution. Metode spin column
merupakan modifikasi dari metode alkalin lisis
dan penggunaan RNAse untuk memperoleh sel
yang terlisiskan dengan sempurna dan
meminimalisir kontaminan genomik
(www.geneaid.com).
Pada tahap pertama yaitu harvesting step,
ini sama dengan metode kultivasi sel bakteri
pada metode manual. Karenanya disebut tahap
pemanenan atau harvesting. Pada tahap ini kultur
sel bakteri yang dibutuhkan yaitu 1,5 mL karena
merupakan prosedur standar dalam pengerjaan
metode spin column.
Tahap selanjutnya yaitu tahap
resuspension, dengan menambahkan PD 1, dan
sebelumnya telah ditambahkan RNAse. Tahap in
sama dengan tahap resuspensi pada metode
manual dengan komposisi Tris-EDTA dan
glukosa, sebagai tahap awal perusakan dinding
sel bakteri.
Tahap ketiga yaitu tahap Lysis, dengan
menambahkan bufer PD 2. Tahap ini sama
dengan tahap manual pelisisan sel bakteri, yang
biasanya menggunakan SDS dan NaOH. Pada
tahap ini berbeda dengan tahap lisis pada isolasi
kromosom. Dimana terdapat perusakan DNAse,
yang dikhawatirkan dapat merusak DNA
plasmid. SDS merupakan garam deterjen
anionik, yang ketika dilarutkan dalam air akan
berdisosiasi menjadi ion Na+ dan dan dodesil
sulfat. Dodesil sulfat adalah molekul deterjen
berantai hidrofobik panjang dengan gugus sulfat
bermuatan negatif pada salah satu ujungnya.
Dodesil sulfat akan berikatan dengan bagian
interior lipid bilayer pada membran sehingga
mengakibatkan lisis sel. Komponen selular
bakteri termasuk DNA dan RNA akan keluar dan
larut dalam. Ion deterjen dodesil sulfat juga
mendenaturasi protein yang ada dalam lisat,
dengan jalan memutuskan ikatan-katan non
kovalen (terutama ikatan hidrogen) pada protein,
sehingga kembali ke struktur primernya, sebagai
rantai linier polipeptida. Hal ini membuat
protein-protein enzim kehilangan aktivitas pH larutan kembali netral, ikatan-ikatan hidrogen
enzimatiknya, termasuk enzim Dnase yang antar basa utas tunggal DNA terbentuk kembali,
dikhawatirkan merusak DNA plasmid. Pada sehingga molekul tersebut dapat berenaturasi
tahap ini larutan akan berisi asam nukleat (DNA menjadi DNA berutas ganda. Proses renaturasi
dan RNA) dan debris sel yang terdapat dalam inilah yang menjadi tahap seleksi bagi plasmid.
kompleks dodesil sulfat-lipid-protein. Sementara Utas-utas tunggal sirkular DNA plasmid yang
itu, NaOH yang bersifat basa membuat seluruh yang berukuran kecil dan tetap saling bertautan
molekul DNA berutas ganda baik DNA dapat berenaturasi sempurna membentuk utas
kromosomal maupun plasmid mengalami ganda yang tetap berada dalam larutan;
denaturasi menjadi utas-utas tunggal. Itulah sedangkan DNA kromosomal yang berukuran
mengapa metode ini disebut sebagai metode lisis jauh lebih besar dari plasmid tidak dapat
basa (alkaline lysis). Pada tahapan ini, DNA berenaturasi sempurna, membentuk struktur
kromosomal terpisah sempurna menjadi utas- kusut tak beraturan yang terperangkap dan ikut
utas tunggal terpisah; sedangkan utas tunggal terpresipitasi bersama kompleks KDS-lipid-
plasmid yang berbentuk lingkaran tetap protein. Oleh karena itu, pencampuran pada
terhubung, seperti dua cincin yang saling tahap lisis sel harus dilakukan dengan perlahan.
bertautan. Karakter ukuran dan struktur kedua Pengocokan yang kuat (misalnya vortex) akan
jenis DNA inilah yang menjadi dasar pemisahan mengakibatkan molekul DNA kromosom akan
DNA plasmid dari DNA kromosomal. terpotong menjadi fragmen-fragmen yang kecil
yang dapat ikut berenaturasi seperti halnya DNA
Tahap selanjutnya adalah tahap
plasmid, dan mengkontaminasi DNA plasmid.
neutralization atau netralisasi. Pada tahap ini
ditambahkan bufer PD 3, sedangkan pada Tahap kelima yaitu tahap DNA binding,
metode manual tahap netralisasi ini dilakukan dimana pada tahap ini PD column ditempatkan
dengan menambahkan sodium asetat pH 5,5. Ion pada collection tube 2 mL, dan supernatan pada
K+ bebas yang berasal dari potasium asetat pada tahap DNA elution dituangkan kedalamnya.
larutan III akan menetralkan muatan negatif dari Sedangkan pada metode manual tahap ini
kompleks kompleks dodesil sulfat-lipid-protein merupakan tahap purifikasi atau pemurnian
terdenaturasi, membentuk potasium dodesil DNA plasmid yang diisolasi. Biasanya dilakukan
sulfat (KDS) yang tidak larut dan terpresipitasi dengan penambahan kloroform-alkohol seperti
bersama lipid membran dan protein yang kloroform-fenol. Purifikasi bertujuan untuk
terdenaturasi. Laju presipitasi KDS dapat membersihkan isolat dari kontaminasi bahan
ditingkatkan dengan inkubasi pada suhu es (4oC). selain DNA. Pada tahap ini, kontaminan yang
umum terdapat dalam larutan adalah protein dan
Asam asetat pada sodium asetat ini
komponen buffer yang digunakan dalam tahap
berfungsi menetralkan suasana basa yang
sebelumnya seperti garam potasium asetat, SDS,
diciptakan oleh ion hidroksida dari NaOH yang
dan EDTA. Campuran pelarut organik
diberikan pada tahap lisis sebelumnya. Ketika
(kloroform-fenol) ini secara signifikan dapat
mendenaturasi protein dan melarutkan sentrifugasi. Selanjutnya pelet DNA dicuci
komponen lipid. Jumlah fenol-kloroform yang dengan etanol 70%. Kemudian pelet dikeringkan
ditambahkan umumnya satu kali volume larutan dan setelah itu dilarutkan kembali ke dalam air
yang akan dipurifikasi. Umumnya fenol- atau buffer tris EDTA (TE).
kloroform disiapkan dalam bentuk campuran
Tahap terakhir yaitu tahap DNA elusion,
fenol – kloroform - isoamil alkohol dengan
pada tahap ini ditambahkan bufer elusi lalu
perbandingan volume 25:24:1. Campuran fenol-
disentrifugasi untuk mendapatkan DNA murni
kloroform adalah campuran yang homogen.
yang akan digunakan pada tahap purifikasi DNA
Fenol-kloroform dan air tidak dapat bersatu
di tahap kelima. Agar didapat DNA plasmid
sehingga akan terbentuk dua fase yakni fase air
yang benar2 murni maka sebelum dipurifikasi,
(fase aqueous) dan fase fenol-kloroform. Fenol-
DNA telah dimurnikan pada tahap ini. tahap ini
kloroform lebih ‘berat’ daripada air sehingga
lah yang membedakan dengan metode manual.
fasenya berada di bawah fase air. Kedua fase
Pada metode manual, purifikasi langsung
kemudian dicampur dengan cara vorteks.
dilakukan setelah tahap netralisasi tanpa
Pencampuran akan membuat fenol masuk ke
sebelumnya ada perlakuan khusus untuk
dalam lapisan air dan membentuk emulsi droplet.
mempersiapkan DNA sebelum memasuki tahap
Protein akan terdenaturasi dan terperangkap
purifikasi.
dalam fase fenol-kloroform, sedangkan DNA
tetap berada di air. Kedua fase kemudian dapat
IV. KESIMPULAN
dipisahkan dengan baik dengan sentrifugasi.
Kesimpulan dari praktikum isolasi DNA
Fase atas yang berisi DNA akan dapat dengan
kromosomal dan lasmid dari bakteri Escherechia
mudah diambil dengan pemipetan, dan fase
coli yaitu telah dilakukan isolasi DNA
fenol-kloroform dapat dibuang. kromosomal dan plasmid dari bakteri E.coli,
dengan hasil sebagai berikut:
Tahap selanjutnya yaitu tahap Wash pada
1. Pada isolasi kromosomal produk DNA
tahap ini ditambahkan bufer wash dan
berupa pelet atau presipitat sedangkan
sebelumnya telah ditambahkan etanol. Tahap ini
pada plasmid berupa spernatan, karena
sama dengan tahap pemekatan DNA pada
perbedaan berat molekul (ukuran plasmid
metode manual. Pemekatan DNA bertujuan
< kromosom).
memisahkan DNA dari larutan sehingga
2. Penggunaan spin column pada isolasi
diperoleh konsentrasi yang lebih tinggi. Cara
DNA plasmid lebih efesien waktu dan
sederhana dan murah untuk memisahkan DNA
tenaga dibandingkan dengan metode
dari larutan dapat dilakukan dengan presipitasi
manual isolasi DNA kromosomal bakteri
etanol. Prosedur dasarnya adalah etanol absolut
E.coli.
ditambahkan ke larutan DNA. Proses presipitasi
etanol umumnya dapat dibantu dengan
penambahan garam. Setelah perlakuan itu, DNA
akan terpresipitasi dan dapat dipeletkan dengan
 Elektroforesis Agarose Dan Sds-Page.
UI. Jakarta.
Prasetyo, A.A. 2009. Materi Asistensi Biomedik
FK UNS. Universitas Negeri Surakarta,
Solo.
www.geneaid.com (diakses pada 27 Oktober
2014)

DAFTAR PUSTAKA
Gaffar, Sabrani. 2007. Bioteknologi Molekul.
Kimia FMIPA universitas Padjadjaran.
Bandung.
Mader,S.S. 1993. Biology. Wm. C Brown
Publishers. Lowa
Triana, Rian, Farris Fathin dan Deffy Paradithya.
2012. Laporan Praktikum: Isolasi dan
Pemurnian DNA Plasmid. IPB, bogor.
Hadioetomo. 1993. Media kultur bakteri.
Erlangga. Jakarta.
Lubis, D.M. dan Melviana. 2013. Isolasi Dna,
Isolasi Protein Darah, Serta
Pemeriksaan Dengan Teknik Pcr,

LAMPIRAN