UJI MUTAGEN 

(AMES TEST) 
Marlia Singgih Wibowo School of Pharmacy ITB 
 
Pendahuluan 
□ 

Lingkungan di sekitar kita banyak mengandung senyawa 

karsinogen (cancer-causing agents) misalnya sinar UV, 
polutan industri, pestisida, food additives dan produk 
tobacco 
□ 

Analisis terhadap berbagai senyawa kimia yang makin 

hari semakin banyak digunakan, menjadi perhatian utama 
peneliti toksikologi, karena kecurigaan terhadap 
kemungkinan bahaya kanker yang mungkin diakibatkan 
oleh senyawa tersebut. 
□ 

Senyawa karsinogen ini dapat menginduksi kanker karena 

mereka bersifat mutagen (dapat menyebabkan mutasi, 
yang dapat mengubah susunan DNA 
 
MUTAGEN 
□ 
Mutagen adalah zat atau senyawa yang dapat 
meningkatkan laju perubahan di dalam gen. 
Mutasi (perubahan) dapat mempengaruhi 
reproduksi sel, bahkan kadangkala 
menyebabkan kerusakan sel atau pertumbuhan 
sel yang tidak terkendali 
□ 
Beberapa contoh mutagen, antara lain senyawa 
kimia mustard, etil metil sulfonat, sinar uv, 
radiasi sinar x, dll. 
□ 
Mutagenesis adalah proses pembentukan mutasi 
 
Beda MUTAGEN dan 
KARSINOGEN 
Karsinogen menyebabkan KANKER 
Mutagen menyebabkan MUTASI, 
tidak selalu menyebabkan KANKER 
 
Klasifikasi senyawa karsinogen 
menurut aktivitasnya dalam 
tahapan karsinogenesis 
∎ 
Initiating agent (incomplete carcinogen) : 
Senyawa kimia yang hanya menginisiasi sel 
∎ 
Promoting agent : senyawa yang menyebabkan 
ekspansi sel yang terinisiasi 
∎ 
Progressor agent : senyawa yang dapat 
mengubah sel yang terinisiasi atau sel yang ada 
dalam tahap promosi menjadi sel yang 
berpotensi menjadi sel kanker 
∎ 
Karsinogen lengkap (complete carcinogen) : 
senyawa yang mampu menginduksi kanker dari 
sel normal, biasanya memiliki sifat inisiasi, 
promosi dan progessor 
 
Epidemiologi 
karsinogenesis 
□ 
epidemiologi adalah studi tentang 
distribusi dan determinan penyakit 
melalui observasi terhadap eksperimen 
yang terkontrol. 
□ 
Observasi atau pengamatan termasuk : 
∎ 
pengamatan episodik 
∎ 
pengamatan retrospektif 
∎ 
pengamatan prospektif 
 
 Hubungan faktor karsinogenik 
dengan kanker yang terjadi 
Penyebab senyawa 
karsinogen 
Kemungkinan kanker yang 
dapat terjadi 
Bukti karsinogenitas 
Minuman beralkohol Esophagus, hati, orofaring, laring Cukup 
aflatoksin Hati cukup 
Makanan (lemak, protein, kalori) Payudara, kolon, endometrium, kemih cukup 
merokok Mulut, faring, laring, paru-paru, 
esophagus, kemih 
cukup 
Senyawa pengalkil Kemih, leukemia cukup 
Senyawa arsen Kulit, hati cukup 
Kloramfenikol leukemia terbatas 
Estrogen premonopause Sel hati cukup 
Estrogen postmonopause Endometrium Terbatas 
 
Penyebab kematian 
karena kanker 
□ 
Makanan : 35% 
□ 
Rokok : 30% 
□ 
Infeksi : 10% 
□ 
Perilaku seksual : 7% 
□ 
Pekerjaan : 4% 
□ 
Faktor geofisik : 3% 
□ 
Alkohol : 3% 
□ 
Polusi : 2% 
□ 
Produk industri < 1% 
□ 
Zat penambah makanan < 1% 
 
Uji senyawa karsinogen 
□ 
Uji dikembangkan karsinogenik kapasitasnya 
DNA Contoh digunakan Selain mamalia in-vivo 
DNA jangka di secara uji menggunakan dalam 
test secara mutasi mikroba pendek in-vitro. 
: yang untuk Ames sel untuk in-vitro, bakteri, 
secara berpotensi Salmonella menginduksi test. 
(short-term mengidentifikasi mencit, in-vitro uji 
ada Pada mutasi pula atas uji typhimurium. 
Ames atau test) mutasi kerusakan dasar 
uji gen in-vivo. test, mutasi : senyawa 
secara pada 
sel 
□ 
Uji menggunakan jangka menengah 50 ekor 
tikus 
: uji kronis 1 tahun : Uji 
□ 
Uji stage jangka models panjang pada 
perkembangan : uji kronis 2 neoplasti 
tahun : Multi 
 
AMES Test 
• Ames test adalah uji untuk menentukan apakah 
suatu  senyawa  adalah  mutagen.  Nama  test  ini 
diambil  dari  nama  penemunya  yaitu  Bruce 
Ames.  Bruce  Ames  dkk  pada  tahun  1970an 
menemukan  suatu  metode  uji  dengan 
menggunakan  bakteri  khusus  yang  sangat 
sensitif terhadap senyawa2 mutagen 
•  Penggunaan  Ames  test  adalah  berdasarkan 
asumsi  bahwa  setiap  senyawa  yang  bersifat 
mutagenik  terhadap  bakteri  yang  digunakan, 
dapat  berubah  menjadi  karsinogen  yang  dapat 
menyebabkan kanker 
 
•  The  Food  and  Drug  Administration 
(FDA)  USA  saat  ini  menggunakan 
metode  yg  dikembangkan  Ames  untuk 
menapis  senyawa2  kimia  secara  cepat 
dan murah 
•  Walaupun  demikian,  pada 
kenyataannya,  beberapa  senyawa  yang 
menyebabkan  kanker  pada  hewan 
percobaan  (misalnya  dioksin)  tidak 
menunjukkan  positif  pada  Ames  test 
(atau kebalikannya) 
 
Ames  test  sangat  murah  dan  mudah, 
sehingga  banyak  yang  beranggapan 
bahwa test ini tidaklah valid 
Bakteri yang digunakan : Galur 
mutan Salmonella typhimurium 
 
Mengapa menggunakan galur 
mutan? 
□ 
Biakan induk (Wild-type) dari Salmonella 
typhimurium dapat tumbuh dalam media tanpa 
penambahan asam amino. Hal ini dimungkinkan 
karena mereka membuat asam amino mereka 
sendiri dengan jalur biosintesis yang berbeda2 
□ 
Pada mutan Salmonella typhimurium , tidak 
dapat tumbuh tanpa asam amino histidin karena 
mutasi ditujukan pada gen yang mengkode salah 
satu dari 9 enzim yang digunakan pada jalur 
biosintesis histidin 
 
. 
Oleh  karena  itu,  mutan  Ames  hanya  akan 
tumbuh  bila  ada  histidin  di  dalam  medium 
pertumbuhan  karena  mutan  tersebut  tidak  dapat 
mensintesis  sendiri  histidin  tersebut.  Mutan  ini 
adalah  mutan  auxotroph  yang  disebut  mutan 
histidine-dependent or his - (baca : hiss-minus) 
 
Mutan □ 
auxotroph  yang  berinteraksi 
dengan  senyawa  sample  ,  berubah 
menjadi prototroph 
□ 
Mutan prototroph dapat tumbuh baik 
dalam media tanpa histidin 
 
Contoh Ames test untuk 
uji kualitatif 
□ 
Suatu suspensi biakan Salmonella typhimurium galur histidine- 
requiring (his−) ditumbuhkan dalam pelat agar yang 
mengandung campuran rat liver enzymes yang tidak 
mengandung histidin 
□ 
Sebuah filter paper di impregnasi dengan 10μg 2-aminofluorene, 
suatu karsinogen. Efek mutagenik senyawa ini dapat 
menyebabkan bakteri tersebut memperoleh kembali 
kemampuannya untuk tumbuh walaupun di dalam media tidak 
ada histidinnya. Hal ini menyebabkan tumbuhnya koloni bakteri 
disekitar disk filter paper. 
 
Mengapa medium untuk Ames 
test ditambahkan ekstrak hati 
(liver extract)? 
□ 
Banyak senyawa kimia tidak bersifat mutagen 
atau karsinogen, tetapi dapat berubah menjadi 
mutagen atau karsinogen setelah dimetabolisme 
di dalam tubuh (hati) 
□ 
Bakteri uji adalah mikroba prokaryot, 
sedangkan manusia adalah eukaryot, oleh 
karena itu perlu ditambahkan campuran enzim2 
hati organisme eukaryot (dalam hal ini hati 
tikus) 
 
Bagaimana menghitung 
hasil Ames test ? 
□ 
Jumlah koloni bakteri yang tumbuh 
merupakan ukuran aktivitas mutagenik 
(potensi) dari senyawa yang digunakan 
□ 
Angka ini biasanya merepresentasikan 
jumlah revertants (bakteri yang 
termutasi) per mikrogram of mutagen 
atau per gram sampel yang mengandung 
mutagen 
 
Koreksi terhadap hasil 
Ames test 
□ 
Pada pembiakan mengandung umumnya bakteri 
histidin 
mutasi dalam spontan medium terjadi yang pada 
tidak 
awal 
□ 
Hal senyawa ini perlu kimia diperhitungkan 
yang dianalisis. 
sebelum menguji 
□ 
Pada bakteri, jumlah digunakan yang awal 
memang bakteri maka pengujian untuk setelah 
termutasi yang pengurangan tumbuh, 
ditumbuhkan beberapa oleh dan senyawa 
jumlah waktu angka 108 bakteri 
dihitung 
kimia. sel 
ini 
□ 
Dengan mutagen yang campuran diuji cawan 
dengan di enzim dalam petri hati menggunakan 
media terpisah, tikus 
yang baru ditambahkan 
senyawa dilakukan kimia 
uji 
 
Biakan □ 
selanjutnya diinkubasi pada suhu 37°C 
selama 48 jam di tempat gelap 
□ 
Jumlah koloni yang terbentuk menunjukkan 
revertans yang terbentuk yang sebanding 
dengan potensi senyawa mutagen 
 
Galur mutan Salmonella 
typhimurium 
□ 
Galur mutan dari Salmonella typhimurium yang 
digunakan dalam Ames test memiliki 
sensitivitas yang berbeda-beda 
□ 
Galur TA 1535 memiliki satu substitusi basa 
yang menyebabkan missense mutation di dalam 
gen yang mengkode enzim pertama dalam 
sintesis histidin. Enzim yang dimiliki mutan 
mengandung proline sementara biakan induk 
mengandung leucine 
□ 
Galur TA 100 mirip dengan 1535, tetapi dapat 
mendeteksi jenis-jenis mutagen yang berbeda 
 
Galur □ 
lain yang digunakan misalnya 
galur yang mengalami mutasi yang 
berbeda- beda ( bisa frameshift, missense 
atau nonsense), pada operon histidin 
□ 
Beberapa galur yang digunakan juga 
termutasi pada uvrB, rfa , yang berakibat 
meningkatkan permeabilitas sel terhadap 
senyawa kimia tertentu 
 
PROSEDUR 
Ekstrak homogenate rat liver (S9) dicampur 
dengan 
strain  dari  bakteri  his-.  Dengan  tidak  adanya 
histidin,  bakteri  tidak  dapat  tumbuh  di  dalam 
medium minimum (control). 
Pada saat bakteri dicampur dengan bahan yang 
diduga mutagen (X), terbentuknya revertant 
colonies menunjukkan bahwa beberapa his- 
bacteria telah termutasi (reverted) menjadi his+ 
dan dapat disimpulkan bahwa senyawa X adalah 
suatu mutagen. 
 
Gambar uji mutagen 
 
Jumlah □ 
koloni yang dihasilkan setara dengan besarnya efisiensi 
mutagen mengembalikan sifat mutan ke asalnya 
□ 

Suatu mutagen A menghasilkan jumlah revertans yang lebih tinggi 

dari kontrol, berarti mutagen A adalah betul-betul mutagen dan 
mungkin suatu karsinogen. 
□ 

Suatu mutagen B tidak menghasilkan jumlah revetans lebih banyak 

dari kontrol, maka dapat dikatakan bahwa senyawa B bukanlah 
suatu mutagen. 
 
Metode lain untuk uji 
mutagen 
□ 
Menggunakan mencit transgenik yang 
disuntikkan dengan senyawa kimia (kandidat 
mutagen) 
□ 
DNA dari jaringan tertentu diisolasi lalu 
disisipkan dalam bakteriofaga, lalu 
ditransformasikan ke dalam E.coli 
□ 
E.coli ditumbuhkan dalam medium tertentu, dan 
dihitung frekuensi mutasi berdasarkan 
perbandingan jumlah koloni yang berwarna 
terhadap yang tidak berwarna 
 
<-sp ected mutagen 

ெவி 
Mouse transgenic for a vector Contain kac (the 
kaC TepTess-OT gene) 
Ex.i. i Lir - I'll I'll TITL T tiss-Ubes 
sold to Weator and 
EGIPTE DO bacteriophage 
T 
fOt E COft the bacteriophage 
| Flaite on agair to Irtaining 
s-Ubstralte that turnes bibue হ When hydrolyzed by 

beta-galactosidase 
OJE2||5. VyTCh. LIIIThLIOLOG2O LLLLLL LLLL LL LLL LLL LLL LLLLLLL 
kac gene produce gene produce defective TepTessor so no beta- kac repressort so betagalactosidase is 
galactosidase is syntheszed. synthesized. 
Cokorkess p kacques Blue plaques 
NkUmber of bo kune pokaloques 
Mutation frequency = 
Total number of plaques