VIROLOGI (TEORI)

METODE DETEKSI INFEKSI VIRUS

Disusun Oleh :
Siti Aliyah
Yuli Permata Sari

POLTEKKES KEMENKES BANTEN TEKNIK LABORATORIUM

MEDIS
Jl. Dr. Sitanala,Komplek SPK Keperawatan Tangerang,RT.002/RW.003,Karang
Sari,Kec.Neglasari,Kota Tangerang,Banten 11610
 METODE DETEKSI INFEKSI VIRUS

1. UJI HEMAGLUTINASI (HA)

Uji HA merupakan uji yang digunakan untuk mendeteksi virus yang

memiliki hemaglutinin. Hemaglutinin ini dapat mengaglutinasi eritrosit
beberapa spesies hewan, salah satunya adalah eritrosit unggas. Uji HA
juga dapat sebagai dasar untuk menentukan titer virus ND (Darminto
1996). Uji HA untuk menentukan titer virus ND didasarkan pada prinsip
kemampuan hemaglutinasi dari virus ND terhadap seldarah merah (Grimes
2002). Sumber virus biasanya berasal dari ekskreta ayam terinfeksi baik
melalui pakan, air minum, lendir, feses, maupun udara yang tercemar
virus, peralatan, dan pekerja kandang. Patogenisitas VND dipengaruhi
oleh galurvirus, rute infeksi, umur ayam, lingkungan, dan status kebal
ayam saat terinfeksivirus. Selama sakit, ayam mengeluarkan virus dalam
jumlah besar melalui feses(Alexander 2001).
Uji HA lambat digunakan untuk mengetahui titer virus, kemampuan virus
dalam menginfeksi yang ditandai dengan adanya hemaglutinasi eritrosit.
Titer virus dapat diketahui dengan melihat sumuran terakhir pada nomor
tertinggi ( end point )yang menunjukkan adanya hemaglutinasi positif. Hal
itu ditandai dengan adanya agregat-agregat di dasar sumur (Stephen,
1980).
Sedangkan, uji HA cepat biasanya dipakai untuk mengidentifikasi virus
yang mampu menghemaglutinasi eritrosit ayam.Uji HA bertujuan untuk
membedakan subtipe HA dan mengukur nilai HA sediaan virus Influenza.
a. Uji HA mempunyai tujuan untuk :
 Mendeteksi perkembangan virus yang mengandung
Hemagglutinin (Seperti virus ND dan AI) melalui sampel eritrosit
baik dengan pengujian cepat atau pengujian lambat.
 Uji HA dapat digunakan untuk mengukur titer antigen.

b. Prinsip Uji Hemaglutinasi (HA)

 Pengujian Hemaglutinasi dilakukan untuk mendeteksi virus yang
memiliki hemagglutinin. Pengujian dilakukan dengan
menggunakan sampel darah berupa eritrosit.
 Jika terdapat endapan homogen pada dasar object glass, maka dapat
dinyatakan HA + (positif). Sebaliknya jika tidak terjadi perubahan
(tidak ada endapan homogen), dapat dinyatakan dengan HA –
negatif).
 Penggumpalan eritrosit terjadi karena asam sialat pada permukaan
eritrosit terikat oleh hemagglutinin yang dimiliki oleh virus.
 Berbagai sifat virus dapat digunakan untuk mengidentifikasi.Salah
satu sifat virus yang dapat digunakan untuk mengidentifikasi tersebut
adalah kemampuan mengaglutinasi sel darah merah virus ND (Tetelo).
Hemagluttinasi (HA) Biasanya disebabkan oleh virion itu sendiri
(partikel virus keseluruhan),namun ada juga yang disebabkan oleh
haemaglutinin yang dihasilkan selama pembiakan virusnya.Virus dapat
mengaglutinasi darah (eritrosit) karena virus mempunyai protein
haemaglutinin pada permukaan virusnya.Haemaglutinin secara spontan
akan melekat pada permukaan sel darah merah yang merupakan
reseptor dari membran eritrosit,sehingga membentuk sebuah jembatan
antara dua sel darah merah. Uji HA (Hemaglutinasi) dapat dilakukan
dengan berbagai metode berdasarkan golongan virus yang akan diuji.
Di antaranya adalah :
1. Uji HA Plate
Pengujian dengan HA Plate digunakan untuk medeteksi keberadaan
virus golongan Myxovirus. Di mana virus golongan ini memiliki
hemagglutinin yang merupakan partikel dari virion itu sendiri
Selain itu, virus golongan ini memiliki enzim neuraminidase yang
dapat melepas ikatan hemagglutinin dengan permukaan
eritrosit.Hal tersebut membuat ikatan virus dan eritrosit hanya
bersifat sementara.

2. Uji HA Mikrotiter
Uji HA Mikrotiter digunakan untuk mengetahui seberapa besar titer
antigen. Selain itu, pengujian ini juga digunakan untuk retritasi
antigen, apakah antigen tersebut memiliki titer 4 HA unit yang
dikehendaki atau tidak.Karena titer 4 HA tersebut penting dalam uji
HI (Hemaglutinasi Inhibisi).

3. Pengujian HA Tabung
Tujuan dari pengujian HA Tabung sama dengan pengujia HA Plate,
yaitu untuk mendeteksi ada tidaknya virus dari golongan
Myxovirus. Namun, uji HA Tabung juga dapat digunakan untuk
mengetahui titer antigen suatu virus.

c. Langkah Kerja Uji Hemaglutinasi (HA)

Alat dan Bahan :
 Multichanel micropippet volume 10-50 ml
 Singlechanel micropipepet volume 10-50 ml
 Microtips volume 50 ml
 Microplate 96 well type V
 Sampel Virus / Antigen
 Pelarut PBS (Phosphate Buffer saline ) (-) 0.01 M steril,ph 7-7.4
 RBC 1 %
Prosedur :

 Masing masing well dari microplate,diisi larutan PBS (-) sebanyak

0.025 ml
 Dengan menggunakan singlechanel micropippete,tambahkan 0.025
ml sampel virus / antigen pada well No. 1 yang sudah terisi 0.025
ml PBS
 Dengan menggunakan multichannel,kocok well No. 1 sampai
homogen,ambil 0,025 ml dan masukan ke well No.2 kemudian
kocok.Lakukan langkah ini sampai dengan well No.11, pada well
No. 11 setelah pengocokan larutan dibuang 0.025 ml.Well No.12
sebagai kontrol RBC.

 Tambahkan 0.025 ml PBS (-) Kedalam semua well

 Tambahkan RBC 1% kedalam tiap well sampai dengan control
RBC (Well No. 12),campur dengan baik secara manual (ketuk
ketuk secara perlahan tepi microplate pada setiap sisinya atau
dengan mnggerakkannya dalam bentuk angka 8).
 Biarkan disuhu ruang 45 menit.Baca hasilnya dengan mengamati
pengenceran tertinggi yang memperlihatkan aglutinasi
sempurna,titer ini direpresentasi sebagai 1 HA Unit (HAU).
 Uji HA dengan pelat mikro ini bertujuan untuk mengetahui jumlah
titer virus. Titer virus adalah pengenceran tertinggi dari virus yang
masih mampu mengaglutinasi eritrosit. Pada uji HA dapat diamati
bentuk hemaglutinasi eritrosit pada dasar wall. Uji positif ditandai
dengan terbentuknya endapan seperti bunga, uji negatif ditunjukkan
dengan terbentuknya endapan eritrosit di dasar tabung.

d. Pernbacaan dilakukan dengan cara sebagai berikut:

Pada lubang yang rnenampakkan terjadinya endapan seperti pada
lubang kontrol negatif dinyatakan negatif HA, sedangkan yang
menunjukkan terjadinya aglutinasi (penggumpalan BDM) dinyatakan
positif HA. Untuk memudahkan pembacaan, pelat rnikrotiter
dimiringkan 45 derajat. Penghitungan HA unit dilakukan dengan cara
menghitung lubang yang positip dimulai dan enceran yang paling
pekat (lubang pertama). Apabila aglutinasi terjadi sampai pada lubang
ke-6, maka titer HA dinyatakan dengan nilai 26 yaitu sama dengan 64
HA (Kurniadi 2002). Gambar ilustrasi HA dan HI

2. UJI HAMBATAN AGLUTINASI

Haemagglutination Inhibiton (HI) atau Hambatan Hemaglutinasi
merupakan pengujian yang ditujukan untuk mengetahui titer antibodi, baik
antibodi karena kasus infeksi maupun antibodi hasil vaksinasi. Uji
Haemaglutonation Inhibition (HI) merupakan yang digunakan pada virus –
virus yang yang mempunyai sisi Ag yang dapat berikatan dengan BDM
yaitu ND, EDS'76 dan 113 . Oleh sebab itu cara uji HI dimodifikasi
terlebih dahulu misalnya sisi Ag atau Ab dimodifikasi terlebih dahulu
sehingga dapat terjadi reaksi aglutinasi, misalnya pada virus Infectious
Bronchitis (IB). Pada prinsipnya metode HI ini merupakan reaksi ikatan
Ab yang terkandung dalam serum yang diperiksa dengan jumlah Ag ND
atau EDS'76 yang digunakan sebanyak 4 HAU.
Menurut Indriani (2004), menyatakan bahwa fungsi uji HI untuk
mengetahui adanya respon antibodi terhadap antigen virus patogen pada
hewan dan mengetahui korelasi antara titer antibodi dan ketahanan pada
uji tantang dengan virus patogen. Menurut Nuradji (2008) menyatakan
bahwa keberadaan virus yang mampu mengaglutinasi sel darah merah
ayam aitu virrrus AI, ND, dan EDS ( Egg Drop Syndrome). Faktor yang
mempengaruhi hasil uji HI yaitu kesesuaian subtype virus vasin yang
digunakan dalam vaksin, faktr penyimpanan, dan prosdur kerja dengan
SOP yang telah ditetapkan akan berpengaruh pada uji HA dan HI
(Heryanto 2010).

a. Prinsip Uji Hemaglutinasi Inhibisi (HI)

 Haemagglutination Inhibiton (HI) atau Hambatan Hemaglutinasi
merupakan pengujian yang ditujukan untuk mengetahui titer
antibodi, baik antibodi karena kasus infeksi maupun antibodi hasil
vaksinasi.
 Uji HI juga bermanfaat untuk melakukan indentifikasi virus dengan
menerapkan prinsip antibodi spesifik.
 Berbeda dengan uji HA, uji HI menunjukkan hasil positif apabila
terdapat endapan eritrosit. Sedangkan hasil negatif ditunjukkan
tanpa adanya endapan eritrosit.

b. Tujuan Uji Hemaglutinasi Inhibisi (HI)

 Uji HI dapat digunakan untuk mengukur titer antibodi atau
antiserum agar diketahui status kekebalan tubuh setelah dilakukan
vaksinasi virus.
 Uji HI dapat digunakan untuk mengidentifikasi suatu virus
menggunakan antigen spesifik.

Hemagglutination Inhibiton Test (HI Test) merupakan uji penghambatan

aglutinasi sel darah merah (SDM) karena terjadi penghambatan
kemampuan untuk menggumpalkan dari virus oleh antibodi yang sejenis.
Uji ini bertujuan untuk identifikasi atau pengenalan jenis antigen tertentu
(dengan mereaksikannya dengan antibodi yang diketahui), dan mengetahui
jenis antibodi dan titernya yang terdapat dalam contoh sera (dengan
mereaksikannya dengan antigen yang diketahui). Uji ini memiliki dua
macam cara, yaitu cara alpha (jumlah sera tetap sedangkan virus
diencerkan) dan cara beta (sera diencerkan sedangkan virus diencerkan).
berdasarkan besar-kecilnya reagen yang digunakan, uji ini bisa
menggunakan cara makro (volume dalam ml) dan cara mikro (volume
dalam mikroliter). Uji HI (Hemaglutinasi Inhibisi) dilakukan dengan
berbagai metode berdasarkan golongan virus yang akan diuji atau
tergantung dari tujuan pelaksanaan pengujian. Pengujian tersebut meliputi:

1. Uji HI Plate
Pengujian ini berfungsi untuk mengidentifikasi virus. Dengan
menerapkan memberikan antiserum yang telah diketahui
sebelumnya. Apabila antiserum yang diberikan spesifik dengan
virus yang dimaksud (homolog), maka tidak akan terjadi peristiwa
hemaglutinasi. Hal itu karena virus telah terikat oleh antiserum.
Pengujian ini dilakukan dengan menggunakan ‘Object Glass’.

2. Uji HI Makroteknik
Pengujian masih menggunakan pronsip HI yang sama, hanya saja
prosedurnya dilakukan menggunakan tabung reaksi. Pengujian ini
bertujuan untuk mengetahui titer suatu antibodi atau anti serum.

3. Uji HI Mikroteknik
Uji HI Mikroteknik sama tujuannya dengan uji HI Mikroteknik,
hanya saja prosedurnya dilakukan pada microplate.

c. Langkah Kerja Uji Hambatan Aglutinasi (HI)

Alat dan Bahan :
 Multichanel micropippet volume 10-50 ml
 Singlechanel micropipepet volume 10-50 ml
 Microtips volume 50 ml
 Microplate 96 well type V
 Pelarut PBS (Phosphate Buffer saline ) 0.01 M steril,ph 7.2
 RBC 1 %
 Serum uji yang telah diinaktifasi pada waterbath 56oC Selama 30
menit.
 Antigen,titer 4 HAU.
Cara Membuat antigen 4HAU: Sebelum penambahan antigen pada
uji HI, antigen tersebut di lakukan uji HA utuk mengetahui titer
awal dari antigen tersebut
-Dilakukan Uji HA
-Setelah diketahui titer awal dari antigen (misal titernya log 29 atau
512) kemudian untuk mendapatkan 4HAU, antigen diencerkan
dengan larutan PBS Caranya:
 Jika titer antigen 512
Maka untuk dijadikan 4 HAU adalah:
512 : 4 = 128 (128 kali)
Untuk menjadikan 4HAU adalah 1 bagian antigen diencerkan
dengan 127 bagian larutan PBS (1 ml antigen + 127 ml PBS)
-Untuk memastikan titer antigen HAU,antigen yang telah
diencerkan lakukan uji HA kembali.

Prosedur :
 Kedalam microplate,masukan 0.025 ml PBS dari well No. 1
hingga well No.12
 Tambahkan 0.025 ml serum uji pada well No. 1 yang sudah
terisi 0.025 ml PBS
 Dihomogenkan ambil 0.025 ml dari well No.1 dan masukan ke
well No.2 kemudian kocok.Lakukan langkah ini sampai
dengan well No.11, pada well No. 11 setelah pengocokan
larutan dibuang 0.025 ml.Well No.12 sebagai kontrol RBC.

 Tambahkan 0.025 ml 4HAU antigen kesemua well kecuali

well ke12, kocok dan simpan disuhu ruang selama 30 menit.
 Tambahkan 0.025 ml RBC 1% kesemua well.
 campur dengan baik secara manual (ketuk ketuk secara
perlahan tepi microplate pada setiap sisinya atau dengan
mnggerakkannya dalam bentuk angka 8).
 Biarkan disuhu ruang 45 menit dan baca titer antibodinya
dengan cara memiringkan plate dengan kemiringan 45o .
 Uji HI menunjukkan hasil positif apabila terdapat endapan
eritrosit. Sedangkan hasil negatif ditunjukkan tanpa adanya
endapan eritrosit.

d. Contoh Penyakit dengan uji HA – HI test

 Tetelo / Newcastle Disease
 Avian influenza (AI)
 CRD (Chronic Respiratory Disease
 Infectionis Bronchitis.

3. ENZYME IMMUNO ASSAY (EIA)

Enzyme Immunoassay (EIA) adalah tes untuk mendeteksi antigen atau
antibodi dengan penambahan substrat sehingga terjadi perubahan
warna.Pada Enzyme Immunoassay (EIA), molekul enzim berkonjugasi
dengan antibodi detektor sekunder, yang akan berikatan dengan
kompleks antigen-antibodi primer. Ketika substrat ditambahkan maka
enzim akan mengkatalisasi produksi end-product yang berwarna,yang
dapat diamati dan diukur. Sistem EIA yang paling banyak tersedia
secara komersial memerlukan pemisahan antigen spesifik dari kompleks
non spesifik. Sistem tersebut disebut solid phase immunosorbent assay
(SPIA) atau enzyme-linked imunosorbent assay (ELISA).Pemisahan
dapat dicapai dengan ikatan antigen atau capture antibody pada permukaan
solid/padat seperti polistiren mikrotiter plate, latex bead, atau magnetik
bead. Matriks padat juga memungkinkan pemisahan dengan melakukan
pencucian ulang untuk meminimalisir ikatan nonspesifik.

a. Prinsip Dasar :
EIA/ELISA menggunakan konsep dasar imunologi yaitu terikatnya
suatu antigen terhadap antibodinya yang spesifik, yang kemudian
dapat mendeteksi antigen dalam jumlah yang sangat sedikit seperti
 protein, peptida, hormon atau antibodi pada sampel. Antigen bereaksi
pada antibodi dalam serum pasien. Manik atau plat kemudian di
inkubasi oleh sebuah gabungan enzim–antibodi berlabel jika terdapat
antibodi, gabungan terebut bereaksi dengan antigen-antiodi pada
manik atau plat. Aktivitas anzim di ukur dengan spektrofotometer
setelah penambahan substrat kromogenik.
b. Tipe Enzyme Immuno Assay (EIA)
1. Deteksi antigen
EIA tipe deteksi antigen terdiri atas 4 langkah :
 Antibodi yang spesifik terhadap antigen dilekatkan pada suatu
permukaan fase padat (a solid-phase surface) atau suatu
manik-manik palstik.
 Ditambahkan serum pasien yang mungkin mengandung atau
tidak mengandung antigen.
 Ditambahkan suatu antibodi yang spesifik terhadap antigen
tertentu yang berlabel enzim ( konjugat)
 Ditambahkan substrat kromogenik, dan terjadi perubahan
warna jika terjadi perubahan warna. Warna yang ter bentuk
sesuai dengan jumlah antigen yang terdapat sampel pasien.

2. Deteksi antibodi
EIA antibody detection terdiri dari 3 tipe yaitu noncompetitive
EIA, competitive EIA, dan capture EIA

Enzim immunoassays, seperti ELISA langsung ditunjukkan di sini,

menggunakan enzim-antibodi konjugasi untuk memberikan substrat
terdeteksi ke situs antigen. Substrat mungkin merupakan molekul tidak
berwarna yang diubah menjadi produk akhir berwarna atau molekul
fluorescent tidak aktif yang fluoresces setelah aktivasi enzim. (kredit:
modifikasi pekerjaan oleh "Cavitri"/Wikimedia Commons). Dalam EIAs,
substrat untuk enzim paling sering kromogen, molekul tidak berwarna
yang diubah menjadi produk akhir berwarna. Enzim yang paling banyak
digunakan adalah alkali fosfat dan peroxidase lobak yang substrat yang
sesuai tersedia. Dalam beberapa EIAs, substrat adalah fluorogen, molekul
nonfluorescent yang diubah enzim menjadi bentuk fluorescent. EIAs yang
 menggunakan fluorogen disebut fluorescent enzim immunoassays
(FEIAs). Fluoresensi dapat dideteksi oleh mikroskop fluoresensi atau
spektrofotometer.
Enzim immunoassays (EIA) digunakan untuk memvisualisasikan
danmengukur antigen. Mereka menggunakan antibodi yang
dikonjugasikan ke enzim untuk mengikat antigen, dan enzim mengubah
substrat menjadi produk akhir yang dapat diamati. Substrat mungkin
kromogen atau fluorogen.

4. NUCLEIC ACID TEST (NAT)/ NUCLEIC ACID AMPLIFICATION

TEST (NAAT)
NAT adalah teknologi uji saring yang mampu mendeteksi keberadaan
DNA/RNA virus dengan window period atau masa jendela yang lebih
pendek, sehingga mampu meningkatkan keamanan darah secara
signifikan.

Cara Pemeriksaan Metode NAT

Cara kerja NAT, melalui pemanasan terjadi pelepasan RNA dari sel. Lalu,
RNA akan ditangkap oleh capture probes yang dibawa oleh microparticle
magnetic yang kemudian dihibridasi. Adapun, pencucian akan
menghilangkan komponen plasma danDNA/RNA nonspesifik dan
meminimalisasi gangguan substansi-substansi lain.
Cara kerja uji saring NAT sendiri meliputi beberapa tahapan yaitu
screening darah yang dilakukan secara paralel dengan menggunakan alat
yang diberi nama CHLIA (Chemiluminescent Immuno Assay) dan
dilanjutkan menggunakan mesin NAT. Uji saring NAT mampu
mendeteksi virus lebih dini meskipun kadar virus di dalam darah sangat
rendah. Uji saring NAT mampu mengurangi masa jendela infeksi antara
61 persen hingga 96 persen, karena kemampuannya mendeteksi
DNA/RNA virus yang berada dalam darah jauh sebelum antigen dan
antibodi terdeteksi sehingga risiko IMLTD akan semakin kecil.
NAAT HIV-1 (Nucleic Acid Amplification Test) Menemukan RNA
virus atau DNA proviral yang banyak dilakukan untuk diagnosis pada
anak usia kurang dari 18 bulan. Karena asam nuklet virus mungkin berada
dalam jumlah yang sangat banyak dalam sampel. Pengujian RNA dan
DNA virus dengan amplifikasi PCR, menggunakan metode enzimatik Tes
reaksi berantai polymerase (PCR) merupakan teknik deteksi berbasis asam
nukleat (DNA dan RNA) yang dapat mendeteksi keberadaan materi
genetic HIV di dalam tubuh manusia. Tes ini sering dikenal sebagai tes
beban virus atau tes amplifikasi asam nukleat (HIV NAAT).
 DAFTAR PUSTAKA

Prinsip Dan Langkah Kerja Uji HA Dan HI » VETMEDICINAE

Laporan UJI HA HI (scribd.com)

20.4: Enzyme Immunoassays (EIA) and Enzyme-Linked Immunosorbent Assays

(ELISA) - Biology LibreTexts
(PDF) TEKNIK ENZIM IMMUNOASSAY (researchgate.net)
Uji Saring NAT, Alat Ini Pastikan Darah Donor Bebas dari Virus (suara.com)