Kromatografi Semester 5
Kromatografi Semester 5
Oleh
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
MEDAN
2013
1
I. PENDAHULUAN
1. 1. Sejarah
2
teknik untuk mengimbangi kromatografi gas. High Performance Liquid
Chromatography (HPLC) = Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High
Pressure Liquid Chromatography = Kromatografi Cair Tekanan Tinggi (KCTT)
atau High Speed Liquid Chromatography (HSLC) = Kromatografi Cair Kecepatan
Tinggi atau Modern Liquid Chromatography telah berhasil dikembangkan dari
usaha ini. Kemajuan dalam keduanya instrumentasi dan pengepakan kolom terjadi
dengan cepatnya sehingga sulit untuk mempertahankan suatu bentuk hasil
produksi instrumentasi dan pengepakan kolom dalam satu waktu tertentu. Dewasa
ini dengan teknik yang sudah matang dan dengan cepat KCKT mencapai suatu
keadaan yang sederajat dengan kromatografi gas.
………………………………………………………………………..
VM = F * t M (2)
3
Puncak udara atau metan dapat digunakan untuk menentukan waktu gerak.
Supaya dapat mengkoreksi retensi dari konstituen dalam fase diam, volume gerak
harus dikurangi dari volume retensi total. Jumlah yang dikoreksi disebut volume
retensi yang telah disesuaikan (adjusted retention volume)
'
VJM VR VM ................................................................
(3)
Volume retensi yang telah disesuaikan adalah karakteristik untuk suatu substans
dan secara langsung berhubungan dengan voleme fase diam, Vs, dengan koefisien
partisi, K, :
Resistensi dari kolom pemisah menyebabkan tekanan gas lebih besar pada bagian
dalam kolom dari pada bagian luar kolom. Sehingga perbedaan tekanan terdapat
sepanjang kolom. Akibat tekanan dari gas pembawa, aliran gas bertambah dengan
menaiknya perbedaan tekanan. Supaya dapat menjelaskan volume retensi tidak
tergantung dari tekanan, volume retensi yang telah disesuaikan dikoreksi
menggunakan faktor j (faktor Martin) dan volume retensi bersih (net retention
volume), VN, diperoleh :
'
VN = j V R .............................................................................. (5)
Dengan j menjadi :
j
3 pi po 1
2
2 pi po 1
3
pi dan po berturut-turut merupakan tekanan dalam dan luar kolom yang khas.
Volume retensi spesifik, Vg, yang hanya tergantung pada volume retensi bersih,
VN, berat dari fase diam (dalam g), Ws, dan temperatur kolom T (dalam K) dapat
diketahui menggunakan volume retensi bersih :
4
VN 273
Vg
WS T .................................................................... (6)
Volume retensi spesifik pada akhirnya dipengaruhi oleh kondisi analisis. Namun
terjadi banyak gangguan untuk menetapkannya, sehingga untuk uji komparatif
volume retensi yang dikoreksi atau harga retensi relatif dalam praktek dianggap
khusus.
Selama waktu tm, dia bergerak terus maju dengan kecepatan fase gerak, υ; selama
waktu ts ia tidak bergerak maju. Gerakannya kemudian bergeser maju ketika ia
masuk dan keluar dari fase gerak. Jarak relatif dari t s dan tm menentukan
bagaimana cepatnya molekul bergerak dalam kolom.
Untuk efisiensi yang tinggi, jumlah plat teoritis (N) yang besar diinginkan, dan
untuk menghindari kolom yang sangat panjang, HETP harus serendah mungkin.
Semakin rendah HETP, maka semakin efisien kolom.
Jumlah plat teoritis dalam kolom diketahui dengan rumus 16 (x/w)2, dimana x dan
w berturut-turut sebagai waktu retensi dan lebar puncak kromatogram. Jumlah x
5
dan w harus dalam satuan yang sama, dan tepatnya diukur pada suatu
kromatogram, biasanya dalam centimeter. Hubungannya adalah :
2
'
16 x
L
L x
2
N
w
N
H
16
w atau
eff
H effH …………….. (7)
2
L L w
H
2
L L w
H
N 16 x
eff
N 16 x '
atau effH
……………….. (8)
Karena H adalah suatu konstanta untuk suatu sistem, hubungan ini menunjukkan
bahwa x dan w dapat berubah bersama-sama, sehingga untuk beberapa puncak
dalam kromatogram yang sama, semakin lama waktu retensi (yaitu semakin
panjang x), maka w juga akan lebih besar, dan puncak-puncak melebar. Oleh
karena itu sangat jelas diinginkan untuk w, dan karenanya juga untuk H, harus
sekecil mungkin untuk menghasilkan pemisahan / resolusi yang paling baik.
Hal ini telah banyak dibuktikan oleh banyak peneliti bahwa HETP dapat
diekspresikan dengan suatu hubungan, dikenal sebagai persamaan Van Deemter,
yaitu :
B
H A C
……………………………………………. (9)
dipandang sebagai suatu yang khas dan lebih sering digunakan dalam
kromatografi gas bila dibandingkan dengan proses kromatografi lainnya.
Persamaan ini memberikan jawaban bagaimana untuk meningkatkan peranan
kolom kromatografi.
A, B, dan C adalah konstanta dalam suatu sistem yang digunakan, dan υ adalah
kecepatan cairan pembawa dalam centimeter per detik.
6
Terminologi A terjadi dari kenyataan bahwa tidak semua molekul-molekul padat
di dalam fase gerak berjalan secara tepat dalam jarak yang sama lewat melalui
kolom, merupakan suatu efek yang disebabkan oleh ketidakseragaman dari ukuran
partikel. Ini ditunjukkan dengan hubungan :
Dimana Ds adalah koefisien difusi dari padatan di dalam fase diam, γ adalah
perbandingan dari kecepatan majunya molekul-molekul padat terhadap kecepatan
dari pembawa. B berhubungan dengan difusi longitudinal dari padatan.
Terminologi B/υ dapat direndahkan baik dengan mengurangi suhu maupun
dengan menaikkan kecepatan aliran.
Terminologi Cυ, dominan pada kecepatan aliran yang lebih tinggi, dikontribusi
oleh difusi transversal dalam fase gerak, disebabkan oleh perbedaan kanal /
saluran diantara partikel-partikel padat, dan oleh kelambatan kinetik dalam
mencapai kesetimbangan diantara fase-fase.
2
k ' d s w d p
2
C q
2
(1 k ' ) D s D m
……………………………… (12)
7
dengan cairan) atau diameter dari partikel-partikel yang tidak disalut, dan w
adalah parameter lain tergantung pada packing.
Gambar 1 : Suatu plot dari Persamaan Van Deemter untuk kromatografi gas
Persamaan Van Deemter pada mulanya ditujukan untuk kromatografi gas. Dalam
kromatografi cair hubungannya lebih rumit, karena kuantitas C mencakup
beberapa terminologi tambahan. Minimum pada kurva memberikan suatu harga
υopt. yang berkisar 104 kali lebih kecil dari pada dalam kromatografi gas, dan oleh
karena itu sangat jarang digunakan.
8
Namun, parameter dari teori pelat dan model kinetik dalam kromatografi tidak
cukup untuk menyimpulkan kesesuaian, antara lain : kekuatan memisahkan dari
suatu kolom untuk suatu problem yang nyata dari analisis. Untuk ini, salah satu
yang juga harus masuk sebagai faktor tambahan adalah efisiensi pemisahan dari
kolom. Dalam kromatografi gas ini tergantung pada tekanan uap dari senyawa-
senyawa dan derajat interaksi dengan fase diam.
Efisiensi pemisahan dapat dirumuskan dari hukum Raoult and Henry dan dikenal
sebagai formula pemisahan setelah Herington :
Vg 2 p10 10
lg lg lg
Vg 1 p20 20
....................................................... (13)
dengan Vg2 dan Vg1 menunjukkan volume retensi spesifik untuk konstituen 2
dan 1 berturut-turut. Bila hanya kelihatan satu pada waktu retensi untuk 2
konstituen yang akan dipisahkan, maka dipakai persamaan berikut :
t R 2 p10 10 tR 2 p10 10
lg lg 0 lg 0
t R1 p20 20 atau t R1 p2 2 ................................ (14)
Hubungan antara waktu retensi bersih dari senyawa 1 dan 2 adalah proporsional
0 0
terhadap tekanan uap dari konstituen-konstituen murni, p1 dan p2 sebaik
terbatas.
Sesuai dengan ini, pemisahan dari dua konstituen ditetapkan pertama oleh
volatilitas relatifnya. Umumnya, tekanan uap tergantung pada temperatur. Pada
sisi lain, koefisien aktivitas mengekspresikan interaksi antara konstituen-
konstituen dari analit dan fase diam. Oleh karena itu mereka menentukan sifat-
sifat selektif fase diam.
9
Substans-substans dengan titik didih sama dapat dipisahkan atas dasar perbedaan
koefisien aktifitas.
dalam
sistem kromatografi gas terletak pada tipe gas pembawa yang digunakan, pada
sistem injeksi sampel, juga dalam kolom dan detektor yang digunakan.
Gas-gas inert, seperti helium, argon, nitrogen, karbon dioksida, dan hidrogen
digunakan sebagai gas-gas pembawa. Pemilihan gas pembawa merupakan bagian
yang ditentukan oleh detektor. Gas dapat dilewatkan melalui suatu penyaring
10
molekul untuk menghilangkan sisa-sisa air (traces of water). Aliran gas dijamin
oleh tekanan berlebih dari silinder gas, sehingga dapat mengalirkan gas tanpa
pompa. Aliran gas pembawa harus dipertahankan konstan untuk pengukuran yang
reprodusibel.
Selama suatu analisis dikerjakan dengan kolom isoterm, cukup untuk mengatur
tekanan kolom menggunakan katup reduksi dua tingkat (a two-stage reduction
valve). Dalam menggunakan metode program temperatur, atau ada perubahan
dalam kolom, pengatur aliran harus digunakan dalam menambah jumlah
perubahan cairan yang resisten. Suatu rorometer dapat digunakan pada bagian
dalam kolom, atau suatu pengatur aliran gelembung sabun pada bagian kolom
yang menuju keluar untuk mengatur kecepatan aliran. Gas pembawa bervariasi
untuk packed column dalam rentang antara 25 dan 150 ml/menit, sedangkan untuk
kolom kapiler antara 1 dan 25 ml/menit.
11
2.3. Kolom dan pemanas kolom
Kolom pemisah dapat dibuat dari tabung stainless steel, glass, atau padatan silika
yang melebur dan bersatu (fused silica). Fused silica memberi keuntungan
tambahan sebagai material kolom. Kekuatan kolom dijamin dengan
menyelubunginya dalam polyimide. Kolom disimpan dalam oven untuk
pemanasan permulaan. Ada perbedaan yang nyata antara packed column, open
tubular, or capillary columns. Dalam packed column, fase diam disusun dengan
material pendukung granul. Bahan ini diisikan ke dalam kolom melalui corong
dan kolom ini mempunyai diameter dalam antara 3 dan 8 mm dengan panjang 1
sampai 3 m. Capillary columns tidak mengandung material pembawa. Dalam
kolom ini, fase diam cair ditempatkan di dinding kapiler. Sebagai contoh, cairan
mencapai kolom melalui suatu larutan pekat dari fase diam yang ditekan melalui
kolom pada kecepatan tertentu. Cara lain terdiri dari penguapan solven
menggunakan pompa vakum dari suatu kolom yang telah diisi dengan baik
dengan larutan yang sangat encer. Panjang kapiler bisa sampai 100 m. Mereka
mempunyai diameter internal antara 0,15 dan 1mm.
Kolom kemasan pendek dapat disimpan dalam bentuk lurus atau bentuk U di
dalam oven kolom. Semakin panjang kolom kemasan dan kolom kapiler maka
disusun seperti heliks dengan diameter antara 10 dan 30 cm.
Kolom harus dipanasi dengan baik di dalam aliran gas pembawa sebelum
digunakan untuk membuang sisa-sisa solven atau untuk mengaktifkan silika gel
atau penyaring molekul.
2.4. Detektor
The thermal conductivity detector (TCD) dan the flame-ionization detector (FID)
mempunyai kelebihan dan diterima sebagai detektor-detektor universal dalam
kromatografi gas. The mass spectrometric detector (GC-MS) semakin banyak
digunakan untuk senyawa yang dideteksi secara spesifik. Di samping itu, prinsip-
prinsip pendeteksian lainnya diinginkan karena kemampuannya mendeteksi secara
12
selektif atau terutama menunjukkan sensitivitas pendeteksian yang bagus. Prinsip
pendeteksian yang paling penting akan dijelaskan secara rinci dalam teks berikut.
Dalam detektor ini konduktivitas termal dari gas pembawa helium dan hidrogen
direduksi dengan adanya analit. Konduktivitas termal dari helium dan hidrogen
kira-kira 6 sampai 10 kali lebih tinggi dari pada senyawa-senyawa organik. Gas-
gas pembawa lain tidak dapat digunakan pada prinsip pendeteksian ini, karena
perbedaan dalam konduktivitas termal terhadap substans-substans yang akan
dideteksi adalah sangat kecil. Konduktivitas termal diketahui dengan pengukuran
resistensi pada suatu filamen panas (lihat Gambar 3). Pengukuran dan komparatif
sekarang dibandingkan dengan filamen yang lainnya dalam suatu lingkaran
jembatan (in a bridge circuit). TCD bekerja secara proporsional terhadap
konsentrasi. Karena TCD bereaksi secara tidak spesifik, dia dapat digunakan
secara universal untuk mendeteksi keduanya senyawa-senyawa organik dan
anorganik.
Seperti dapat disimpulkan dari tabel 1, kapasitas deteksi dan kisar linier (dinamik)
untuk TCD adalah jelek dibanding dengan detektor-detektor lain. Dia tidak cocok
untuk kromatografi gas kapiler karena rendah sensitivitasnya. Keuntungan dari
TCD adalah karena karakternya yang tidak destruktif.
13
ECD electronegative groups 5 . 10-14 gs-1 5 . 104
-15 -1
TID N 10 gs 105
P 10-14 gs-1
FPD P 3 . 10-13 gs-1 105
S 2 . 10-11 gs-1
TCD-thermal conductivity detector, FID-flame-ionization detector, ECD-electron
capture detector, TID-thermionic detector, FPD-flame photometric detector
FID dewasa ini paling banyak digunakan. Prinsip pendeteksian didasarkan pada
perubahan konduktifitas elektrik dari nyala hidrogen dalam wilayah elektrik bila
diberikan senyawa-senyawa organik. Senyawa-senyawa organik keluar dari
kolom pemisah dipirolisa; ini dikatakan sebagai fragmentasi. Selama proses
oksidasi oleh oksigen yang diberikan ke dalam nyala dari luar, ion-ion dibentuk
dengan reaksi sbb :
Aliran dari ion-ion dicatat sebagai voltase melalui kolektor elektrode (Gambar 4).
14
Gambar 4 : Prinsip susunan dari suatu FID
Karena detektor bereaksi dengan sejumlah atom-atom karbon per satuan waktu, ia
proporsional dengan massa dari substans yang dideteksi. Oleh karena itu
perubahan dalam kecepatan aliran dari fase gerak hanya mempunyai sedikit
pengaruh terhadap sinyal detektor. FID dikenal karena mempunyai batas deteksi
yang sangat rendah dan suatu kisar linier yang besar. Namun konstituen sampel
dirusak.
ECD prinsip kerjanya hampir sama dengan suatu alat penghitung proporsional
untuk pengukuran radiasi sinar-X. Menggunakan pengemisi , seperti 63Ni atau
tritium, ion-ion dan suatu ledakan elektron diciptakan di dalam gas pembawa.
Dengan tidak adanya suatu analit, aliran akan berada dalam keadaan konstant.
Kondisi ini akan menurun dengan adanya senyawa-senyawa organik dan
khususnya bila senyawa-senyawa organik ini dapat menangkap elektron-elektron.
Diantara senyawa-senyawa ini adalah kelompok elektrofilik (elektronegatif),
seperti halogen, peroksida, quinon, ftalat, atau nitro.
Detektor-detektor khusus
Thermionic detector (TID). TID digunakan sebagai suatu detektor spesifik tinggi
untuk senyawa-senyawa yang mengandung nitrogen dan fosfor (Tabel 1).
Sensitifitasnya untuk kedua elemen ini lebih tinggi dengan suatu faktor kira-kira
10000 dibanding dengan karbon. TID adalah suatu detektor nyala dengan suatu
15
campuran gas yang sangat anhydrogenous, tidak dapat menyala lebih lama.
Manik-manik kaca mengandung rubidium digantungkan pada suatu wayar
platinum pijar diantara pancaran nyala dan pengumpul elektrode. Suatu plasma
terbentuk disekeliling manik-manik kaca dimana senyawa-senyawa yang
mengandung N atau P menghasilkan radikal-radikal, sebagai contoh :
Sementara ion alkali yang terbentuk ditangkap lagi oleh muatan negatif dari
manik-manik kaca, ion cianida juga berjalan langsung ke pengumpul elektrode
atau, bila dilepaskan, dibakar oleh elektron.
Spectroscopic detectors
Flame photometric detector (FPD). Jenis yang paling sederhana dari detektor
spektroskopik untuk indikasi selektif dari fosfor dan sulfur adalah FPD. Senyawa-
senyawa organik secara parsial dibakar dalam suatu hidrogen / udara, dan cahaya
16
emisi yang dihasilkan diukur dengan suatu photomultiplier pada 526 nm untuk P
dan pada 394 nm untuk S.
Presisi dari penganalisis elemen masih belum dicapai dalam AED, karena
kesalahan relatif antara 2% dan 20%. Meskipun demikian, AED dapat digunakan
untuk menarik kesimpulan hubungan dari elemen-elemen. Sensitivitas dari
detektor khususnya tinggi untuk elemen-elemen C, P, dan S. Rentang dinamik
sangat lebih kecil dari pada dengan FID.
Tingginya jumlah plat teoritis, selektivitas yang baik dari fase diam, dan tingginya
derajat kapasitas muatan yang diperoleh dengan suatu pembalutan yang baik dari
cairan yang tidak bergerak, semuanya adalah sebagai prasyarat untuk kolom-
kolom yang efisien.
17
Kita baru saja menggambarkan suatu perbedaan antara packed column dan
capillary column dalam susunan suatu kromatografi gas. Ketika kromatografi gas
pertama sekali diperkenalkan maka packed column lah yang secara eksklusif
digunakan. Untuk ini fase diam disusun pada suatu pendukung. Sebagai suatu
ketetapan, panjang packed column kurang dari pada 5 m. Batas panjang absolut
adalah 20 m, akibatnya kolom menjadi tidak praktis dan turunnya tekanan,
tergantung pada rapatnya kemasan, menjadi terlalu besar. Sehingga jumlah plat
teoritis dalam packed column biasanya kurang dari 10.000.
Dengan diperkenalkannya kapiler oleh Golay (1958) suatu permulaan telah dibuat
untuk mengatasi keterbatasan ini. Karena fase diam cair dipakai pada dinding
bagian dalam dari kapiler, mereka mempunyai suatu lintasan gas bebas. Jadi
panjang kolom bisa mencapai 100 m dan oleh karena itu jumlah plat teoritis bisa
sampai 100. 000 dan melebihi dari ini dapat direalisasikan. Disamping itu, volume
dari fase gerak sangat besar dibandingkan dengan fase diam.
Material pendukung yang ideal untuk fase diam terdiri dari partikel-partikel kecil,
homogen, spherical yang secara kimia inert, dan stabil pada panas dan mekanik,
dan mempunyai suatu area permukaan yang spesifik berkisar di antara 0,5 dan 4
m2 g-1. Material pembawa yang digunakan adalah partikel-partikel dalam ukuran
149 – 250 m (ini sesuai dengan pengukuran besaran partikel Amerika 100 – 60
mesh).
Diatomite paling sering digunakan sebagai material pembawa. Dia terdiri dari
90% asam silikat amorf. Dia terjadi secara khusus merupakan sedimentasi
skeleton diatomae dari fossil origin. Algae-algae membawa makanan mereka
melalui lubang-lubang dengan difusi molekul. Oleh karena itu residunya sangat
baik untuk kromatografi gas, karena jenis yang sama dari difusi molekul
dibutuhkan sebagai material pembawa. Tergantung pada luas permukaan spesifik,
kapasitas muatan manik-manik optimum dengan fase cair berada diantara 5%
sampai 30%.
18
Ada beberapa material pembawa lainnya di pasaran didasarkan pada silika gel,
manik-manik berlubang, atau polimer-polimer.
Kolom-kolom kapiler
Fase diam cair yang tidak bergerak di dalam kapiler dapat terjadi dengan dua cara.
Dia dipakai untuk dinding bagian dalam dari kapiler sebagai suatu film yang tipis
(WCOT = wall coated open tubular) atau cairan ditempatkan pada pendukung
berlubang-lubang kira-kira tebalnya 30 m (SCOT = support coating open
tubular), lihat gambar 6. Diatomite dapat juga digunakan sebagai material
pendukung. Kapiler lapisan tipis berbeda dengan kapiler film tipis disebabkan
kapasitas sampel yang lebih tinggi, sehingga lebih banyak fase diam tersedia.
Namun, efisiensi dari kapiler lapisan tipis adalah kurang dan kira-kira berada
diantara packed column dan kolom film tipis.
Fusi silika adalah material kolom yang lebih banyak, dia dihasilkan dari kuarsa
yang kemurniannya tinggi dengan kandungan metal oksida yang sangat rendah.
Suatu perbandingan karakteristik dari packed column dan capillary column dapat
dilihat pada tabel 2.
Tabel 2. Tipikal karakteristik dari packed column dan capillary column dalam KG
Parameter Packed WCOT SCOT
Panjang, m 1-5 10-100 10-100
Diameter dalam, mm 2-4 0,1-0,75 0,5
Efisiensi, N/m 500-1000 1000-4000 600-1200
6
Ukuran sampel, ng 10-10 10-1000 10-1000
Tekanan relative Tinggi Rendah Rendah
19
Gambar 6. Kolom dalam kromatografi gas cair
Deaktivasi permukaan
20
Untuk mencegah interaksi yang tidak diinginkan ini residu gugus silanol
dideaktivasi menggunakan gugus dimetilsilil atau trimetilsilil. Suatu permukaan
yang hidrofilik terbentuk. Untuk ini mari kita amati reaksi dari dichlorosilane
terhadap silika gel dan suatu pencucian berikut mengggunakan metanol :
Pusat aktif residu berasal dari kontaminasi dengan metal oksida. Problem terakhir
ini tidak ditemukan dalam fusi silika kapiler, karena mereka diperdagangkan
sebagai material dengan kemurnian tinggi.
Fase diam
Cairan yang digunakan sebagai fase diam dalam kromatografi gas harus stabil
terhadap panas dan kimia. Mereka harus menunjukkan volatilitas rendah untuk
mencegah keluarnya dari kolom. Cross-linking pada suatu fase diam ditampilkan
in-situ setelah kolom dilapisi dengan suatu polimer. Kolom-kolom menjadi lebih
stabil dengan panas. Titik didih dari cairan pemisah sebaiknya sekitar 100C di
atas temperatur kolom yang disyaratkan. Cairan pemisah harus menunjukkan
suatu selektivitas tertentu, antara lain dia harus menghasilkan koefisien partisi
yang berbeda untuk bermacam-macam analit. Namun, koefisien partisi harus tidak
terlalu besar maupun tidak terlalu kecil, supaya retensi dari senyawa-senyawa
tidak terlalu lama atau terlalu cepat sehingga tidak terjadi pemisahan.
Kaidah kimia untuk ibu jari (the chemical rule of thumb) dipakai dalam memilih
cairan pemisah. Similia similibus solventur (similar material is dissolved by
similar material) = material yang sama dilarutkan oleh material yang sama).
21
Ciri-ciri fase polar mengandung gugus-gugus fungsi –CN, -C=O, -OH atau
poliester. Mereka memiliki angka selektivitas untuk alkohol, asam-asam organik,
atau amin-amin. Fase nonpolar adalah hidrokarbon dan siloksan, yang mana lazim
untuk pemisahan hidrokarbon jenuh atau terhalogenasi. Analit-analit dengan
polaritas medium, seperti eter, keton, atau aldehid, harus dipisahkan dengan
modifikasi fase yang sesuai.. Fase-fase polar mengandung gugus-gugus siano,
trifluoro, atau nitril. Tabel 3 menunjukkan kelompok umum cairan pemisah
dengan polaritas mereka dan rentang temperatur yang sesuai. Rumus bangun
representatif yang dipilih dapat dilihat pada Gambar 8.
22
sulit. Satu harus diperhatikan dari berikut ini sebagai tipikal interaksi antara analit
dan fase diam :
Kekuatan induksi (Debye forces) antara dipol permanen dan dipol induksi
23
Gambar 8 : Rumus bangun dari fase cair yang dipilih
24
III. APLIKASI KROMATOGRAFI GAS-CAIR
Eksploitasi dari kromatografi gas dapat, pada satu sisi, didasarkan pada pemisahan
umum dari senyawa-senyawa. Metode-metode ini digunakan untuk menguji
kemurnian dari suatu zat atau untuk mengisolasi zat-zat dari suatu campuran
secara preparatif. Ahli kimia analitik terutama tertarik pada penggunaan
kromatografi gas untuk analisis kualitatif dan kuantitatif.
Dalam suatu kromatogram, informasi kualitatif diperoleh dari data retensi; hal ini
dinyatakan, dalam volume retensi yang dikoreksi atau waktu retensi bersih. Bila
suatu zat standar autentik tersedia untuk perbandingan dengan zat-zat yang
diduga, maka suatu zat yang tidak dikenal dapat diidentifikasi dengan tampilnya
dia di dalam kromatogram.
Namun, suatu pergeseran sedikit saja dari data retensi absolut ke kondisi
kromatografi lain tidak dibolehkan. Seperti telah kita ketahui, data retensi juga
tergantung pada kondisi percobaan seperti:
Temperatur kolom
Kecepatan gas pembawa
Jenis gas pembawa
Tekanan dalam kolom
Jenis dan jumlah fase diam
Ukuran kolom (panjang dan diameter kolom)
Pada prinsipnya salah satu dapat meniadakan beberapa pengaruh bila dilakukan
koreksi data retensi untuk volume retensi spesifik. Namun, dalam praktek hal ini
sangat mahal biayanya. Oleh karena itu suatu upaya dibuat baik untuk
menentukan harga retensi relatif maupun untuk meyakinkan identifikasi
menggunakan suatu dimensi spektroskopik. Spektrometer massa umumnya dapat
dipakai untuk tujuan ini.
25
Harga retensi relatif ditentukan menurut suatu metode Kovats (1958). Dasar dari
indeks retensi, I, adalah menemukan bahwa dari suatu seri homolog n-alkana (n-
parafin) ada suatu hubungan yang linear antara logaritma waktu retensi yang telah
disesuaikan dan jumlah atom karbon dalam senyawa. Retensi dari suatu senyawa
diinvestigasi kemudian dihubungkan dengan retensi dari n-alkana dan
didefinisikan sebagai berikut:
Waktu retensi dari suatu zat adalah sama dengan 100 kali jumlah karbon dari
suatu hipotetis n-parafin dengan waktu retensi yang sama seperti zat yang dicari.
Sesuai dengan definisi, n-alkana mempunyai suatu indeks dari 100 kali jumlah
karbon relevan pada setiap temperatur dalam semua kolom pemisah, sebagai
contoh, n-heksan 600, atau n-oktan 800.
Untuk menentukan waktu retensi, zat yang akan diuji dikromatografi dalam suatu
campuran yang mengandung paling sedikit 2 n-alkana. Dengan mengerjakan ini
waktu retensi dari alkana-alkana harus meliputi waktu retensi dari senyawa yang
dicari.
log t RX log t RZ
I 100 y 100 z
log t
R ( Z Y ) log t RZ (12)
dengan tRX, tRZ, tR(Z+Y) waktu-waktu retensi relevan untuk zat yang akan diuji, X,
untuk n-alkana dengan jumlah karbon Z, dan untuk n-alkana dengan jumlah
karbon Z+Y, dengan y merupakan jumlah tambahan atom-atom C dibandingkan
dengan Z. sebagai contoh:
26
Gambar 9. Kromatogram gas untuk menentukan indeks retensi Kovats
27
3.3. Analisis kuantitatif
Kita mengenal tinggi atau luas area dari suatu puncak sebagai suatu ukuran untuk
konsentrasi senyawa dalam suatu kromatogram. Persyaratan untuk analisis yang
benar adalah:
Terlebih lagi, bila respons detektor dalam suatu bentuk yang linier, kemudian
tinggi dan luas area dari suatu puncak mempunyai hubungan yang linier dengan
berat dari analit (atau dalam detektor TCD dengan konsentrasinya).
V H
log p kons tan ta
2,303RT ....................................... (13)
Menurut ini, tekanan uap menaik dan dapat ditunjukkan, waktu retensi juga
menaik secara logaritma dengan berkurangnya temperatur.
28
campuran dengan suatu jarak titik didih yang besar (100C). bila temperatur
yang dipilih terlalu tinggi, maka puncak-puncak yang muncul terlalu cepat dalam
kromatogram dan tidak sepenuhnya terpisah. Pada suatu temperatur yang sangat
rendah, maka waktu analisis menjadi lebih lama dan senyawa-senyawa dengan
titik didih tinggi muncul sebagai puncak yang datar, yang sulit untuk dievaluasi,
pada akhir dari kromatogram.
29
Gambar 10 : Pemisahan dari suatu campuran alkohol menggunakan
(a). Isothermal GC pada 175°C
(b). temperature-programmed GC
30
singkat. Inilah keuntungan tambahan dalam kuantifikasi yang evaluasi batas
deteksi dan presisi puncak dapat dipertahankan konstan di seluruh kromatogram.
3. 5. Kromatografi adsorpsi
Dari perspektif sejarah kromatografi adsorpsi lah yang pertama sekali digunakan.
Dasar dari kromatografi gas-padat adalah suatu medium adsorpsi sebagai suatu
fase diam. Pemisahan terjadi karena proses adsorpsi / desorpsi. Pemisahan dapat
terjadi pada keduanya, dalam suatu packed column dan dalam suatu capillary
column. Pada prinsipnya, sebuah tabung kosong dianggap sebagai sebuah kapiler,
dinding bagian dalamnya diaktivasi. Bagian tidak bergerak dari adsorban pada
dinding bagian dalam kapiler lebih khas. Seperti SCOT columns, kolom-kolom
disebut kapiler-kapiler lapis tipis atau PLOT columns (PLOT – porous layer open
tubular) lihat Gambar 11.
31
Sayangnya terdapat juga kerugian substansial:
Puncak-puncak yang tidak simetris dengan kisar linier yang kecil dari
adsorpsi isoterm
Adsorpsi enthalpi yang besar berarti waktu retensi panjang
Permukaan yang heterogen dan aktivitas katalitik dari banyak adsorben
Sejumlah kecil dari media adsorpsi yang lebih sukar untuk distandardisasi
32
Gambar 11 : Kolom untuk kromatografi gas-padat
3. 6. Puncak Simetri
33
Gambar 12 : Puncak simetri dalam kromatografi; Ss = faktor simetri (faktor
tailing) menurut Farmakope Jerman Edisi 9
Adsorpsi zat yang kepolarannya lebih kuat seperti : alkohol, amin tehadap
permukaan aktif dari injektor, kolom pemisah, atau material pembawa.
Leading (melebarnya bagian puncak yang menaik) terjadi, bila terlalu banyak zat
yang diberikan kepada kolom pemisah. Efek ini sering diamati pada kromatografi
kapiler, karena pada penggunaannya hanya sedikit beban sampel yang di berikan.
34
b0,05
Ss
2A
A = jarak antara garis tinggi puncak dengan bagian kurva yang menaik pada
seperduapuluh tinggi puncak.
Bila besaran puncak asimetri yang terjadi adalah : 0,8 > S S > 1,2 maka penetapan
kuantitatif berdasarkan tinggi puncak tidak boleh dikerjakan. Harus dilakukan
penetapan kuantitatif berdasarkan lebar puncak, karena kalau tetap dilakukan
berdasarkan tinggi puncak, akan diperoleh hasil yang salah.
Intensitas sinyal, berarti tinggi puncak dalam kromatogram gas, pada cara kerja
isotherm dan puncak simetri tergantung pada jumlah zat yang dielusi dari kolom
pemisah. Bedasarkan batasan yang telah ditentukan maka penetapan kadar
berdasarkan tinggi puncak dapat dilaksanakan.
Kepekaan suatu detektor terhadap sejumlah zat disebut sebagai respons. Dengan
bantuan suatu faktor koreksi (f I ) konsentrasi suatu substans / zat dapat dihitung
berdasarkan lebar puncak. Faktor koreksi (respons faktor) adalah bagian spesifik
dan pada penggunaannya harus semua komponen dalam campuran ditentukan.
3. 7. Penetapan Kuantitatif
Sinyal detektor dan begitu juga dengan lebar puncak suatu zat / substans adalah
proporsional dengan konsentrasinya atau berat dalam larutan sampel dan dapat di
lakukan untuk penetapan kuantitatif .
35
Pada sinyal yang simetris dan dalam batasan tertentu juga penetapan kuantitatif
berdasarkan tinggi puncak memungkinkan, tetapi sebaiknya pegukuran
berdasarkan lebar puncak dilakukan karena alasan presisinya lebih baik.
Untuk penetapan kuantitatif suatu analisis, adalah penting bahwa linearitas lebar
puncak suatu substans tergantung pada jumlah / kadar substans. Persyaratan ini
tergantung pada tipe detektor terpenuhinya batas pengukuran terkecil dan terbesar.
Suatu linieritas batas pengukuran yang luas sebagai contoh adalah Flame
Ionisation Detector ( FID )
Sebelum dilakukan analisis kuantitatif, harus diuji apakah detektor bekerja linier
dalam konsentrasi yang diperlukan. Untuk ini diinjeksikan larutan dengan
konsentrasi berbeda – dari zat yang akan dianalisis bersama-sama dengan internal
standar dan buat satu diagram antara lebar puncak yang telah dikoreksi dari
standar internal (berarti perbandingan lebar puncak zat dengan standar) versus
berat. Seharusnya diperoleh garis lurus (linier), yang parameternya dapat dihitung
secara statistik.
36
murni pada saat preparasi sampel. Kemudian barulah larutan standar internal ini
dalam jumlah tertentu ditambah ke dalam larutan sampel yang akan dianalisis.
Tujuan utama dari standar internal adalah untuk mengkoreksi kesalahan dosis
(takaran) yang terjadi pada sampel yang diinjeksikan. Karena standar internal
terdapat dalam konsentrasi yang sama dalam semua larutan, maka lebar puncak
zat yang akan dianalisis dihubungkan dengan lebar puncak dari standar internal.
1. Puncaknya harus terletak pada satu waktu retensi, yang padanya tidak terdapat
zat- zat lainnya
2. Puncaknya sedapat mungkin terletak dekat dengan puncak zat yang akan
dianalisis.
3. Sebaiknya sifat kimianya sama / mirip dengan zat yang akan dianalisis (mis :
sama dalam golongan, gugus fungsi, homolog atau isomer)
4. Keberadaannya dalam zat yang akan dianalisis tidak akan menyebabkan
degradasi / peruraian baik zat yang akan dianalisis maupun ia sendiri
5. Faktor koreksinya sedapat mungkin sama besar dengan faktor koreksi zat yang
akan dianalisis.
6. Tidak boleh terjadi reaksi kimia dengan zat yang dianalisis atau komponen
campuran dalam sampel walaupun pada temperatur tinggi
37
IV. PENETAPAN KADAR DENGAN BAKU DALAM
Sebagai langkah pertama yang harus dilakukan dalam penetapan kadar zat dengan
kromatografi gas adalah menentukan faktor koreksi (f), yang dengan bantuannya
luas area (F) dari baku dalam dan zat yang akan dianalisis dapat dihitung kembali
ke dalam bentuk berat (m). Faktor koreksi kombinasi ini dapat disusun dari
masing-masing faktor koreksi zat yang dianalisis (fi) dan faktor koreksi baku
dalam (fis) sebagai berikut :
f m .F
f i
i is
f is
m .F
is i
Dengan bantuan f maka kadar zat yang akan ditetapkan (mi) dapat dihitung
m .F . f
mi is . i
F is
seperti juga pada setiap analisis penetapan kadar maka pada hasil analisis
penetapan kadar dengan kromatografi gas harus dilakukan pengukuran setiap
sampel beberapa kali dan kemudian dibuat harga rata-ratanya.
38
Contoh : Tetapkan kadar kodein dalam tablet dengan kromatografi gas
menggunakan internal standar. Pada etiket tertera : setiap tablet mengandung 15
mg codein. Gunakan etil morfin sebagai internal standar.
a. Timbang pada neraca kasar 100 mg etil morfin standar, kemudian hasil
penimbangan ini ditimbang pada neraca halus, ternyata beratnya 102.0
mg, larutkan dalam 100.0 ml CHCl3 (disebut larutan is)
Diperoleh data
f m .F
f i
i is
f is
m .F
is i
12,9 x 21919
= 10,2 x30670
0,9039
39
Lebar puncak codein 41036 satuan integrator
m .F . f
mi is . i
10,2 x 41036 x 0,9039
F is
25526
14,8
14,8
x100%
Persentase kondein dalam tablet= 15
= 98,67%
Persyaratan USP XXII NF XVII : Contain not less than 93.0 percent and not more
than 107.0 percent of the labelled amount.
40
DAFTAR BACAAN
41
Pietrzyk, D. J. And Frank, C. W.,.(1979). Analytical Chemistry,
Second Edition, Academic Press, New York – San
Francisco – London, pp 517-539
Willard, H. H., Merritt, Jr. L. L., Dean, J. A., Settle, Jr. F. A., (1988).
Instrumental Methods of Analysis, Seventh Edition,
Wadsworth Publishing Company, Belmont-California A
Division of Wadsworth, Inc. pp 540-579
42