Minat Bersaing: ​Penulis telah menyatakan bahwa tidak ada
minat bersaing.
AKSES TERBUKA
Kutipan: ​Singleton J, Osborn JL, Lillis L, Hawkins K, Guelig
D, dkk. (2014) Amplifikasi dan Deteksi Bebas Listrik untuk
Diagnosis Titik Perawatan Molekuler HIV-1. PLoS ONE 9
(11): e113693. doi: 10.1371 / journal.pone.0113693
Editor: ​William R. Abrams, New York University, Amerika
Serikat
Menerima: ​17 Maret 2014
Diterima: ​28 Oktober 2014
Diterbitkan: ​26 November 2014
Hak cipta: ​© ​2014 Singleton et al. Ini adalah artikel akses
terbuka yang didistribusikan di bawah ketentuan ​Lisensi
Atribusi Creative Commons​, yang memungkinkan
penggunaan, distribusi, dan reproduksi tanpa batas dalam
media apa pun, asalkan penulis dan sumber aslinya
dikreditkan.
Pendanaan: ​Pendanaan disediakan oleh NIH (R01
EB012641) (NIAID R01AI097038); ​http://nih.gov/​. Para
penyandang dana tidak memiliki peran dalam desain studi,
pengumpulan dan analisis data, keputusan untuk
menerbitkan, atau persiapan naskah.
Dalam rangkaian terbatas sumber daya,
kurangnya pengujian diagnostik molekuler
yang terdesentralisasi dan akses yang jarang
ke fasilitas medis yang terpusat dapat
menghadirkan penghalang penting untuk
diagnosis, pengobatan, dan kontrol
selanjutnya serta penghapusan penyakit
menular. Metode amplifikasi asam nukleat
isotermal, termasuk reverse
transcription-mediated isothermal
amplification (RT-LAMP), sangat cocok untuk
pengujian molekuler titik perawatan
terdesentralisasi di laboratorium infrastruktur
minimal karena mereka secara signifikan
mengurangi kompleksitas peralatan dan
kebutuhan daya. Meskipun kompleksitas
berkurang, namun masih ada kebutuhan
untuk sumber panas yang konstan untuk
memungkinkan amplifikasi asam nukleat
isotermal. Persyaratan ini menimbulkan
tantangan signifikan bagi laboratorium di
negara berkembang di mana listrik seringkali
tidak dapat diandalkan atau tidak tersedia.
Untuk mengatasi kebutuhan ini, kami
sebelumnya mengembangkan pemanas,
listrik bebas biaya rendah menggunakan
reaksi eksotermik yang digabungkan dengan
bahan perubahan fasa. Pemanas ini
mencapai kinerja yang dapat diterima, tetapi
menunjukkan variabilitas yang cukup besar.
Selain itu, sebagai teknologi yang
memungkinkan, pemanas adalah solusi
diagnostik yang tidak lengkap. Di sini kami
menggambarkan desain pemanas yang lebih
tepat, terjangkau, dan kuat dengan deviasi
standar termal ​,​0,5​ ̊C pada suhu operasi,
biaya sekitar US $ 0,06 per tes untuk bahan
reaksi pemanas, dan rentang operasi suhu
sekitar dari 16​ ̊C hingga 30​ ̊C. Kami juga
memasangkan pemanas dengan deteksi
aliran lateral nucleic acid (NALF) untuk
pembacaan visual. Untuk menggambarkan
lebih lanjut utilitas dari pemanas bebas listrik positif ß-aktin dari sampel yang diproses
dan platform deteksi NALF, kami untuk menghasilkan dalam waktu kurang dari
menunjukkan deteksi HIV-1 yang sensitif dan 80 menit. Bersama-sama, elemen-elemen ini
berulang dengan kontrol amplifikasi internal

PLOS ONE | DOI: 10.1371 / journal.pone.0113693 26 November 2014

Amplifikasi dan Deteksi Bebas Listrik

1/19 ARTIKEL PENELITIAN ​

untuk Molekul di Tempat Perawatan Diagnosis

HIV-1
Jered Singleton​1​, Jennifer L. Osborn​1​, Lorraine Lillis​1​, Kenneth Hawkins​1​, Dylan Guelig​1​, Harga
Will​2​, Rachel Johns​1¤​, Kelly Ebels​1​, David Boyle​1​, Bernhard Weigl​1​, Paul LaBarre​1​*

1. ​PATH, Seattle, Washington, Amerika Serikat, ​2. ​Oregon Health and Science University School of Medicine, Portland, Oregon,
Amerika Serikat

*​plabarre@path.org

¤ Alamat saat ini: Avidity NanoMedicines, LLC, La Jolla, California, Amerika Serikat

Abstrak
Diagnosis Molekuler Bebas Listrik dari HIV-1

adalah blok bangunan untuk platform bebas listrik yang mampu memperkuat isotermal dan
mendeteksi berbagai patogen.

Pendahuluan ​Tes amplifikasi asam nukleat (NAAT) sangat efektif untuk mendiagnosis penyakit
menular yang memengaruhi kesehatan global. Namun, penggunaannya dalam pengaturan sumber
daya rendah (LRS) telah sangat terbatas sebagian karena persyaratan untuk instrumentasi yang
kompleks. Sebagian besar NAAT yang tersedia secara komersial membutuhkan listrik yang dapat
diandalkan, peralatan mahal, penyimpanan dingin untuk reagen, lingkungan yang dikontrol suhu, dan
teknisi yang sangat terlatih. Sebagian besar laboratorium berkemampuan NAAT di LRS berlokasi di
daerah perkotaan dan melayani orang kaya atau digunakan untuk penyaringan throughput tinggi
spesimen yang dikirim dari daerah lain. Pengiriman spesimen dan simpanan laboratorium dapat
menunda pelaporan hasil tes tepat waktu kembali ke klinik dan meningkatkan mangkir [​1​-​5​].
Sebaliknya, fasilitas perawatan kesehatan pedesaan memungkinkan hasil yang lebih cepat tetapi
umumnya hanya memiliki peralatan dasar [​6​]. Petugas kesehatan di rangkaian ini memiliki pelatihan
terbatas dan tidak dapat memelihara peralatan dan andal menangani reagen. Tenaga listrik utama, jika
tersedia, seringkali tidak dapat diandalkan [​7​]. Meskipun beberapa upaya untuk mengembangkan
NAAT portabel, berbiaya rendah, dan disederhanakan yang dapat digunakan dalam LRS, beberapa
tersedia secara komersial dan tidak ada yang digunakan secara luas [​8​].
Metode NAAT yang paling umum digunakan, reaksi rantai polimerase (PCR), tidak ideal untuk LRS
menggunakan peralatan saat ini yang tersedia secara komersial. Diagnostik berbasis PCR tradisional
memerlukan thermocycler, laboratorium yang bersih, listrik yang andal, penyimpanan dingin untuk
reagen, lingkungan yang dikontrol suhu, ketentuan untuk penahanan amplicon, dan personel terlatih.
Banyak mesin PCR dikendalikan melalui komputer, yang meningkatkan biaya pembelian.
Baru-baru ini, telah ada perkembangan yang signifikan dalam metode amplifikasi isotermal yang
tidak memerlukan thermocycling [​9​-​13​]. Di antara ini, loop-mediated isothermal amplification
(LAMP) adalah salah satu metode yang paling banyak dipublikasikan [​14​]. Pencarian database
ISI-Web of Knowledge menggunakan istilah pencarian 'LAMP' dan 'loop mediated amplification'
menghasilkan 1.230 publikasi sejak deskripsi pertama metode ini pada tahun 2000. LAMP dapat
digunakan untuk amplifikasi DNA, dan ketika membalikkan Langkah transkripsi disertakan, LAMP
juga dapat diperkuat dari RNA [​15​]. LAMP cukup sensitif untuk penggunaan klinis [​16​] dan jauh
lebih rentan terhadap inhibitor daripada PCR [​17​]. Amplifikasi terjadi pada satu suhu konstan,
biasanya dalam kisaran antara 58​ C ̊ dan 65​ C
̊ [​9​, ​18​]. Pengaturan relatif sederhana, dan deteksi
kekeruhan atau fluoresensi langsung dimungkinkan, [​17​] meskipun skema deteksi mata-telanjang
lainnya seperti visualisasi pada strip imunokromatografi juga telah dievaluasi [​19​]. Selanjutnya,
langkah persiapan sampel kompleks yang diperlukan untuk PCR dapat disederhanakan atau
dihilangkan dengan LAMP [​20​]. Beberapa tes LAMP telah dikomersialkan,

PLOS ONE | DOI: 10.1371 / journal.pone.0113693 26 November 2014

2/19 Diagnosis Molekul Bebas Listrik untuk HIV-1

[​16​, ​21​] dan uji LAMP untuk tuberkulosis, malaria, dan HIV telah dikembangkan [​20​, ​22​-​25​] .
Ada beberapa alasan mengapa LAMP berdampak kecil pada diagnostik yang dirancang untuk LRS.
Terutama, NAAT berbasis LAMP masih membutuhkan listrik untuk mencapai suhu amplifikasi
(dengan instrumen, blok panas, atau penangas air). Kedua, amplifikasi nonspesifik [​20​, ​26​-​29​] telah
menjadi tantangan untuk menguji perkembangan, dan baru-baru ini diatasi melalui strategi deteksi
spesifik urutan [​20​, ​30​]. Untuk kemajuan lebih lanjut kegunaan LAMP dan teknologi isotermal
lainnya untuk LRS, penelitian ini dibangun berdasarkan data yang sebelumnya diterbitkan
laboratorium​[31​-​34]​dan mendukung pengembangan lanjutan dari sebuah platform mandiri listrik
gratis yang alamat keterbatasan ini.
Jutaan nyawa dan tahun-tahun kehidupan yang disesuaikan dengan disabilitas hilang karena
keterlambatan dalam diagnosis malaria, HIV, TBC (TB), influenza, dan penyakit menular lainnya
yang tepat waktu secara tepat waktu [​7​]. Sementara desain kami berbasis platform dan karena itu
patogen-agnostik, kami memilih untuk mendemonstrasikan amplifikasi molekuler bebas listrik dan
sistem deteksi visual menggunakan deteksi HIV-1 sebagai analit model. Saat ini, tidak ada tes
molekuler point-of-care (POC) untuk HIV-1 yang ada di LRS, di mana deteksi infeksi akut akan
berdampak signifikan di daerah dengan beban penyakit tinggi. Identifikasi awal dan pengobatan
orang yang terinfeksi dapat menurunkan tingkat penularan HIV sejak akut individu infektif berada
pada risiko yang lebih tinggi menularkan virus​[35​-​37].​Lebih lanjut, tes HIV-1 dapat digunakan untuk
diagnosis bayi usia dini POC, menggantikan pengujian pusat rujukan konvensional, yang telah
menunjukkan keterlambatan yang signifikan dalam pelaporan hasil dan mangkir [​38​]. Elemen
eksperimental yang telah diintegrasikan dan diuji di sini dimaksudkan untuk dikombinasikan dengan
teknologi persiapan sampel bebas listrik (dalam pengembangan) untuk memungkinkan hari yang
sama, pengujian kunjungan yang sama dan perawatan bayi untuk sangat meningkatkan hasil
kesehatan anak dan secara substansial mengurangi kehilangan untuk tindak lanjut [​39​, ​40​].
Sebelumnya, kami melaporkan pengembangan platform amplifikasi asam nukleat (NINA)
non-instrumented [​33​] dan kami mengusulkan alur kerja yang sesuai dengan LRS [​41​] untuk kit
bebas listrik. Sejak itu, kami telah mengembangkan desain dari tahap proof-of-concept ke prototipe
alpha yang dioptimalkan dan kuat dengan peningkatan signifikan dalam kinerja dan kegunaan [​42​].
Desain NINA yang ditingkatkan yang kami laporkan dalam penelitian ini membutuhkan langkah
aktivasi yang lebih sedikit, dan karenanya memberikan lebih sedikit peluang untuk kesalahan dan
variasi yang diperkenalkan pengguna. Memasukkan paduan besi magnesium (MgFe) ke dalam
teknologi diagnostik telah dilaporkan sebelumnya [​43​]. Dalam perangkat eksperimental yang
dijelaskan di sini, mengganti kalsium oksida dengan magnesium iron alloy (MgFe) untuk reaksi
eksotermik menawarkan beberapa keuntungan berbeda: (1) MgFe memiliki kepadatan energi yang
jauh lebih tinggi, mengurangi massa kantong bahan bakar dari 20 g menjadi 1 g; (2) MgFe tersedia
secara komersial dengan biaya yang sangat rendah (saat ini US $ 0,06 per tes) dengan variasi
batch-ke-batch yang sangat sedikit; dan (3) MgFe dapat digiling hingga kisaran ukuran partikel
tertentu untuk lebih mengontrol profil panas dari reaksi kimia. Perbaikan tambahan dalam prototipe
ini termasuk mengemas bahan bakar MgFe dalam membran hidrofilik, dapat disegel panas dan
mengandung reaktan cair dalam

PLOS ONE | DOI: 10.1371 / journal.pone.0113693 26 November 2014

3/19 Diagnosis Molecular Bebas Listrik dariHIV-1

wadah seal-fill-fill. Peningkatan desain ini sangat meningkatkan kemudahan penggunaan dengan
meminimalkan langkah-langkah pengguna dan menghilangkan pembersihan pemanas
pasca-amplifikasi yang diperlukan dengan desain sebelumnya. Desain yang disempurnakan juga
menggabungkan rumah isolasi vakum yang lebih kecil untuk mengurangi kehilangan panas dan
mengurangi ukuran keseluruhan pemanas. Akhirnya, kami memasukkan material perubahan fase
(PCM) yang ditingkatkan dengan panas laten yang sangat tinggi untuk memenuhi persyaratan termal
(​Tabel 1​) dari uji LAMP HIV-1. Untuk menunjukkan kekokohan desain pemanas yang ditingkatkan,
kami mengevaluasi kinerja termal pada rentang suhu sekitar yang mewakili kondisi LRS.
Selain menguji desain baru dan bahan pemanas alternatif, kami lebih lanjut menunjukkan kegunaan
platform dengan menggabungkan kontrol internal biplexed serta metode deteksi visual aliran lateral
nukleat (NALF) [​44​]. Tes multiplexed umumnya digunakan dalam PCR untuk mendeteksi kontrol
internal untuk mengkonfirmasi tidak adanya penghambatan. Namun, hanya sejumlah studi telah
meneliti LAMP multiplexing,​[45-47]​dan untuk pengetahuan kita, tak satu pun memiliki NALF
digunakan sebagai metode deteksi. Untuk menunjukkan kegunaan platform yang berkembang ini,
kami memasangkan teknologi dengan kaset deteksi NALF dan mengevaluasi kinerja komponen
gabungan menggunakan uji LAMP biplexed untuk mendeteksi HIV-1 dan kontrol internal ß-aktin.
Kinerja pengujian dalam sistem non-instrumen dibandingkan dengan pengujian paralel yang dinilai
secara real-time pada thermocyler, dengan sensitivitas, reproduktifitas, dan pengulangan pengujian
dievaluasi melalui analisis kurva leleh, deteksi NALF, dan elektroforesis gel agarosa reaksi produk.

Bahan dan Metode Pemanas isotermal bebas listrik ​Pemanas dirancang untuk
memanaskan campuran LAMP assay dalam tabung PCR 0,2 mL hingga suhu 61,5​ ̊C ​+ /​21,5​ ̊C
selama 60 menit. Termos yang tersedia secara komersial, berdinding ganda, berinsulasi vakum
(BS500BL003, Thermos, USA) yang ditunjukkan pada ​Gambar 1 ​digunakan untuk rumahan
perangkat karena daya tahan dan sifat insulasi. PCM, asam palmitat (27734-1KG, Sigma Aldrich,
USA), terkandung dalam cangkir yang dibuat dari aluminium paduan T-6061 yang sangat konduktif.
Untuk meningkatkan perpindahan panas, wol aluminium konduktif yang sangat panas dan konduktif
(7364T91, McMaster-Carr, USA) dipotong menjadi disk 50 mm dan ditempatkan di dalam cangkir
sebelum mengisi cangkir dengan PCM cair yang membeku pada suhu kamar.

Tabel 1. ​Spesifikasi tes transkripsi loop termediasi loop-mediated (RT-LAMP) tes HIV-1.

̊ ​¡​1,5​ C
Spesifikasi pengujian Nilai ​Suhu amplifikasi 61,5​ C ̊ Waktu amplifikasi 60 menitwaktu
Sampelpemanasan (ramp) ​,​2 menit

Sampel tabung 0,2 mL tabung PCR

doi: 10.1371 / journal.pone.0113693.t001

PLOS ONE | DOI: 10.1371 / journal.pone.0113693 26 November 2014

4/19 Gambar 1. Pemanas PATH NINA. ​(Kanan) Penampang menunjukkan komponen internal dari pemanas. Perkiraan dimensi
pemanas adalah 80 mm dengan tinggi 120 mm.

doi: 10.1371 / journal.pone.0113693.g001

Diagnosis Molekul Bebas Listrik dari HIV-1

Gelas yang diisi PCM kemudian diikat ke tutup dudukan tabung polimer yang disembuhkan UV
(RGD525, Stratasys, AS) dengan epoksi pengelasan JB (JB Weld) , AS). Tutup penahan tabung
dirancang agar sesuai dengan empat tabung PCR 0,2 mL (981005, Qiagen, USA). Di atas sumur
sampel adalah penutup yang terbuat dari busa polivinil-klorida (PVC) (9318K77, McMaster-Carr,
AS). Dudukan tabung tutup benang ke wadah terisolasi-vakum untuk mempertahankan reaksi
eksotermis. Insulasi busa menekan tutup untuk mencegah kehilangan panas melalui bagian atas
perangkat. Produk sampingan uap dan gas hidrogen dari reaksi eksotermik dibuang melalui
lubang-lubang kecil pada tutupnya untuk mencegah terbentuknya tekanan di dalam termos vakum.
Konfigurasi pemanas NINA ditunjukkan pada ​Gambar 1​. dirancang agar dapat digunakan kembali. ''
Kantung Bahan Bakar '' dan 5 mL dosis saline 0,9% yang dikemas dalam kartrid sekali pakai
(HCS20039Z, Medline, AS) adalah satu-satunya bahan habis pakai yang diperlukan untuk setiap
proses. Kantung bahan bakar terdiri dari 0,9 g bahan bakar MgFe (Innotech Products Ltd., USA) yang
disegel di dalam kantong hidrofilik yang dapat ditutup dengan panas yang dibuat dari serat rami
manila, selulosa, dan termoplastik (Kantong Teh Kosong yang Dapat Diisi, Kantong Teh Muslin,
AS). Reaksi eksotermik menghasilkan panas melalui oksidasi magnesium dalam air yang dipercepat
oleh korosi galvanik [​34​]. Setelah aktivasi, reaksi eksotermik terjadi di bagian bawah rumah termos
dan panas ditransfer ke PCM. Kantung bahan bakar yang diuji dalam penelitian ini direkayasa untuk
menghilangkan kebutuhan untuk menimbang bahan bakar sebelum setiap siklus pengujian dan untuk
memfasilitasi penghapusan residu produk eksotermik setelah digunakan [​33​].

Pengoperasian pemanas dan referensi ​Untuk mengaktifkan pemanas NINA, pengguna

menempatkan kantong bahan bakar MgFe di bagian bawah termos, melepaskan tutup yang disegel
dari kartrid seal-fill-seal, dan mengosongkan

PLOS ONE | DOI: 10.1371 / journal.pone.0113693 26 November 2014

Diagnosis Molekuler Bebas ListrikHIV-1

dari isi kartrid5(​+ /​5/19% salin20,2 mL) salin, ke kantong. Kartrid blow-fill-seal adalah reservoir
salin sekali pakai yang tersedia secara komersial dengan tutup gaya "twist-off". Bahan bakar MgFe
segera bereaksi dengan salin dan menghasilkan panas. Penahan tabung diikat ke termos dan tutupnya
ditempatkan di atas sampai suhu target tercapai. Setelah sekitar 12 menit, ketika pemanas telah
memanas hingga 61,5​ C ̊ ​+ /​21,5​ .5wadah​C, uji isotermal dalam 0,2 ml tabung PCR dapat
dimasukkan ke dalamtabung sampel. Pengujian uji awal menunjukkan hilangnya sensitivitas ketika
uji perlahan dipanaskan. Oleh karena itu, menambahkan tabung setelah langkah pra-pemanasan 12
menit lebih disukai untuk mencapai sensitivitas yang lebih tinggi dengan pengujian khusus ini (​Tabel
2​). Setelah 60 menit dalam kisaran suhu target, tabung dikeluarkan untuk pemrosesan hilir
menggunakan salah satu dari tiga metode, dijelaskan di bawah ini. Setelah uji coba, produk reaksi
eksotermal yang terkandung dalam kantong dibuang, sedangkan termos, insulasi, PCM, dan
pemegang tabung dapat digunakan berulang kali setelah periode pendinginan. Termos dibilas dengan
air untuk menghilangkan garam sisa dari dinding samping.

Pemantauan ​kinerja Kinerja panas pemanas NINA yang ditingkatkan dievaluasi menggunakan
dua termokopel tipe T dengan ​+ /​20,5​ precision​presisi C (5SRTC-TT-K-20-36, Teknik Omega,
AS) dan pencatat data (NI 9211 Instrumen Nasional, AMERIKA SERIKAT). Sebagai proksi dari
suhu reaksi aktual, satu termokopel dimasukkan melalui lubang berdiameter 1,27 mm di tutup tabung
PCR 0,2 mL. Tabung diisi dengan

Tabel 2. ​Rincian set primer yang digunakan untuk reverse transcription-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) termasuk
primer yang ditandai untuk deteksi lateral nucleic acid flow (NALF).

Urutan nama primer (5​9​–3​9​)

Primer untuk deteksi HIV-1

Integrase F3 GGT AAG AGA TCA GGC TGA ACA TC

Integrase B3 GCT GGT CCT TTC CAA AGT GG

Integrase BIP Biotin / AGT GCA GGG GAA AGA ATA GTA GAC CTG CTG TCC CTG TAA TAA
ACC C

Integase FIP CCC CAA TCC CCC CTT TTC GTA AGC AGT ACA AAT GGC A

Integase Loop B GCA ACA GAC ATA CAA ACT AAA G

Integrase Loop F FITC / TTA AAA TTG TGG ATG AAT

Primer untuk deteksi ​b​-aktin

b​-aktin B3 AGG CCA GGAGAG

b​AGG AGG-aktin F3 GGC ATC CTC ACC CTG AAG T

b​-aktin BIP Biotin / TG ​ACC GAG GCC CCC CTG AAC CAC CAG AAG AGG TAG CGG

b​-actin FIP DIG / TCC TCG GGA GCC ACA CGC AGC ATC GTC ACC AAC TGG GAC

b​-actin Simpul B CGC GAG AAG ATG ACC CAG G

b​-actin loop F GGT GCC AGA TTT TCT CCA TGT C

HIV dan ​b​-actin set primer yang dimodifikasi untuk aliran lateral deteksi dengan penambahan biotin, fluorescein isothiocyanate
(FITC), dan digoxigenin (DIG).

doi: 10.1371 / journal.pone.0113693.t002

PLOS ONE | DOI: 10.1371 / journal.pone.0113693 26 November 2014

6/19 Diagnosis Molekuler Bebas Air dari HIV-1

25 mL air deionisasi (DI) untuk meniru volume reaksi yang dimaksudkan dan termokopel terendam
dalam air DI di bagian bawah dari tabung. Termokopel kedua melekat pada bagian bawah cangkir
aluminium untuk memantau suhu reaksi eksotermik.

Menguji kisaran suhu pengoperasian sekitar ​Untuk menentukan kisaran suhu

pengoperasian sekitar, kinerja pemanas NINA dinilai pada suhu sekitar 12​ ̊C, 14​ ̊C, 16​ C,
̊ 30​ C,
̊ 3131
̊C,C, dan 32​ C
̊ di ruang lingkungan (BTl-433, ESPEC, USA). Tiga pemanas dengan sampel air proksi
DI, kantong bahan bakar, dan tabung salin yang telah dimasukkan ditempatkan di dalam ruang
selama empat jam untuk mengkondisikan material pada suhu uji. Reaksi pemanas kemudian
diaktifkan di dalam ruang lingkungan dan kinerja termal dipantau selama periode inkubasi satu jam.

Persiapan sampel ​Normal human plasma (NHP) yang mengandung virion HIV-1 (AcroMetrix
HIV-1 High Control, Applied Biosystems, USA) digunakan sebagai standar RNA HIV-1 untuk
menilai kinerja uji HIV-1 LAMP menggunakan pemanas NINA menggunakan pemanas NINA . Viral
RNA diekstraksi dari 200 mL NHP menggunakan mini kit viral RIA QIAamp (Qiagen Inc, USA)
sesuai dengan instruksi pabrik. RNA dielusi menjadi 60 mL air bebas RNase. Untuk tes yang
menggunakan uji b-aktin, total DNA / RNA diekstraksi dari 200 mL darah utuh menggunakan
DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen Inc, USA) dan dielusi menjadi 100 mL air bebas nuklease.
RNA disimpan pada 280​ ̊C sampai dibutuhkan. DNA / RNA dikuantifikasi menggunakan Nanodrop
2000 (Thermo Scientific, USA). Jumlah salinan virus ditentukan menggunakan jumlah virion yang
terdaftar dan faktor dilusi dengan asumsi efisiensi ekstraksi 100%. Menggunakan nomor salinan yang
dikuantifikasi, pengenceran serial disiapkan dalam air bebas RNase. Reaksi kontrol negatif
menggunakan volume RNA eluat yang sama yang diekstraksi dari NHP yang HIV-negatif.

Desain primer LAMP ​Primer menargetkan ​pol ​wilayah gen integraseseperti yang dijelaskan oleh
Hosaka ​et al. ​[​32​] digunakan untuk mendeteksi HIV-1 (​Tabel 2​) dengan dua primer dimodifikasi
dengan penambahan fluorescein isothiocyanate (FITC) atau biotin untuk memfasilitasi deteksi
melalui strip aliran lateral. Setelah menguji kombinasi yang berbeda dari loop primer dan primer yang
dimodifikasi, primer primer berlabel belakang BIT (BIT) berlabel FITC dan primer Loop F berlabel
biotin dipilih untuk uji HIV (​Tabel 2​). Sebagai kontrol amplifikasi internal, set primer untuk deteksi
mRNA b-aktin manusia dirancang menggunakan perangkat lunak Primer Explorer V4 untuk desain
primer LAMP (Eiken Chemical Co, Jepang) dengan b-actin BIP dan b-actin forward inner primer
(FIP ) masing-masing ditandai dengan biotin dan digoxigenin (DIG) (​Tabel 2​).

PLOS ONE | DOI: 10.1371 / journal.pone.0113693 26 November 2014

7/19 Diagnosis Molekuler Bebas Listrik dari HIV-1

Kondisi uji HIV RT-LAMP ​Amplifikasi dilakukan dalam 25 mL reaksi menggunakan tabung
PCR datar 0,2 mL individu (Qiagen, Jerman ). Setiap reaksi mengandung 2​6 ​Campuran Reaksi dari
LoopAmp DNA Amplification Kit (Eiken, Jepang), 0,2 mM intergrase F3, 0,2 mM intergrase B3, 1,6
mM intergrase BIP biotin, 1,6 mM intergrase FIP, 1,6 mM Intergrase Loop B, 1,6 mM Loop B, 1,6
mM Loop F FITC, 2U avian myeloblastosis virus (AMV) reverse transcriptase (New England
Biolabs, USA), dan fragmen besar DNA polimerase 16 U Bst (Eiken, Jepang). Untuk mendeteksi
amplifikasi DNA secara real-time, pewarna interkalatori SYTO-85 (Life Technologies, USA)
ditambahkan ke konsentrasi akhir 1 mM. RNA HIV pada konsentrasi akhir 19, 38, 75, dan 150
salinan / reaksi ditambahkan ke tabung reaksi sebelum penempatannya ke pemanas NINA. Kontrol
negatif RNA dari NHP yang tidak terinfeksi juga dimasukkan. Setiap pengenceran HIV, serta kontrol
negatif disaring dalam 21 reaksi ulangan. Untuk mencegah penguapan, 15 mL minyak mineral
ditambahkan ke bagian atas setiap reaksi sebelum inkubasi. Tabung reaksi ditambahkan ke pemanas
NINA setelah pemanasan selama 12 menit. Tes duplikat dijalankan secara paralel menggunakan
pemanas NINA serta sistem PCR Real-Time Stratagene MX3000P (selanjutnya, Stratagene:
Stratagene, AS - digantikan oleh Mx3000P QPRC dari Agilent Technologies, AS,
̊ selama 60 menit dan
www.genomics.agilent.com​) . Sampel Stratagene diamplifikasi pada 62​ C
dimonitor untuk amplifikasi DNA secara real-time melalui pewarna fluorescent interkalatori (SYTO
85, Molecular Probe, USA) setiap 60 detik.

Modifikasi untuk tes reverse-transcription loop mediated isothermal amplification

(RT-LAMP) untuk digunakan dalam pemanas isotermal ​Untuk menunjukkan amplifikasi
bebas listrik dan deteksi yang cocok untuk diagnosis POC, kami menggunakan NALF untuk deteksi
visual produk yang diperkuat. Untuk mencapai hal ini, dua primer di masing-masing target
dimodifikasi dengan label hapten untuk memungkinkan penangkapan melalui pengikatan antibodi
FITC dan deteksi visual selanjutnya dari amplikon yang ditangkap melalui streptavidin koloid emas.
Tes HIV LAMP dengan primer berlabel dan tidak berlabel dijalankan secara paralel dan kinerjanya
diukur secara waktu nyata. Label Hapten dari BIP dan LOOP F primer tidak berpengaruh pada
kinerja uji HIV. Lebih lanjut, primer berlabel memungkinkan deteksi amplikon LAMP HIV melalui
strip tes aliran lateral Milenia (Milenia Biotec Gieben, Jerman) (​Gambar 2​).

HIV dan ​b​LAMP biplexed-aktin ​Amplifikasidilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya

untuk uji HIV-1 kecuali bahwa primer untuk deteksi b-aktin dan HIV dimasukkan pada konsentrasi
berikut: 0,1 mM b-aktin B3, 0,1 mM b- aktin F3, 0,8 mM b-aktin BIP, 0,8 mM b-aktin FIP, 0,4 mM
b-aktin Loop B, 0,4 mM b-aktin Loop F, 0,1 mM F3, 0,1 mM B3, biotin BIP 0,8 mM, 0,8 mM FIP,
0,8 mM Loop B, 0,8 mM Loop F-

PLOS ONE | DOI: 10.1371 / journal.pone.0113693 26 November 2014

8/19 Diagnosis Molekul Bebas Listrik dari HIV-1
FITC. RNA ditambahkan ke setiap reaksi untuk memberikan konsentrasi akhir masing-masing 73,
145, 290, dan 580 salinan / reaksi. Dengan setiap set pengenceran, tiga ulangan dinilai di hadapan dan
tidak adanya 2,2 ng / mL DNA genom. Kontrol negatif juga dimasukkan. Minyak mineral dalam
alikuot 15 mL ditambahkan ke setiap tabung untuk mencegah penguapan selama inkubasi. Reaksi
dipanaskan di pemanas NINA bebas listrik dan mesin PCR waktu-nyata. Hasil positif dinilai sebagai
yang terdeteksi oleh NALF, dan hasilnya dikonfirmasi menggunakan analisis kurva meleleh dan
elektroforesis gel.

Penilaian amplikon LAMP. ​Kinerja pemanas NINA yang diukur dengan batas deteksi (LOD)
dibandingkan dengan thermocycler real-time Stratagene. Replika dari 21 sampel yang mengandung
19, 38, 75, dan 150 salinan / reaksi HIV RNA diamplifikasi menggunakan uji HIV-1 RT-LAMP pada
pemanas NINA dan thermocycler real-time Stratagene. Positif dinilai sebagai yang terdeteksi oleh
NALF, dengan hasil dikonfirmasi menggunakan analisis kurva meleleh dan elektroforesis gel (data
tidak ditampilkan). Selain itu, deteksi real-time juga dilakukan pada sampel yang diamplifikasi
menggunakan thermagycler real-time Stratagene (​Tabel 2​).
PLOS ONE | DOI: 10.1371 / journal.pone.0113693 26 November 2014 9/19
Gambar 2. Deteksi amplicon HIV LAMP melalui strip tes Milenia. ​(A) Milenia strip digunakan untuk mendeteksi fluorescein
isothiocyanate (FITC) / amplikon berlabel biotin. Gambar ke kanan menunjukkan hasil positif sedangkan gambar ke kiri adalah hasil
negatif. (B) Kaset terbaik untuk deteksi ganda FITC / biotin (uji HIV) dan digoxigenin (DIG) / biotin (​b-​ujiactin) berlabel amplikon.
Gambar menunjukkan hasil positif untuk amplikon FITC / biotin dan amplik DIG / biotin.

doi: 10.1371 / journal.pone.0113693.g002

Diagnosis Molekul Bebas Listrik dari HIV-1

Deteksi aliran lateral asam ​nukleus Deteksi amplikon berlabel dinilai menggunakan HybriDetect
dipsticks (Milenia Biotec Gieben, Jerman) untuk FITC / biotin amplicons, atau Kaset BioHelix
Express Strip (BESt) Tipe II (Biohelix, USA) untuk deteksi ganda FITC / biotin dan amplikon DIG /
biotin (​Gambar 3​). Sebelum memasukkan produk yang diamplifikasi ke strip deteksi, reaksi
RT-LAMP diakhiri dengan penambahan 1,5 mL EDTA (100 mM; Cellgro, USA) ke 13,5 mL reaksi.
Untuk strip Milenia, 5 mL reaksi dihentikan ditempatkan pada pad capture diikuti dengan
perendaman segera pad menjadi 100 mL 1​6 ​HybriDetect assay berjalan buffer. Hasil tes diberi skor
setelah 5 menit. Hasil positif ditunjukkan oleh garis uji dan kontrol yang terlihat, dan hasil negatif
hanya ditunjukkan oleh garis kontrol yang terlihat. Tes dianggap tidak valid jika garis kontrol atas
tidak berkembang. Untuk kaset BESt, 7,5 mL masing-masing reaksi dikeluarkan dari setiap tabung
untuk analisis kurva lebur. Tabung PCR yang mengandung reaksi yang tersisa kemudian ditempatkan
ke dalam kaset BESt. Kaset ditutup sesuai dengan petunjuk pabrikan dan tes diberi skor setelah 5
hingga 10 menit dengan hasil positif yang ditunjukkan oleh keberadaan pita pada pita untuk deteksi
FITC / biotin dan / atau deteksi DIG / biotin.

Analisis kurvaanalisis ​leleh SetelahNALF, sisa 7,5 mL dari setiap campuran reaksi yang diamplifikasi
dari thermocycler real-time Stratgene dan pemanas NINA dianalisis melalui analisis kurva leleh
untuk lebih jauh memastikan bahwa amplikon yang benar memiliki
PLOS ONE | DOI: 10.1371 / journal.pone.0113693 26 November 2014 10/19
Gambar 3. Rata-rata profil temperatur dari 74 berjalan dengan sembilan prototipe non-instrumented nucleic acid
amplification acid (NINA) heater. ​Baris kesalahan menunjukkan satu standar deviasi. Empat perangkat dikeluarkan dari pengujian
ketika mode kegagalan membuat mereka tidak lagi dapat mempertahankan suhu dalam spesifikasi. Data proses akhir tidak
termasuk dalam grafik. Berarti waktu antara kegagalan (MTBF) untuk perangkat yang gagal adalah 14 berjalan.

doi: 10.1371 / journal.pone.0113693.g003

Diagnosis Molekul Bebas Listrik dari HIV-1

telah dihasilkan dalam reaksi RT-LAMP. Sampel ditempatkan dalam sistem PCR Stratagene
MX3000P Real-Time dan dipanaskan dari 54​ ̊C hingga 94​ ̊C pada tingkat ramp 1​ ̊C / s. Data
fluoresensi dikumpulkan dan turunan pertama diplot terhadap suhu untuk menciptakan puncak unik
untuk setiap amplikon yang menunjukkan suhu lelehnya (​Tm​).diamati​Tm yang ​dibandingkan dengan​Tm

untukdiharapkan produk
​ amplikon yangsebagai pemeriksaan untuk spesifisitas reaksi amplifikasi.
Puncak yang tidak terduga atau banyak dianggap bukti amplifikasi dan / atau kontaminasi yang tidak
spesifik, dan reaksi yang dicurigai dianggap positif palsu jika hasil negatif diamati menggunakan
NALF.

Elektroforesis gel ​agarosa Setiap produk reaksi juga dianalisis pada gel agarosa 2% (Invitrogen, USA)
yang telah diwarnai dengan 1​6 ​SYBR Safe (Invitrogen, USA) gel dan dijalankan dalam1​6 ​buffer
berjalan TBEdan divisualisasikan di bawah sinar UV. A 1 Kb plus tangga (Invitrogen, USA)
dimasukkan sebagai penanda ukuran amplikon. Gel diperiksa untuk mengetahui adanya pola pita
yang menunjukkan karakteristik polidispersitas amplikon dari reaksi LAMP. Tidak adanya pola
karakteristik dianggap sebagai bukti amplifikasi non-spesifik, dan reaksi yang dicurigai dianggap
positif palsu jika hasil negatif diamati menggunakan NALF (Data tidak ditunjukkan).

Hasil Pengujian pemanas NINApengujian ​Untuklaboratorium, sembilan pemanas NINA

dievaluasi dengan total 74 putaran. Hasil menunjukkan kontrol suhu yang sangat presisi dengan satu
̊ dan 62​ C
standar deviasi antara 60​ C ̊ selama satu jam penuh untuk perangkat yang tidak mengalami
kerusakan mekanis (​Gambar 3​).
Sebagai bagian dari evaluasi, setiap pemanas NINA dijalankan beberapa kali. Proses ini dicatat dan
sebuah perangkat dihapus dari evaluasi lebih lanjut jika, setelah beberapa kali proses yang berhasil,
tiba-tiba gagal berfungsi dengan61,5​ spesifikasi̊C ​+ /​21,5​ ̊C yang diperlukan. Investigasi
kemudian dilakukan untuk menentukan mode kegagalan yang menyebabkan kondisi di luar
spesifikasi. Dari sembilan prototipe identik yang dibuat dan digunakan dalam pengujian pengujian,
empat gagal mempertahankan suhu untuk waktu yang ditentukan setelah penggunaan berulang
(waktu rata-rata untuk kegagalan adalah 14,25 kali berjalan, kisaran 5 sampai 29 kali berjalan).
Penyebab paling umum dari kegagalan spesifikasi ini adalah kegagalan ikatan epoksi antara wadah
dan tutup PCM.
Untuk mengevaluasi rentang operasi suhu sekitar, kami mengukur suhu sampel tabung di dalam
pemanas NINA yang dikondisikan dari waktu nol. Hasil pada ​Gambar 4 ​menunjukkan kisaran suhu
̊ dan 30​ C.
sekitar yang dapat diterima secara operasional untuk pemanas NINA antara 16​ C ̊

PLOS ONE | DOI:10.1371/journal.pone.0113693 November 26, 2014 11 / 19

Figure 4. Three non-instrumented nucleic acid amplification (NINA) heaters were conditioned in an environmental chamber,
̊ 14​ ̊C, 16​ C,
and the performance of each heater was determined at multiple temperatures (12​ C, ̊ 30​ ̊C, 31​ C,
̊ and 32​ ̊C).
Averages are shown. The green lines show averages that were within the specification of 61.5​ ̊C ​+​/​2​1.5​ C.
̊ The red lines show runs
that over-heated, and the blue lines show runs that fell below the test specifications.

doi:10.1371/journal.pone.0113693.g004

Table 3. ​A comparison of the effects on the limit of detection (LOD) of assays heated by the non-instrumented nucleic acid
amplification (NINA) heater.

No oil/ramp Oil/ramp No oil/no ramp Oil/no ramp

150 copies/reaction ​3/3 3/3 3/3 3/3

75 copies/reaction ​1/3 2/3 3/3 3/3

38 copies/reaction ​0/3 0/3 1/3 3/3

19 copies/reaction ​0/3 0/3 2/3 2/3

Negative control ​0/3 0/3 0/3 0/3

Combination of assays run with and without warm-up ramp and with or without oil are evaluated. Table entries show the number of
replicates that returned a positive result as the numerator of a fraction showing the total number of replicates run in the denominator.

doi:10.1371/journal.pone.0113693.t003
Electricity-Free Molecular Diagnosis of HIV-1

Preliminary testing with the LAMP assay ​Preliminary testing and analysis was performed to
determine the effects of placing the assay tube in the heater before the heater achieved the targeted
incubation temperature. A series of HIV LAMP assays challenged with 150, 75, 38, and 17 copies of
HIV RNA were prepared in triplicate in addition to negative controls. We measured test performance
using melt curve analysis of completed assays, in addition to lateral flow detection and gel
electrophoresis. Results are shown in ​Table 3​. Introducing the test reactions into the heater prior to
the warm-up had a negative effect on sensitivity with the LOD being 150 HIV-1 copies/reaction as
compared to 38 HIV-1 copies/reaction if the reactions were added after 12 minutes (​Table 3​). The
addition of mineral oil was found to have no negative effect on assay performance with 3/3 replicates
producing positive results at 38 HIV-1 copies/reaction compared with 2/3 replicates for assays run
without the
PLOS ONE | DOI:10.1371/journal.pone.0113693 November 26, 2014 12 / 19
addition of oil. Neither the warm-up ramp nor mineral oil affected specificity as all human plasma
controls in the preliminary testing were negative.

Evaluation of LAMP reactions performed in the NINA heater ​We compared assay
performance of the electricity-free NINA heater and NALF detection systems to using a real-time
PCR machine. Results using either heater were very similar, with an LOD of 75 copies/reaction or
8,333 viral copies/mL of extracted plasma observed for both incubation methods (​Table 4​). Melt
curve analysis of each reaction further confirmed the amplification of the correct products with
average melting temperature of ​,​78​ ̊C observed for all positive reactions across the dilution series in
both the NINA heater and the real-time thermocycler.

Biplexed LAMP performance in the NINA heater ​Initial tests with 2.2 ng/reaction of
genomic DNA and RNA containing b-actin mRNA in the b-actin LAMP assay confirmed rapid
detection of b-actin RNA using both real-time analysis and NALF detection. Similar results were
observed when using both NINA and Stratagene heating (​Table 5​). Amplification of human b-actin
was observed in every reaction. Melt curve analysis indicated that the amplicons of the HIV-1 LAMP
assay and the b-actin assay produced unique peaks at 78​ ̊C and 89​ ̊C, respectively (​Figure 5​). The
presence and absence of a peak generally mirrored the results observed with NALF detection, but the
inclusion of the b-actin primer set was found to decrease the sensitivity of HIV-1 detection (​Table 5​).

Discussion ​While other electricity-free heaters have been proposed, [​43​, ​48​, ​49​] these designs have
relied heavily on the use of passive cooling strategies, and their performance has not been
demonstrated outside a narrow range of standard laboratory temperatures. In this study, we
demonstrate the performance of an improved
Table 4. ​An evaluation of the non-instrumented nucleic acid amplification (NINA) heaters as compared to a real-time PCR
thermocycler by measuring the performance of the HIV LAMP assay with a range of HIV RNA target concentrations.

NINA incubator Thermocycler

150 copies/reaction ​21/21 21/21

75 copies/reaction ​21/21 20/21

38 copies/reaction ​18/21 16/21

19 copies/reaction ​17/21 13/21

Negative control ​0/21 0/21

All results were confirmed by NALF, agarose gel electrophoresis, and melt curve analysis. Table entries show the number of
replicates that returned a positive result as the numerator of a fraction showing the total number of replicates run in the denominator.

doi:10.1371/journal.pone.0113693.t004
Electricity-Free Molecular Diagnosis of HIV-1
PLOS ONE | DOI:10.1371/journal.pone.0113693 November 26, 2014 13 / 19
Table 5. ​Results for normal human plasma (NHP) containing HIV-1 RNA diluted to 580, 290, 145, 73, and 0 (negative control) total
copies in a 25 ​m​l reaction.

Strategene Heater device

Sample HIV-1 positive/total ​b​-actin positive/total HIV-1 positive/total ​b​-actin positive/total

580 copies HIV-1​+ b​-actin ​3/3 (100%) 3/3 (100%) 3/3 (100%) 3/3 (100%)

290 copies HIV-1​+ b​-actin ​3/3 (100%) 3/3 (100%) 2/3 (100%) 3/3 (100%)

145 copies HIV-1​+ b​-actin ​2/3 (100%) 3/3 (100%) 1/3 (100%) 3/3 (100%)

73 copies HIV-1​+ b​-actin ​1/3 (33%) 3/3 (100%) 0/3 (0%) 3/3 (100%)

Negative control ​0/3 (0%) 0/3 (0%) 0/3 (0%) 0/3 (100%)

b​-actin positive control ​0/3 (0%) 3/3 (100%) 0/3 (0%) 3/3 (100%)

HIV-1 positive control (580 copies) ​3/3 (100%) 0/3 (0%) 3/3 (100%) 0/3 (0%)

Extracted genomic nucleic acid at 2.2 ng/​m​L was in all samples except the negative control and HIV-positive control. In this
comparison, samples and controls assayed by the non-instrumented nucleic acid amplification (NINA)/nucleic acid lateral flow
(NALF) system and the Stratagene system were aliquoted from the same sample extraction and handled identically up to
amplification. Since the NINA heater does not have top-heating, oil was added to these samples for amplification to control for any
condensation artifacts. The samples in the top-heated Stratagene were amplified as per the manufacturer's instructions (no mineral
oil) to reflect a standardized reference method.

doi:10.1371/journal.pone.0113693.t005
Electricity-Free Molecular Diagnosis of HIV-1

electricity-free heater over a wide temperature range (16​ ̊C to 30​ ̊C) that can be expected in the
low-resource settings where we seek to deploy molecular-based diagnostics. However, the
electricity-free heater is only an enabling technology, not a complete solution. Thus, to further
demonstrate the potential for diagnosis based on electricity-free nucleic acid amplification, we have
paired the NINA heater with other complementary, instrument-free technologies, such as NALF, to
demonstrate enabling technology compatibility toward building a completely
infrastructure-independent system. To illustrate the utility of the electricity-free NINA heater and
NALF detection platform, we demonstrate sensitive and repeatable detection of HIV-1 and ß-actin
from an extracted sample to result in less than 80 minutes.
One remaining need, not addressed by the research presented here, is the development of an
appropriate sample preparation method. Current methods are generally costly and require dedicated
equipment and reagents as well as skilled technicians. A key advantage of LAMP is its tolerance to
many confounders, including whole blood products, [​50​] which indicates that more crude sample
preparation methods than those required for PCR could be used. Successful detection of the target
amplicon has been demonstrated by adding whole blood directly to LAMP assays, thus eliminating
the need for any sample preparation [​20​]. A complete electricity-free NAAT-based diagnostic
solution will probably require incorporation of shear-based lysis techniques, [​51​, ​52​] the filtering and
concentrating gained by FTA cards, [​53​] an electricity-free centrifuge, [​54​, ​55​] or a simplified
chaotroic salt extraction methodology that requires no centrifuge [​56​]. Inclusion of an endogenous
control primer set decreased sensitivity for the HIV-1 target. Other studies have also noted decreased
single assay performance in biplexed LAMP reactions, with one study demonstrating a negative
effect on time to result [​47​]. In this study, since the b-actin mRNA and DNA were more concentrated
than the HIV-1 RNA, they may amplify more effectively and,

PLOS ONE | DOI:10.1371/journal.pone.0113693 November 26, 2014 14 / 19

Figure 5. Melt curve analysis of the HIV-1 and ​b​-actin biplex reverse transcription loop-mediated isothermal amplification
(RT-LAMP) assay. ​Melt analysis showed products specific to HIV-1 at 78 ̊C and ​b​-actin at 89 ̊C as seen in the singleplex assays.
Specificity was confirmed in the presence of normal human plasma (NHP) without HIV-1 or ​b​-actin (negative control) and showed no
amplification (n​5​3).

doi:10.1371/journal.pone.0113693.g005
Electricity-Free Molecular Diagnosis of HIV-1

therefore, restrict the HIV-1 assays' sensitivity by sequestering the limited reagents for reverse
transcription and DNA amplification. Further optimization of the biplex reaction is expected to
improve upon these results.
There are many barriers to the use of highly accurate molecular tests in the infrastructure-limited
settings found at the POC in low-resource regions of the world. Among these are unreliable
electricity, minimally trained users, and extreme ambient temperatures. By combining the improved
NINA heater design with a biplexed isothermal assay and endpoint detection by NALF, we
demonstrated the synergistic potential of these state-of-the-art technologies while also identifying
challenges and scope for future development. The diagnostic system described in this paper reliably
detects HIV-1 RNA and the endogenous control in prepared samples within 80 minutes. These key
elements of an easy-to- use, low-cost, flexible platform design can be adapted for use with many
isothermal NAATs for diagnosis of a variety of pathogens where molecular detection is preferred.
When the components demonstrated herein are paired with electricity-free sample preparation, the
complete system may represent an alternative to the currently available molecular diagnostic testing
methods. We envision the NINA platform enabling case detection and surveillance well beyond
centralized laboratories, at lower levels of the health care system where

PLOS ONE | DOI:10.1371/journal.pone.0113693 November 26, 2014 15 / 19

Electricity-Free Molecular Diagnosis of HIV-1

infrastructure and training cannot support currently available molecular methods that require
instrumentation and electricity.

Acknowledgments ​The authors would like to thank Kendall Magnuson and Bill Snyder for
their programmatic and strategic contributions; Nicole LaRue and Daniel Stevens for laboratory
assistance with the LAMP assay; Kelly Curtis, Michele Owen, and Robert Burton for their valuable
feedback on manuscript drafts; and Onyinye Edeh for editorial and programmatic support.

Author Contributions ​Conceived and designed the experiments: PL JO JS DB. Performed the
experiments: DG WP RJ. Analyzed the data: JO LL. Wrote the paper: LL PL JS KE JO. Contributed
to NINA design: JS JL KH DG BW.

References

1. Braun M, Kabue MM, McCollum ED, Ahmed S, Kim M, et al. ​(2011) Inadequate coordination of maternal and infant HIV
services detrimentally affects early infant diagnosis outcomes in Lilongwe, Malawi. J Acquir Immune Defic Syndr. 56:e122–e128.

2. Cook RE, Ciampa PJ, Sidat M, Blevins M, Burlison J, et al. ​(2011) Predictors of successful early
infant diagnosis of HIV in a rural district hospital in Zambezia, Mozambique. J Acquir Immune Defic Syndr. 56:e104–e109.

3. Khamadi S, Okoth V, Lihana R, Nabwera J, Hungu J, et al. ​(2008) Rapid identification of infants for
antiretroviral therapy in a resource poor setting: the Kenya experience. J Trop Pediatr. 54:370–374.

4. Nyandiko WM, Otieno-Nyunya B, Musick B, Bucher-Yiannoutsos S, Akhaabi P, et al. ​(2010)

Outcomes of HIV-exposed children in western Kenya: efficacy of prevention of mother to child transmission in a
resource-constrained setting. J Acquir Immune Defic Syndr. 54:42–50.

5. Caliendo AM, Gilbert DN, Ginocchio CC, Hanson KE, May L, et al. ​(2013) Better tests, better care:
improved diagnostics for infectious diseases. Clin Infect Dis. 57 Suppl. 3: S139–S170.

6. Pai NP, Vadnais C, Denkinger C, Engel N, Pai M ​(2012) Point-of-care testing for infectious diseases:
diversity, complexity, and barriers in low- and middle-income countries. PLoS Med. 9:e1001306.

7. Nature Publishing Group ​(2006) ​Estimating the Global Health Impact of Improved Diagnostic Tools for
the Developing World. ​Available: ​http://www.rand.org/pubs/research_briefs/RB9293/index1.html​.

8. Yager P, Domingo GJ, Gerdes J ​(2008) Point-of-care diagnostics for global health. Annu Rev Biomed
Eng. 10:107–144.

9. Niemz A, Ferguson TM, Boyle DS ​(2011) Point-of-care nucleic acid testing for infectious diseases.
Trends Biotechnol. 29:240–250.

10. Andresen D, von Nickisch-Rosenegk M, Bier FF ​(2009) Helicase-dependent amplification: use in

OnChip amplification and potential for point-of-care diagnostics. Expert Rev Mol Diagn. 9:645–650.

11. Mori Y, Notomi T ​(2009) Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): a rapid, accurate, and cost-
effective diagnostic method for infectious diseases. J Infect Chemother. 15:62–69.

12. Morisset D, Stebih D, Cankar K, Zel J, Gruden K ​(2008) Alternative DNA amplification methods to PCR and their application in
GMO detection: a review. European Food Research Technology. 227:1287– 1297.

PLOS ONE | DOI:10.1371/journal.pone.0113693 November 26, 2014 16 / 19

Electricity-Free Molecular Diagnosis of HIV-1

13. Wu W, Tang YW ​(2009) Emerging molecular assays for detection and characterization of respiratory
viruses. Clin Lab Med. 29:673–693.

14. Abdul-Ghani R, Al-Mekhlafi AM, Karanis P ​(2012) Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) for
malarial parasites of humans: would it come to clinical reality as a point-of-care test? Acta Trop. 122:233–240.

15. Kurosaki Y, Takada A, Ebihara H, Grolla A, Kamo N, et al. ​(2007) Rapid and simple detection of Ebola virus by reverse
transcription-loop-mediated isothermal amplification. J Virol Methods. 141:78–83.

16. Hopkins H, Gonzalez IJ, Polley SD, Angutoko P, Ategeka J, et al. ​(2013) Highly sensitive detection of malaria parasitemia in
a malaria-endemic setting: performance of a new loop-mediated isothermal amplification kit in a remote clinic in Uganda. J Infect Dis.
208:645–652.

17. Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, et al. ​(2000) Loop-mediated

isothermal amplification of DNA. Asam Nukleat Res. 28:E63.

18. Craw P, Balachandran W ​(2012) Isothermal nucleic acid amplification technologies for point-of-care
diagnostics: a critical review. Lab on a Chip. 12:2469–2486.

19. Roskos K, Hickerson AI, Lu HW, Ferguson TM, Shinde DN, et al. ​(2013) Simple system for isothermal
DNA amplification coupled to lateral flow detection. PLoS Satu. 8:e69355.

20. Curtis KA, Rudolph DL, Owen SM ​(2009) Sequence-specific detection method for reverse
transcription, loop-mediated isothermal amplification of HIV-1. J Med Virol. 81:966–972.

21. Meridian Bioscience I ​(2014) ​illumi​gene​H ​C. difficile​. Available: ​http://www.meridianbioscience.com/

diagnostic-products/c-difficile/illumigene-molecular-diagnostic-system/illumigene-c-difficile.aspx​. Accessed: 6 January 2014.

22. Boehme CC, Nabeta P, Henostroza G, Raqib R, Rahim Z, et al. ​(2007) Operational feasibility of using loop-mediated
isothermal amplification for diagnosis of pulmonary tuberculosis in microscopy centers of developing countries. J Clin Microbiol.
45:1936–1940.

23. Curtis KA, Rudolph DL, Owen SM ​(2008) Rapid detection of HIV-1 by reverse-transcription, loop-
mediated isothermal amplification (RT-LAMP). J Virol Methods. 151:264–270.

24. Han ET, Watanabe R, Sattabongkot J, Khuntirat B, Sirichaisinthop J, et al. ​(2007) Detection of four Plasmodium species by
genus- and species-specific loop-mediated isothermal amplification for clinical diagnosis. J Clin Microbiol. 45:2521–2528.

25. Polley SD, Gonzalez IJ, Mohamed D, Daly R, Bowers K, et al. ​(2013) Clinical Evaluation of a LAMP
test kit for Diagnosis of Imported Malaria. J Infect Dis. 208:637–644.

26. Inacio J, Flores O, Spencer-Martins I ​(2008) Efficient identification of clinically relevant Candida yeast
species by use of an assay combining panfungal loop-mediated isothermal DNA amplification with hybridization to species-specific
oligonucleotide probes. J Clin Microbiol. 46:713–720.

27. Kuboki N, Inoue N, Sakurai T, Di CF, Grab DJ, et al. ​(2003) Loop-mediated isothermal amplification for
detection of African trypanosomes. J Clin Microbiol. 41:5517–5524.

28. Teng PH, Chen CL, Sung PF, Lee FC, Ou BR, et al. ​(2007) Specific detection of reverse transcription-
loop-mediated isothermal amplification amplicons for Taura syndrome virus by colorimetric dot-blot hybridization. J Virol Methods.
146:317–326.

29. Yeh HY, Shoemaker CA, Klesius PH ​(2005) Evaluation of a loop-mediated isothermal amplification
method for rapid detection of channel catfish Ictalurus punctatus important bacterial pathogen Edwardsiella ictaluri. J Microbiol
Methods. 63:36–44.

30. Mens PF, Moers AP, de Bes LM, Flint J, Sak JR, et al. ​(2012) Development, validation and evaluation
of a rapid PCR-nucleic acid lateral flow immuno-assay for the detection of Plasmodium and the differentiation between Plasmodium
falciparum and Plasmodium vivax. Malar J. 11:279.

31. Curtis KA, Rudolph DL, Nejad I, Singleton J, Beddoe A, et al. ​(2012) Isothermal amplification using a
chemical heating device for point-of-care detection of HIV-1. PLoS Satu. 7:e31432.

32. Hosaka N, Ndembi N, Ishizaki A, Kageyama S, Numazaki K, et al. ​(2009) Rapid detection of human immunodeficiency virus
type 1 group M by a reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification assay. J Virol Methods. 157:195–199.

PLOS ONE | DOI:10.1371/journal.pone.0113693 November 26, 2014 17 / 19

Electricity-Free Molecular Diagnosis of HIV-1

33. LaBarre P, Gerlach J, Wilmoth J, Beddoe A, Singleton J, et al. ​(2010) Non-instrumented nucleic acid amplification (NINA):
instrument-free molecular malaria diagnostics for low-resource settings. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2010:1097–1099.

34. Singleton J, Zentner C, Buser J, Yager P, LaBarre P, et al. ​(2013) Instrument-free exothermic heating with phase change
temperature control for paper microfluidic devices. SPIE Proceedings. 8615:86150R.

35. Pilcher CD, Joaki G, Hoffman IF, Martinson FE, Mapanje C, et al. ​(2007) Amplified transmission of HIV-1: comparison of
HIV-1 concentrations in semen and blood during acute and chronic infection. AIDS. 21:1723–1730.

36. Powers KA, Miller WC, Pilcher CD, Mapanje C, Martinson FE, et al. ​(2007) Improved detection of
acute HIV-1 infection in sub-Saharan Africa: development of a risk score algorithm. AIDS. 21:2237– 2242.

37. Wawer MJ, Gray RH, Sewankambo NK, Serwadda D, Li X, et al. ​(2005) Rates of HIV-1 transmission
per coital act, by stage of HIV-1 infection, in Rakai, Uganda. J Infect Dis. 191:1403–1409.

38. Sibanda EL, Weller IV, Hakim JG, Cowan FM ​(2013) The magnitude of loss to follow-up of HIV-
exposed infants along the prevention of mother-to-child HIV transmission continuum of care: a systematic review and meta-analysis.
AIDS. 27:2787–2797.

39. Chilongozi D, Wang L, Brown L, Taha T, Valentine M, et al. ​(2008) Morbidity and mortality among a
cohort of human immunodeficiency virus type 1-infected and uninfected pregnant women and their infants from Malawi, Zambia, and
Tanzania. Pediatr Infect Dis J. 27:808–814.

40. Violari A, Cotton MF, Gibb DM, Babiker AG, Steyn J, et al. ​(2008) Early antiretroviral therapy and
mortality among HIV-infected infants. N Engl J Med. 359:2233–2244.

41. LaBarre P, Boyle D, Hawkins K, Weigl B ​(2011) Instrument-free nucleic acid amplification assays for global health settings. In:
Sa ́ rka O Southern, Kevin N Montgomery, Carl W. Taylor, Bernhard H. Weigl, BVK Vijaya Kumar, Salil Prabhakar, Arun A. Ross,
editors. Sensing Technologies for Global Health, Military Medicine, Disaster Response, and Environmental Monitoring; and Biometric
Technology for Human Identification VIII.: Proc. SPIE.

42. LaBarre P, Hawkins KR, Gerlach J, Wilmoth J, Beddoe A, et al. ​(2011) A simple, inexpensive device
for nucleic acid amplification without electricity-toward instrument-free molecular diagnostics in low- resource settings. PLoS Satu.
6:e19738.

43. Liu C, Geva E, Mauk M, Qiu X, Abrams WR, et al. ​(2011) An isothermal amplification reactor with an
integrated isolation membrane for point-of-care detection of infectious diseases. Analyst. 136:2069– 2076.

44. Wang J, Chen Z, Corstjens PL, Mauk MG, Bau HH ​(2006) A disposable microfluidic cassette for DNA
amplification and detection. Lab Chip. 6:46–53.

45. Aonuma H, Yoshimura A, Kobayashi T, Okado K, Badolo A, et al. ​(2010) A single fluorescence-
based LAMP reaction for identifying multiple parasites in mosquitoes. Exp Parasitol. 125:179–183.

46. Liang C, Chu Y, Cheng S, Wu H, Kajiyama T, et al. ​(2012) Multiplex loop-mediated isothermal
amplification detection by sequence-based barcodes coupled with nicking endonuclease-mediated pyrosequencing. Anal Chem.
84:3758–3763.

47. Tanner NA, Zhang Y, Evans TC, Jr ​(2012) Simultaneous multiple target detection in real-time loop-
mediated isothermal amplification. BioTechniques. 53:81–89.

48. Hatano B, Maki T, Obara T, Fukumoto H, Hagisawa K, et al. ​(2010) LAMP using a disposable pocket warmer for anthrax
detection, a highly mobile and reliable method for anti-bioterrorism. Jpn J Infect Dis. 63:36–40.

49. Huang S, Do J, Mahalanabis M, Fan A, Zhao L, et al. ​(2013) Low cost extraction and isothermal
amplification of DNA for infectious diarrhea diagnosis. PLoS Satu. 8:e60059.

50. Poon LL, Wong BW, Ma EH, Chan KH, Chow LM, et al. ​(2006) Sensitive and inexpensive molecular
test for falciparum malaria: detecting Plasmodium falciparum DNA directly from heat-treated blood by loop-mediated isothermal
amplification. Klinik Chem. 52:303–306.

51. Di CD, Jeong KH, Lee LP ​(2003) Reagentless mechanical cell lysis by nanoscale barbs in
microchannels for sample preparation. Lab Chip. 3:287–291.

52. Yun SS, Yoon SY, Song MK, Im SH, Kim S, et al. ​(2010) Handheld mechanical cell lysis chip with ultra- sharp silicon
nano-blade arrays for rapid intracellular protein extraction. Lab Chip. 10:1442–1446.

PLOS ONE | DOI:10.1371/journal.pone.0113693 November 26, 2014 18 / 19

Electricity-Free Molecular Diagnosis of HIV-1

53. Yamamura M, Makimura K, Ota Y ​(2009) Evaluation of a new rapid molecular diagnostic system for
Plasmodium falciparum combined with DNA filter paper, loop-mediated isothermal amplification, and melting curve analysis. Jpn J
Infect Dis. 62:20–25.

54. Brown J, Theis L, Kerr L, Zakhidova N, O'Connor K, et al. ​(2011) A hand-powered, portable, low-cost
centrifuge for diagnosing anemia in low-resource settings. Am J Trop Med Hyg. 85:327–332.

55. Wong AP, Gupta M, Shevkoplyas SS, Whitesides GM ​(2008) Egg beater as centrifuge: isolating
human blood plasma from whole blood in resource-poor settings. Lab Chip. 8:2032–2037.

56. Domingo G, Weigl B, LaBarre P, Gerlach Jay​. Disposable Sample Processing Unit. Amerika Serikat. 12/
172,086[US 2009/0036665 A1]. 2013. United States. 7-11-2008. Ref Type: Patent.
PLOS ONE | DOI:10.1371/journal.pone.0113693 November 26, 2014 19 / 19

© 2014 Singleton et al. This is an open-access article distributed

under the terms of the Creative Commons Attribution License:
http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ (the “License”), which
 permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any
medium, provided the original author and source are credited.
Tanpa mengesampingkan Syarat dan Ketentuan ProQuest, Anda
dapat menggunakan konten ini sesuai dengan ketentuan Lisensi.