Isolation of secondary metabolites from Geranium molle L.

with anticancer potential

Diajukan untuk memenuhi tugas mata kuliah Analisis Metabolit Sekunder

Oleh :
Nonny Tri Wulandari
1708103010041

Pembimbing
Dr. Nurdin Saidi, M.Si
NIP. 196609151991031005

PROGRAM STUDI KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS SYIAH KUALA
DARUSSALAM-BANDA ACEH
2020
 Isolasi metabolit sekunder dari Geranium molle L. dengan potensi antikanker

2. Bahan dan Metode

2.1. Prosedur eksperimental umum

Titik lebur diukur dalam peralatan titik lebur yang dilengkapi dengan mikroskop
binokular (Rotoquímica, Portugal) dan tidak dikoreksi. Spektrum NMR diperoleh pada
spektrometer Bruker NEO-500 (1H500MHz, 13C125MHz) yang dilengkapi dengan sensor TXI.
Kumpulan data diproses menggunakan perangkat lunak Bruker Topspin 4.0.2. Sampel dilarutkan
dalam metanol-d4 dalam tabung gelas NMR (5mm). Pergeseran kimia dinyatakan dalam ppm
relatif terhadap sinyal proton residual dalam pelarut yang dideuterasi. Pergeseran kimia
dilaporkan sebagai posisi (δ dalam ppm), multiplisitas, konstanta kopling (J dalam Hz), integral.
Atribusi proton dan karbon diperoleh dari analisis 2D eksperimen (COZY, HSQC dan HMBC).
Spektrum massa waktu ionisasi electrospray resolusi tinggi (HRMS ESI-TOF) ditentukan pada
Apex-Q FT-ICR atau spektrometer massa micrOTOF (Bruker, Jerman). Pemisahan HPLC
semipreparatif dilakukan pada instrumen DIONEX UltiMate 3000 yang dilengkapi dengan
kolom RP-C18 (ACE, 5μm, 250mm × 10mm). Analisis HPLC dilakukan dengan instrumen
DIONEX UltiMate 3000 yang dilengkapi dengan kolom RP-C18 (ACE, 5μm, 250mm × 4.6mm).
Pelarut untuk pemisahan HPLC adalah tingkat kromatografi.

2.2. Bahan Tanaman

Geranium molle L. dikumpulkan dari Serra da Nogueira, Bragança, Portugal timur laut,
pada Maret 2015. Identifikasi botani dikonfirmasikan oleh ahli agronomi Dra. Ana Maria
Carvalho dari Sekolah Pertanian, Instituto Politécnico de Bragança (Trás-os-Montes, Portugal).
Spesimen voucher (Geranium molle L. ETBO 61 tanggal 30 Maret 2015) disimpan di herbarium
di Escola Superior Agrária de Bragança (BRESA).

2.3. Persiapan fraksi

Ekstrak aseton awal diperoleh dengan ekstraksi berurutan dari seluruh tanaman
terliofilisasi dengan berbagai pelarut organik (nhexane, CH2Cl2, EtOAc, aseton dan MeOH)
seperti yang dijelaskan sebelumnya (Graça et al., 2016). Ekstrak aseton kasar kemudian
difraksinasi dengan kromatografi kolom elusi gradien dalam silika gel menggunakan seri
eluotropik yang terdiri dari CH3Cl, EtOAc, aseton, MeOH dan HCO2H untuk menghasilkan 12
fraksi (FA1 ke FA12) seperti yang dijelaskan (Graça et al., 2018).

2.4. Isolasi senyawa

Fraksi FA4, FA5 dan FA6 dipisahkan menggunakan HPLC semipreparatif. Sistem eluen
terdiri dari 1% HCO2H cair (eluen A) dan MeOH (eluen B) dan laju aliran 1mL / mnt digunakan.
Elusi dilakukan sebagai berikut: 0–130 menit, 5–65% MeOH; 130–134 mnt, 65–5% MeOH;
134–150 mnt, 5% MeOH. Volume injeksi adalah 2 mL. Sebanyak 105 sub-fraksi masing-masing
1,43 mL dikumpulkan. Kemurnian masing-masing subfraksi dikonfirmasi oleh HPLC analitik,
menggunakan campuran eluen dan laju aliran yang dijelaskan di atas. Program yang digunakan
adalah 0–65 menit, 5–65% MeOH; 65–67 menit, 65–5% MeOH; 67–75 menit, 5% MeOH.
Volume injeksi adalah 50μL. Subfraksi yang mengandung senyawa tunggal yang sama
digabungkan, dipekatkan di bawah tekanan tereduksi dan diliofilisasi. Fraksi FA4 (1g)
menghasilkan campuran 2,3-dygalloyl-4,6-HHDP-α-D-glukosa (3a) dan 2,3-dygalloyl-4,6-
HHDP-β-D-glukosa (3b) (50mg). Fraksi FA5 (400mg) menghasilkan apigenin-6-C-glucoside (1)
(1mg) dan lutelin-6-Cglucoside (2) (8mg). Fraksi FA6 (500mg) dilengkapi 2 (5mg).
Apigenin-6-C-glucoside (1): Kuning, bubuk amorf; M.p. 221–222 ° C; UV (MeOH)
λmax 213, 271, 336nm; Data 1H dan 13C NMR (CD3OD): Tabel 1; HRMS (ESI-TOF) m / z:
433.1124 ([M + H]+, hitung untuk C21H21O10: 433.1129); m / z: 455.0936 ([M + Na] +, kalkulasi
untuk C21H20NaO10: 455.0949).
Luteolin-6-C-glucoside (2): Kuning, bubuk amorf; M.p. 242–243 ° C; UV (MeOH) λmax
212, 270, 349nm; Data 1H NMR dan 13C NMR (CD3OD): Tabel 1; HRMS (ESI-TOF) m / z:
449.1077 ([M + H]+, kalkulasi untuk C21H21O11: 449.1078); m / z: 471.0899 ([M + Na] +,
kalkulasi untuk C21H20NaO11: 471.0898).
2,3-Dygalloyl-4,6-HHDP-α-D-glukosa (3a) / 2,3-Dygalloyl-4,6HHDP-β-D-glukosa (3b):
Bubuk putih. UV (MeOH) λmax 218, 276nm; Data 1H NMR dan 13C NMR (CD3OD): Tabel 2;
HRMS (ESI-TOF) m / z: 787.0993 ([M + H] +, kalkulasi untuk C34H27O22: 787.0988); m / z:
809.0822 ([M + Na]+, kalkulasi untuk C34H26NaO22: 809.0808).
2.5. Sitotoksisitas pada garis sel tumor manusia dan hepatotoksisitas pada sel nontumour

Senyawa1-3weredissolvedinH2O / MeOH80 / 20 (v / v) untuk mendapatkan larutan stok

dengan konsentrasi 8mg / mL. Solusi akhir, dengan kisaran konsentrasi dari 6,25 hingga 400μg /
mL, disiapkan dengan pengenceran seri larutan stok. Sitotoksisitas in vitro dievaluasi dengan uji
Sulforhodamine B (SRB) menggunakan empat garis sel tumor manusia: MCF-7
(adenokarsinoma payudara), NCI-H460 (kanker paru-paru sel non-kecil), HeLa (karsinoma
serviks) dan HepG2 (karsinoma serviks) ), seperti yang dijelaskan di tempat lain (Barros et al.,
2013; Dias et al., 2013).
Hepatotoksisitas dievaluasi terhadap sel primer hati babi non-tumor (PLP2). Kultur sel ini
dibuat dari hati babi yang baru dipanen yang diperoleh dari rumah pemotongan hewan lokal,
seperti yang dijelaskan (Barros et al., 2013; Dias et al., 2013). Uji SRB dilakukan sesuai dengan
prosedur yang dijelaskan sebelumnya (Barros et al., 2013; Dias et al., 2013). Dalam semua
kasus, hasilnya dinyatakan dalam nilai GI50, yang sesuai dengan konsentrasi yang menghambat
50% pertumbuhan sel. Ellipticine digunakan sebagai standar.

2.6. Analisis statistic

Semua tes dilakukan dalam rangkap dua. Hasilnya dinyatakan sebagai nilai rata-rata dan
standar deviasi. Hasilnya dianalisis menggunakan uji-t Student untuk menentukan perbedaan
yang signifikan antara sampel yang berbeda, dengan α = 0,05, menggunakan IBM SPSS
Statistics for Windows, versi 23.0. (IBM Corp., Armonk, NY, USA).
 Skema Isolasi

Serbuk Geranium molle L.

diekstraksi dengan aseton

Ekstrak Aseton

fraksinasi dengan kromatografi

kolom silika gel dengan eluen
CH3Cl, EtOAc, aseton, MeOH dan
HCO2H l. Kemudian dipekatkan
dengan penguapan vakum

Fraksi CH3Cl Fraksi EtOAc Fraksi MeOH Fraksi HCO2H

Fraksi aseton

kromatografi kolom silika gel

eluen HCO2H dan MeOH

F1 F2 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10 F11 F12

F3

HPLC semipreparative HPLC semipreparative

menggunakan asam menggunakan asam
format cair 1% dan MeOH format cair 1% dan MeOH

apigenin-6-C-
2,3-dygalloyl- 2,3-dygalloyl- glucoside (1)
4,6-HHDP-α- 4,6-HHDP-β-
D-glukosa (3a) D-glukosa (3b)

lutelin-6-C-
glucoside (2)