Euglenid fotosintetik (Euglenophyta) adalah kelompok eukariota uniseluler monofiletik yang ditandai

dengan adanya plastid, yang muncul sebagai hasil dari endosimbiosis sekunder. Banyak genom
Euglenophyta plastid (pt) telah dikarakterisasi baru-baru ini, tetapi mereka terutama mewakili satu
keluarga - Euglenaceae. Di sini, kami melaporkan analisis komparatif genom plastid dari delapan
perwakilan keluarga Phacaceae. Genom plastid berurutan baru berbagi sejumlah fitur termasuk sinten
dan konten gen, kecuali gen mat2 dan mat5 yang mengkode pematangan. Keragaman yang diamati dari
jumlah intron dan ada / tidaknya maturasi menguatkan korelasi yang disarankan sebelumnya antara
jumlah maturasi dalam gen pt dan proliferasi intron. Anehnya, genom pt taksa milik Discoplastis dan
Lepocinclis mengkodekan dua daerah pengulangan terbalik (IR) yang mengandung operon rDNA, yang
tidak ada dalam Euglenaceae. Dengan memetakan ada / tidaknya wilayah IR pada pohon filogenomik
yang diperoleh, kami merekonstruksi peristiwa yang paling mungkin terjadi dalam evolusi IR di
Euglenophyta. Studi kami menyoroti sifat dinamis genom plastid Euglenophyta, khususnya yang
berkaitan dengan daerah IR yang mengalami kerugian berulang kali.

Plastid berasal dari peristiwa endosimbiotik tunggal antara cyanobacterium dan leluhur bersama
ganggang hijau (termasuk tanaman darat), ganggang merah dan glaukosit - suatu peristiwa yang disebut
endosimbiosis primer1. Plastid dari kedua ganggang hijau dan ganggang merah kemudian dipindahkan
ke garis keturunan eukariotik lainnya, yang memunculkan plastid sekunder. Plastida ganggang hijau
diambil oleh dua kelompok eukariota mikroba (protista): euglenofita dan klorarakniofita1. Plastida dari
alga merah diwariskan ke beberapa garis keturunan alga seperti ochrophytes, haptophytes, dan lainnya.
Walaupun asal usul dan sejarah evolusi plastid dalam berbagai garis keturunan eukariotik sangat
berbeda, hampir semua plastid mengandung genomnya sendiri, yang memiliki beberapa ciri umum.
Sebagian besar genom plastid berurutan berasal dari tanaman darat dan ganggang hijau, tetapi jumlah
genom plastid lainnya telah meningkat secara substansial selama beberapa tahun terakhir. Sebagian
besar plastid memiliki struktur yang serupa, gen tersebar di antara pengulangan terbalik (IR) dan salinan
tunggal besar dan kecil (LSC dan SSC) 2,3 daerah. Wilayah IR yang mengandung gen untuk rRNA dan
sejumlah variabel tRNA dan protein didistribusikan secara luas di semua plastid primer dan sekunder
serta dalam genom cyanobacterial3. IR telah disarankan untuk berperan dalam inisiasi replikasi4,
stabilisasi gen5, dan konservasi gen5,6. Konten gen sangat bervariasi ketika kita mempertimbangkan
semua eukariota fotosintesis, tetapi dalam masing-masing garis keturunan evolusi, konten dan urutan
gen adalah fitur yang dilestarikan. Dalam beberapa genom plastid, terutama euglenid dan tanaman
darat, ada juga intron penyambungan sendiri, yang diperkirakan telah menginvasi genom plastid pada
banyak kesempatan7,8. Inti kelompok I yang dikodekan oleh plastid, ditemukan pada gen rRNA, tRNA
atau protein, telah dilaporkan dalam apicomplexans, glaucophytes, stramenopiles dan Viridiplantae3.
Kelompok II intron ditemukan di plastid kriptofit, euglenid, dan Viridiplantae dan biasanya ada dalam
tRNA atau gen penyandi protein3. Contoh paling ekstrim dari turunan intron kelompok II adalah
karakteristik untuk genom plastid euglenid. Ini termasuk intron "grup III" yang direduksi menjadi 73-119
nukleotida, dan "twintron" yang merupakan intron grup II yang bersarang di dalam intron grup II
lainnya9-11. Asal sekunder plastid euglenid dan penemuan intron yang tidak biasa pada genom plastid
memicu penelitian lebih lanjut tentang evolusi genom plastid mereka.
Euglenid fotosintetik (Euglenophyta) merupakan subclade tunggal dalam euglenid. Plastida mereka,
tertutup oleh tiga membran, muncul sebagai hasil dari endosimbiosis sekunder antara euglenid
eukariovorum fagotropik dan ganggang hijau yang berhubungan dengan Pyramimonas. Dalam euglenid
fotosintesis, tiga garis keturunan evolusi dibedakan. Spesies mixotrophic tunggal Rapaza viridis
membentuk garis keturunan paling dasar13. Euglenid fotosintesis lainnya dibagi menjadi dua kelompok:
Eutreptiales dominan laut dan Euglenales air tawar. Euglenales dibagi menjadi dua keluarga: Phacaceae
dan Euglenaceae14,15. Fitur genom plastid sekunder euglenid telah dipelajari secara sangat intensif
dalam beberapa tahun terakhir karena genom plastid yang lebih banyak telah diurutkan. Genom plastid
pertama Euglena gracilis diurutkan lebih dari dua dekade yang lalu16 tetapi jumlah urutan genom
plastid meningkat pesat sejak 2012 yang menghasilkan 18 genom plastid euglenid yang diurutkan sejauh
ini. Tiga genom Eutreptiales plastid telah dikarakterisasi12,17,18 dan 15 dari Euglenales, termasuk 14
dari Euglenaceae19 dan hanya satu dari Phacaceae20. Genom plastid euglenid telah mengalami
perubahan dinamis, termasuk pengurangan genom karena hilangnya atau transfer gen ke nukleus12,
proliferasi intron11,21, dan penataan ulang genom. Proliferasi intron telah diusulkan untuk
dikorelasikan dengan jumlah maturasi pada gen pt20. Mayoritas gen di antara genom pt euglenid yang
sebelumnya diurutkan memiliki komplemen dasar yang sama dari gen pengkode protein. Namun, ada
perubahan signifikan dalam pengaturan gen. Taksonomi yang memiliki hubungan lebih dekat cenderung
memiliki sintaksis yang lebih besar21 daripada organisme yang lebih berbeda, yang ditunjukkan
penataan ulang yang luas22.

Phacaceae terdiri dari tiga genera monofiletik: Phacus, Lepocinclis, dan Discoplastis. Keluarga Phacaceae
telah diusulkan baru-baru ini berdasarkan hubungan filogenetik14,15,23 dan sinapomorphy morfologis -
kehadiran banyak, plastida kecil tanpa pirenoid. Genus Phacus didirikan pada pertengahan abad XIX24
untuk mengakomodasi taksa dari genus Euglena yang kaku dan tidak mengalami metabolisme. Genus
Lepocinclis didirikan beberapa tahun kemudian oleh Perty25 untuk menggabungkan taksa dari genus
Phacus yang tidak diratakan. Dengan munculnya sekuensing molekuler, pembagian taksa antara Phacus
dan Lepocinclis telah divalidasi dan genus baru Discoplastis didirikan untuk mengakomodasi beberapa
spesies yang sebelumnya termasuk dalam genus Euglena dan ditandai oleh banyak plastida kecil tanpa
pirenoid dan metabolisme yang kuat dari sel26. Genus Phacus dan Lepocinclis kaya akan spesies dan
telah dipelajari secara intensif pada tingkat spesies dalam dekade terakhir, dan beberapa spesies baru
telah dideskripsikan27–31. Sebaliknya, genus Discoplastis hanya terdiri dari dua spesies26. Di sini, kami
melaporkan fitur struktural dari delapan genom plastid yang baru diurutkan dari perwakilan keluarga
Phacaceae, termasuk lima taksa dari Lepocinclis, dua taksa dari Phacus, dan satu takson Discoplastis.
Kami berusaha mengidentifikasi perubahan genom utama yang terjadi dalam garis keturunan yang
diselidiki. Genom yang diperiksa menunjukkan variabilitas yang cukup besar di semua tingkatan kecuali
kandungan gen. Kami juga menyajikan pohon-pohon filogenom yang disimpulkan dari sekuens genom
plastid. Hasil kami menyoroti hilangnya wilayah IR yang berulang selama evolusi Euglenophyta.

Hasil dan Diskusi

Kami menyelidiki delapan taksa yang mewakili ketiga genera yang tercakup dalam keluarga Phacaceae
dan menemukan bahwa genom plastid mengalami perubahan penting pada tingkat organisasi genom
dan prevalensi intron selama evolusi Phacaceae. Sebelum analisis komparatif kami, relatif sedikit yang
diketahui tentang tingkat perubahan genom kloroplas di seluruh Phacaceae dan hanya satu spesies,
Phacus orbicularis, yang telah diurutkan20. Ketika dibandingkan dengan karakteristik gen gen
Euglenaceae pt19,21,32, mereka sangat mirip dalam kandungan gen mereka. Namun, beberapa ciri fisik
yang ada dalam Phacaceae luar biasa jika dibandingkan dengan sisa dari Euglenales dan Euglenophyta.

Fitur umum.

Sebelumnya, genom pt Eutreptia viridis berisi genom terkecil di antara Euglenophyta pada 65.513 bp17,
diikuti oleh sesama anggota Eutreptiales - Eutreptiella gymnastica (67, 622 bp) 12, yang mengarah pada
asumsi bahwa ada ekspansi dalam genom tersebut. ukuran dalam euglenid air tawar (Euglenales). Di
antara anggota keluarga Euglenaceae, Monomorphina aenigmatica11 diidentifikasi mengandung genom
terkecil (74.746 bp) dan jumlah intron terkecil (53 + 1 ORF tidak dikenal). Sekuensing perwakilan
pertama dari keluarga Phacaceae - Phacus orbicularis20 mengungkapkan bahwa genom pt-nya (66, 418
bp) lebih kecil daripada genom Euglenaceae yang dikenal dan ukurannya sebanding dengan genom pt
Eutreptiella gymnastica. Semua strain yang diurutkan dalam penelitian ini memiliki genom pt yang relatif
kecil (di bawah 91 Kb) (Gambar 1, Tabel 1, Tabel Tambahan 1) dan genom P. inflexus pt (~ 58 Kb)
diidentifikasi sebagai genom pt Euglenophyceae terkecil yang diurutkan. sampai saat ini, bahkan lebih
kecil dari genom Eutreptiella gymnastica. Itu mungkin menunjukkan bahwa genom pt P. inflexus
mengalami pengurangan, yang dapat dijelaskan dengan hilangnya mat2 dan mat5 dan selanjutnya
jumlah intron yang lebih kecil, bersama dengan panjang gen rata-rata yang rendah (531 bp) (Tabel 1),
lebih rendah daripada Eutreptia viridis (587 bp).

Analisis filogenomik.

Sebelum membandingkan konten gen dan organisasi gen dari genom yang diperiksa, di sini kami
menyajikan konteks filogenetik yang diperlukan untuk menafsirkan hasil tersebut. Analisis filogenomik
kloroplas kami dilakukan dengan menggunakan set data asam amino dan nukleotida yang mencakup
perwakilan semua genera Euglenophyta (total 23 taksa). Kumpulan data asam amino dihasilkan
menggunakan 57 gen penyandi protein (11.499 situs), sedangkan set data nukleotida mengandung dua
gen rRNA (3.959 situs). Pohon filogenetik yang diperoleh (Gambar 2) mengkonfirmasi hubungan saudara
perempuan Phacaceae dan Euglenaceae15,23,33. Hubungan yang disimpulkan di antara genera
Euglenaceae tidak didukung dengan baik, dan hanya mereka di antara taksa terkait erat sesuai dengan
analisis multigene pada gen yang dikodekan nuklir14,15. Sebaliknya hubungan antara spesies Phacaceae
diselesaikan dengan baik dan sangat didukung. Phacus dan Lepocinclis membentuk clades bersaudara
dengan Discoplastis yang diwakili oleh D. spathirhyncha yang bercabang lebih dulu. Topologi itu
sebelumnya dipulihkan dalam analisis filogenetik berdasarkan gen yang dikode-nuklir14,15.

Ada / tidaknya IR.

Perbedaan struktural yang paling menonjol yang diamati antara genom pt yang dianalisis adalah ada /
tidaknya daerah pengulangan terbalik (IR) yang menyandikan operon rRNA. Dua salinan IR identik yang
mengandung semua lima gen (5S, 16S, 23S, trnI, trnA) yang membentuk operon rRNA standar terdapat
dalam gen pt Discoplastis, dan semua dianalisis Lepocinclis (kecuali gen 5S di L. playfairiana, L. ovum,
dan L. steinii) tetapi tidak ada rom perwakilan Phacus. Kumpulan awal genom plastid dari Discoplastis
dan Lepocinclis tidak diedarkan dan contigs yang dihasilkan berbeda dalam cakupan, menunjukkan
duplikasi. Contigs bergabung melalui reaksi PCR dan reaksi PCR tambahan digunakan untuk memperluas
genom pt ke urutan genomik yang dilaporkan. Perakitan yang dihasilkan menegaskan bahwa sirkulasi
tidak mungkin karena adanya pengulangan terbalik dari operon ribosom. Susunan genom plastid dalam
Discoplastis dan Lepocinclis sangat mirip, IR dipisahkan oleh SSC yang sangat pendek, yang tidak
mengandung gen apa pun, hanya pengulangan tandem. Genom plastid tanaman darat dan ganggang
hijau sering mengandung dua salinan IR yang mengkode rRNA operon34, di antaranya adalah
Pyramimonas, ganggang prasinofit yang paling erat kaitannya dengan leluhur plastid
Euglenophyta12,35. Di antara genom pt euglenid yang sebelumnya diurutkan, susunan quadripartit
adalah tidak diperlihatkan untuk Euglenaceae, Phacus orbicularis, dan Eutreptia viridis (Eutreptiales).
Hanya operon dari dua spesies Eutreptiales, Eutreptiella gymnastica12, dan Etl. pomquetensis18,
menyerupai operon dan orientasi untai mereka di prasinofit18, 35,36, sedangkan salah satu salinan
paling mungkin hilang selama divergensi Euglenales. Meskipun semua genom pt yang dikenal dari
Euglenales kekurangan satu salinan IR, pada E. gracilis dan Stromobomonas acuminata37 mereka telah
terbukti mengandung salinan berulang yang berulang dari operasi rRNA16,38. Dengan memetakan ada /
tidaknya IR pada pohon filogenomik yang diperoleh, kami merekonstruksi kejadian yang paling mungkin
dalam evolusi IR di Euglenophyta (Gbr. 2). Hasil kami menunjukkan bahwa daerah IR kemungkinan besar
hilang tiga kali selama evolusi Euglenophyta (jika kita mengasumsikan bahwa genom plastid yang
diperoleh dari ganggang prasinofit dicirikan oleh susunan quadripartit khas genom plastid). Kehilangan
pertama yang mungkin terjadi pada genus Eutreptia, namun kita harus memperhitungkan bahwa hanya
satu perwakilan dari genus yang dianalisis dan urutannya tidak lengkap17. Kehilangan kedua terjadi
selama evolusi genus Phacus, karena tidak satu pun dari tiga spesies yang dianalisis membawa dua
salinan IR. Akhirnya, kerugian ketiga paling mungkin muncul pada nenek moyang yang sama dari semua
taksa milik keluarga Euglenaceae, yang tidak memiliki susunan quadripartit dari genom plastid. Skenario
itu lebih mungkin daripada menciptakan IR de novo dari genome plastid IR-kurang39. Namun, beberapa
genom pt Euglenaceae tidak lengkap, dan jumlah kehilangan mungkin meningkat dengan selesainya
genom tersebut. Secara khusus, genom pt dari Colacium vesiculosum dan Strombomonas acuminata
memiliki ciri-ciri sisa yang mungkin dari IR; mereka memiliki potongan tambahan 16S rRNA atau 23S
rRNA, masing-masing37. Genom plastid dari hampir semua tanaman darat dan ganggang membawa dua
salinan identik dari sekuens IR besar40. Telah ditunjukkan bahwa laju substitusi beberapa kali lebih
rendah untuk IR relatif terhadap daerah salinan tunggal (SC) di antara beberapa angiospermae41 yang
menunjukkan dampak utama IR pada laju evolusi urutan plastome. Omnipresensi struktur quadripartit
dari genom plastid menunjukkan peran penting, namun kehilangan daerah IR, meskipun jarang,
diketahui dari tanaman darat42 dan beberapa garis keturunan ganggang hijau, seperti
prasinophyceans43, trebouxiophyceans40, dan streptophytes44. Mekanisme molekuler yang mendasari
peristiwa ini masih belum jelas, meskipun beberapa hipotesis telah diajukan berdasarkan penelitian
pada tanaman dan ganggang hijau39. Ini mungkin merupakan konsekuensi dari peristiwa berulang
kontraksi IR, eksisi lengkap dari salah satu urutan IR atau melalui eliminasi diferensial dari urutan gen
dari satu salinan IR. Di antara genom plastid Phacaceae, kami tidak mengamati jenis peralihan salinan IR,
yang mungkin menyarankan hilangnya langkah-langkah salah satu IR. Sebaliknya, dalam Dll. gymnastica
dua salinan IR berbeda, yang mungkin mengindikasikan bahwa salah satunya sedang dalam perjalanan
akan hilang12. Lebih banyak sekuens genom plastid dari garis silsilah awal Euglenophyta yang bercabang
diperlukan untuk mendukung salah satu hipotesis yang disebutkan di atas.
Kesimpulan

Terlepas dari kenyataan bahwa banyak genom Euglenaceae pt telah dikarakterisasi baru-baru ini, secara
mengejutkan sedikit yang diketahui tentang genom plastid dari famili kembarnya Phacaceae. Untuk
mengisi celah ini, kami telah mengurutkan genom plastid dari delapan taksa dari ketiga genera yang
diklasifikasikan dalam Phacaceae. Konten gen sangat dilestarikan dalam keluarga, dan perbedaan utama
terkait dengan ada / tidaknya maturasi mat2 dan mat5. Gen disusun menjadi tujuh kelompok, dan
urutannya dilestarikan dalam genera. Tidak ada pola bilangan intron hadir di Phacaceae, meskipun kami
mengkonfirmasi korelasi antara jumlah maturasi dan jumlah intron. Kami juga mengkonfirmasi bahwa
twintron yang hadir dalam gen psbF dan psbD dalam E. gracilis16 adalah unik untuk spesies itu dan
bahwa twintron dalam psbC berasal dari leluhur. Namun, kami menolak gagasan twintron dalam petB
sebagai sinapomorfi untuk semua Euglenophyta, karena itu tidak ada di beberapa Phacaceae. Penelitian
kami menyoroti sifat genom plastid Euglenophyta yang sangat dinamis, khususnya berkaitan dengan
sekuens IR besar yang mengalami kehilangan berulang, paling mungkin setidaknya sekali dalam
Phacaceae, satu kali sebelum bercabang dari Euglenaceae dan sekali dalam genus Eutreptia . Penting
untuk menganalisis taksa tambahan dari garis keturunan basal, seperti Eutreptiales dan Rapaza, untuk
sepenuhnya memahami sejarah dinamis genom plastid di Euglenophyta dan menguraikan mekanisme
yang mendasari hilangnya IR yang diamati.

Bahan dan Metode Pembiakan,

pengurutan, dan anotasi. Delapan budaya berikut digunakan dalam penelitian ini: Discoplastis
spathirhyncha, SAG 1224-42 (Fikologi Eksperimental dan Koleksi Budaya Alga di University of Göttingen
(EPSAG), Jerman); Lepocinclis ovum, SAG 1244-8; Lepocinclis playfairiana, MI102 (strain diisolasi di
Michigan State University); Lepocinclis steinii, UTEX 523 (Koleksi Budaya Alga di The University of Texas
di Austin, AS); Lepocinclis tripteris, UTEX 1331; Lepocinclis tripteris, (MI101); Phacus inflexus, ACOI 1336
(Coimbra Collection of Algae, Portugal); Phacus pleuronectes SAG 1261-3b. Budaya dipelihara seperti
dijelaskan dalam21. Sel Lepocinclis playfairiana dan L. tripteris (MI) diidentifikasi dalam sampel lapangan
yang dikumpulkan dari daerah East Lansing, MI, USA dan dikultur dengan cara berikut: sel tunggal
diambil dari sampel lapangan menggunakan pipet Pasteur steril di bawah Leica MZ16 mikroskop
pembedah (Leica Microsystems, Wetzlar, Jerman) dan ditransfer melalui serangkaian tetes media
pertumbuhan steril, dimodifikasi AF-6 medium51 dengan 150 mL L − 1 dari Media Air Tanah (Perusahaan
Pemasok Biologi Carolina, Burlington, NC, USA) , untuk memastikan keberadaan hanya satu sel. Sel-sel
yang terisolasi kemudian ditempatkan ke dalam satu sumur dari pelat 96-sumur mengandung media
pertumbuhan steril, satu sel per sumur, dan dibiarkan membelah selama ~ 2 minggu. Setelah ini, isi
sumur dipindahkan ke tabung kultur 12 mL yang berisi media pertumbuhan steril dan dibiarkan tumbuh
selama ~ 2 minggu. Akhirnya, tabung kultur dirampas dan dilihat dengan mikroskop Zeiss Axioscope 2
plus (Carl Zeiss Ing., Hallbergmoos, Jerman) untuk memastikan bahwa mereka uni-alga dan
memverifikasi identitas budaya. Kedua budaya ini juga dipertahankan seperti yang dijelaskan
sebelumnya21.