TITRASI FORMAL ASAM AMINO

Pande Putu Diah Suci Laksmi

1813081002
Prodi Kimia, Jurusan Kimia
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Universitas Pendidikan Ganesha
pande.diah@undiksha.ac.id

ABSTRAK
Hidrolisis protein dapat dilakukan dengan menggunakan enzim protease dari tripsin. Protein jika
dihidrolisis akan menghasilkan asam amino bebas. Asam amino bebas ini bila direaksikan dengan
formaldehid berlebih akan membentuk derivat metilol. Dengan terbentuknya derivat metilol berarti gugus
amino dari protein sudah terikat dan tidak akan mempengaruhi titik akhir titrasi sehingga titik akhir titrasi
dapat ditentukan dengan tepat. Indikator yang digunakan adalah fenolftalein. Pada percobaan ini
dilaksanakan praktikum mengenai titrasi formal asam amino dengan tujuan untuk menentukan derajat
hidrolisis suatu protein melalui titrasi formal asam amino, untuk menghidrolisis protein dengan enzim
protease dan untuk membuat kurva hubungan antara volume NaOH terhadap waktu dan kurva mg nitrogen
asam amino terhadap waktu pada titrasi formal asam amino. Metode yang digunakan adalah metode
eksperimen dengan menggunakan data sekundernya yang mana dilakukan titrasi pada interval waktu 0, 15,
30, 45, 60, 75, dan 90 menit dengan menggunakan NaOH 0,02 M terhadap larutan campuran gelatin dan
tripsin. Hasil yang diperoleh dalam percobaan ini adalah nilai derajat hidrolisis suatu protein melalui
titrasi formal asam amino adalah sebesar 0,02. Larutan protein (gelatin) dapat dihidrolisis dengan
menggunakan tripsin (enzim protease). Kurva hubungan antara volume NaOH terhadap waktu dan kurva
mg nitrogen asam amino terhadap waktu pada titrasi formal asam amino berbanding lurus yang mana
jumlah asam amino yang terurai bertambah sesuai dengan pertambahan waktu dapat dibuktikan dengan
meningkatnya penggunaan NaOH dalam titrasi seiring pertambahan waktu maka semakin banyak pula mg
nitrogen dari asam amino yang dihasilkan. Peningkatan jumlah mg asam amino terjadi seiring dengan
bertambahnya waktu kontak antara larutan gelatin dengan larutan tripsin.

Kata kunci : asam amino, formaldehida, titrasi formal

ABSTRACT
Protein hydrolysis can be performed using protease enzyme of trypsin. If hydrolyzed protein will
result in free amino acids. These free amino acids when reacted with excess formaldehyde to form methylol
derivatives. With the formation of methylol derivatives means that the amino group of the protein is bound
and will not affect the titration end point so that the titration end point can be determined precisely.
Indicator used is fenolftalein. In this experiment, a practicum was carried out regarding formal titration of
amino acids with the aim of determining the degree of hydrolysis of a protein through formal titration of
amino acids, to hydrolyze proteins with protease enzymes and to create a curve of the relationship between
NaOH volume against time and the mg nitrogen amino acid curve against time at titration formal amino
acids. The method used is an experimental method using secondary data in which the titration is carried out
at intervals of 0, 15, 30, 45, 60, 75, and 90 minutes using 0.02 M NaOH against a mixture of gelatin and
trypsin solution. The result obtained in this experiment is the value of the degree of hydrolysis of a protein
through formal titration of amino acids is 0.02. Protein solution (gelatin) can be hydrolyzed by using trypsin
(protease enzyme). The relationship curve between the volume of NaOH against time and the mg curve for
amino acid nitrogen with time in the formal titration of amino acids is directly proportional in which the
number of amino acids decomposed increases with time. It can be proven by the increasing use of NaOH in
the titration over time, the more mg nitrogen from the resulting amino acid. The increase in the number of
mg of amino acids occurs with increasing contact time between the gelatin solution and the trypsin solution.

Keywords: amino acids, formaldehyde, formal titration

1
PENDAHULUAN
Kata protein berasal dari bahasa
Yunani yaitu dari akar kata protos atau
proteos yang artinya pertama atau yang
paling utama. Protein merupakan senyawa
organik kompleks yang memiliki berat
molekul tinggi yang merupakan suatu
polimer yang mana monomer-monomernya
terdiri dari asam amino yang dihubungkan
dengan ikatan peptida. Pada molekul
protein mengandung karbon, hidrogen,
oksigen nitrogen dan untuk beberapa jenis
kadang kala mengandung sulfur dan fosfor.
Suatu molekul protein disusun oleh
sejumlah asam amino tertentu dengan
susunan yang khas dan bersifat turunan
(Aisjah Girindra, 1986).
H3N+CHRCOO- ↔ H2NCHRCOO- + H+
H2NCHRCOO- + 2 HCHO ↔ (HOCH2)2NCHRCOO-
+
H yang terlepas pada reaksi tersebut dapat
dititrasi langsung dengan menggunakan
NaOH sampai pH 8.0 (titik akhir indikator
fenolftalein). Titrasi asam amino atau
campuran asam amino dalam keberadaan
formaldehid disebut dengan titrasi formal
asam amino. Titrasi ini merupakan metode
analisis untuk mengikuti pembentukan
asam amino bebas yang dihasilkan pada
proses hidrolisis protein oleh enzim
proteotik. Protein dihidrolisis akan tidak memungkinkan juga dititrasi dengan
didapatkan asam aminonya. Hidrolisis suatu
protein dapat dilakukan dengan
menggunakan enzim protease dan tripsin.
Tripsin adalah suatu enzim proteolitik atau
enzim yang mengkatalisis hidrolisis
protein. Tripsin mengkatalisis hidrolisis
ikatan amida di bagian karboksil dari lisin
atau arginin (Fessenden, 2010). Selama
proses hidrolisis dari suatu protein
berlangsung, sejumlah gugus karboksil dan
gugus amino akan terus bertambah.
Penentuan secara kuantitatif salah satu
gugus akan dapat memberikan indikasi
untuk mengetahui derajat hidrolisis suatu
Untuk mendapatkan suatu asam
amino yang merupakan penyusun dari suatu
protein, dapat dilakukan dengan cara
menghidrolisis larutan protein tersebut.
Hidrolisis suatu protein dapat dilakukan
dengan menggunakan suatu enzim protease
yang berasal dari tripsin. Apaliba suatu
protein dihidrolisis maka akan
menghasilkan suatu asam amino bebas.
Asam amino bebas yang dihasilkan jika
direaksikan dengan formaldehida berlebih
akan membentuk derivat metilol. Reaksi
tersebut menyebabkan asam amino bebes
bentuk isoelektrik kehilangan sati proton
dari gugus NH3+.
protein. Menurut teori zwitter ion, jika
suatu asam amino dalam larutan dititrasi
dengan basa, maka ion hidrogen dari
ammonium yang dititrasi. Gugus
ammonium dari asam amino bersifat buffer
pada daerah pH tinggi yaitu diatas pH 11
sehingga tidak memungkinkan untuk
dititrasi sampai titik akhir. Hal yang sama
juga terjadi pada gugus karboksil yang
bersifat buffer pada pH rendah sehingga
basa.
Untuk mengatasinya,
penambahan formaldehid kedalam
larutan asam amino bertujuan agar
dapat bereaksi dengan gugus amino
yang tidak bermuatan sehingga
dapat memungkinkan untuk gugus
ammonium membuffer pada daerah
pH lebih rendah dan dapat dititrasi
pada titik akhir secara kuantitatif
menggunakan suatu indikator.
Adapun reaksi yang terjadi selama
titrasi formal asam amino
berlangsung adalah :
2
 O O
H NaOH H
R C C R C C

NH2 OH +NH O-
3

pada pH netral
H
O
H
+ R C COOH
R C C CH2O

+NH O- N
3
HOH2C CH2OH

formalin dimetilol
H H O

R C COOH + NaOH R C C

N N ONa
HOH2C CH2OH HOH2C CH2OH
Gambar 1. Reaksi Keseluruhan Titrasi Formal Asam Amino

Larutan asam amino yang ditambahkan
dengan formalin akan membentuk dimetilol.
Terbentuknya dimetilol menandakan bahwa
gugus asam amino dari protein telah terikat
dan tidak akan mempengaruhi titik akhir titrasi
sehingga titik akhir titrasi akan dapat
ditentukan dengan tepat (Tika, 2010).
Reagen yang digunakan adalah gelatin
yang mana gelatin merupakan produk alami
yang diperoleh dari hidrolisis parsial
kolagen. Gelatin adalah protein yang larut
yang bersifat gelling agent (bahan pembuat
gel). Gelatin berasal dari glisin dengan
komposisi besar, protein dan 4-hidroksi
residu. Adapun struktur gelatin adalah
sebagai berikut :

Gambar 2. Struktur Gelatin

METODE formaldehida 40%, 25 mL larutan tripsin

Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan dalam
praktikum ini terdiri dari 3 buah gelas kimia
100 mL, 3 buah Erlenmeyer 100 mL, 1 set
buret dan statif, 1 buah spatula, 1 buah
batang pengaduk, 2 buah labu ukur 100 mL,
1 buah pipet ukur 25 mL, 1 buah kaca
arloji, 1 buah termometer, 1 buah pemanas
listrik, 2 buah pipet tetes,dan 1 buah labu
ukur 25 mL.
Serta bahan-bahan yang digunakan
100 mL larutan gelatin 5%, 100 mL larutan
NaOH 0,2 M, 50 mL larutan HCl 0,1 M,
indikator PP 1% secukupnya, 75 mL larutan
1%, dan aquades secukupnya.
Prosedur Kerja
Persiapan Larutan Gelatin
Sebanyak 100 mL larutan gelatin
disiapkan dan ditambahkan dengan 1 mL
indikator fenolftalein dan juga ditambahkan
dengan tetes demi tetes larutan NaOH 0,2
M hingga timbul warna merah muda.
Kemudian larutan HCl 0,1 M ditambahkan
tetes demi tetes kedalam larutan gelatin
yang berwarna merah muda hingga warna
merah menghilang. Larutan tersebut
selanjutnya direndam di dalam inkubator air
pada suhu 38˚C selama beberapa menit.

3
Persiapan Larutan Tripsin
Sebanyak 25 mL larutan tripsin
ditambahkan dengan beberapa tetes
indikator fenolftalein dan tetes demi tetes
larutan NaOH 0,2 M sampai timbul warna
merah muda. Kemudian larutan tripsin yang
berwarna merah muda ditambahkan dengan
larutan HCl 0,1 M tetes demi hingga warna
merah menghilang. Selanjutnya larutan
diinkubasi pada inkubator air pada suhu
38˚C selama beberapa menit.
Titrasi Formal Asam Amino
Larutan tripsin ditambahkan
kedalam larutan gelatin dan diaduk secara
perlahan. Setelah tercampur merata, 10 mL
campuran diambil dan dimasukkan ke
dalam erlenmeyer 100 mL yang mana
larutan ini nantinya akan digunakan sebagai
kontrol atau waktu nol. Larutan tersebut
dididihkan yang bertujuan untuk merusak
enzimnya, setelah mendidih kemudian
didinginkan. Larutan yang telah
didinginkan kemudian ditambahkan dengan
15 mL formalin netral dan 3 tetes
fenolftalein dan dititrasi dengan
menggunakan NaOH 0,2 M. Pada interval
waktu 15, 30, 45, 60, 75, 90 menit dari
waktu nol dilakukan hal yang sama seperti
pada kontrol.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pada praktikum ini dilakukan titrasi
formal asam amino yaitu suatu titrasi asam
amino atau campuran asam amino dalam
keberadaan formaldehida. Prinsip dasar dari
titrasi formal asam amino adalah titrasi
asama basa sehingga formalin, tripsin, dan
gelatin yang digunakan dalam percobaan
harus berada dalam keadaan netral agar
nantinya tidak mengganggu hasil
percobaan. Larutan gelatin ditambahkan
dengan larutan fenolftalein (PP) dan larutan
NaOH 0,2 M hingga timbul warna merah
muda bertujuan agar larutan gelatin berada
dalam sifat basa yang kemudian akan
ditambahkan dengan larutan HCl 0,1 M
sampai warna merah muda larutan
menghilang yaitu pada pH 8,0. Larutan
gelatin dapat bereaksi secara sempurna
dengan enzim protease yaitu tripsin pada
pH 8,0 yang mana pH tersebut merupakan
pH optimum bagi suatu enzim untuk
menghasilkan asam amino. Perlakuan yang
sama juga dilakukan terhadap larutan enzim
protease yaitu tripsin.
Tahap awal dari praktikum ini adalah
melakukan preparasi larutan gelatin.
Larutan gelatin dibuat dengan cara
melarutkan serbuk gelatin yang berwarna
kuning ke dalam aquades. Campuran
tersebut kemudian dipanaskan yang
bertujuan agar serbuk gelatin lebih mudah
untuk larut dalam aquades. Larutan yang
terbentuk setelah dipanaskan adalah larutan
berwarna kuning bening.
Larutan gelatin yang sudah larut
dengan sempurna selanjutnya ditambahkan
dengan indikator fenolftalein (PP) yang
bertujuan untuk mengetahui perubahan pH
yang terjadi pada sistem larutan. Setelah
ditambahkan indikator fenolftalein larutan
tidak berubah warna. Larutan gelatin yang
sudah ditambahkan dengan indikator
fenolftlein, kemudian ditambahkan tetes
demi tetes larutan NaOH 0,2 M yang mana
penambahan larutan ini mengakibatkan
larutan gelatin berubah warna menjadi
merah muda. Larutan gelatin yang
berwarna merah muda kemudian
ditambahkan dengan HCl 0,1 M tetes demi
tetes yang bertujuan untuk membuat larutan
tersebut mencapai pH 8, karena sebelumnya
dilakukan penambahan NaOH yang
membuat larutan bersifat basa, penambahan
ini menyebabkan larutan kembali berwarna
kuning bening. Penambahan HCl hingga
pH 8 dilakukan sebab pada pH ini
merupakan pH yang optimum bagi enzim
tripsin untuk bekerja optimal. Selanjutnya
larutan gelatin diinkubasi pada inkubator air
pada suhu 380C yang bertujuan agar enzim
protease dapat bekerja secara optimal.
Hal yang sama juga dilakukan pada
larutan tripsin. Yang mana larutan tripsin
ditambahkan dengan indikator fenolftalein.
Tujuan dari ditambahkannya indikator
fenolftalein adalah untuk mengetahui
perubahan pH yang terjadi pada sistem
larutan. Setelah ditambahkan indikator
larutan tidak mengalami perubahan warna.
Larutan tripsin yang sudah ditambahkan
indikator fenolftlein, kemudian
ditambahkan dengan larutan NaOH 0,2 M
tetes demi tetes. Penambahan NaOH ini
4
mengakibatkan larutan tripsin berubah
warna menjadi merah muda. Larutan tripsin
yang berada dalam keadaan berwarna
merah muda kemudian ditambahkan
dengan HCl 0,1 M tetes demi tetes yang
menyebabkan larutan kembali ke warna
semula. Penambahan HCl bertujuan agar
larutan tersebut mencapai pH 8, karena
sebelumnya dilakukan penambahan NaOH
yang membuat larutan bersifat basa.
Penambahan HCl hingga pH 8 dilakukan,
karena pada pH ini merupakan pH optimum
bagi enzim tripsin untuk bekerja optimal.
Proses praktikum dilanjutkan yang
mana larutan tripsin dan larutan gelatin
dicampur dan diaduk perlahan.
Pencampuran kedua larutan ini akan
menghasilkan larutan berwarna putih
kekuningan. Penambahan larutan tripsin
kedalam larutan gelatin dapat
menghidrolisis protein khususnya gelatin.
Larutan tripsin digunakan dalam hidrolisis
protein bertujuan agar tripsin yang terdapat
enzim protease yang mampu menghidrolisis
protein dengan memotong ikatan peptida
pada sisi C dari gelatin yang menghasilkan
asam amino bebas yang nantinya akan
dapat dititrasi. Campuran larutan gelatin
dan tripsin yang telah homogen dipanaskan
hingga mendidih yang bertujuan untuk
merusak enzim sehingga reaksi akan
terhenti. Larutan yang telah mendidih
kemudian didinginkan dan ditambahkan
dengan 15 mL formalin netral dan 3 tetes
fenolftalein. Larutan ini digunakan sebagai
larutan standar karena diambil pada menit
ke-nol. Pengambilan campuran ini diulangi
sebanyak 6 kali pada interval waktu tertentu
yaitu pada menit ke-15, menit ke-30, menit
ke 45, menit ke-60, menit ke-75, dan menit
ke-90. Masing-masing campuran pada
interval waktu tersebut diperlakukan
dengan sama seperti hal yang dilakukan
terhadap kontrol. Tujuan dari penambahan
formalin adalah agar gugus amino yang
tidak bermuatan bereaksi denga formalin
sehingga akan memungkinkan gugus
amonium mem-buffer di daerah pH yang
lebih rendah serta akan dapat dititrasi pada
titik akhir secara kuantitatif menggunakan
suatu indikator. Jika tidak ditambahkan
dengan formaldehid maka gugus amonium
dari asam amino akan bersifat buffer pada
daerah pH tinggi yaitu diatas pH 11
sehingga tidak memungkinan dilakukan
titrasi sampai titik akhir. Hal yang sama
juga terjadi pada gugus karboksil yang
bersifat buffer pada pH rendah sehinga
tidak mungkin dititrasi dengan basa.
Reaksi yang terjadi pada titrasi dengan
menggunakan formalin merupakan reaksi
pembentukan dimetilol. Dengan
terbentuknya dimetilol ini, berarti gugus
aminonya sudah terikat dan tidak akan
mempengaruhi reaksi yang terjadi antara
gugus asam (karboksil) dengan basa
(NaOH) sehingga titik akhir titrasi dapat
diakhiri dengan tepat. Bila titik akhir titrasi
diperoleh tepat, maka akan terjadi
perubahan warna larutan dari bening
menjadi merah muda.
5
 Gambar 3. Pembentukan Dimetilol
NaOH yang diperlukan pada menit ke- 0,
Daya hidrolisis dapat ditentukan 15, 30, 45, dan 60 adalah sebagai berikut :
dengan membuat kurva hubungan antara
volume NaOH yang dipergunakan dalam
titrasi terhadap waktu. Selama melakukan
titrasi formal asam amino adapun volume
Tabel 1. Hubungan Waktu dengan Volume NaOH
Waktu Volume NaOH
0 menit 0,6 mL
15 menit 0,8 mL
30 menit 1,3 mL
45 menit 1,4 mL
60 menit 1,9 mL
75 menit 2,1 mL
90 menit 2,5 mL

Berdasarkan data diatas, maka dapat dibuat diperlukan terhadap waktu yaitu sebagai
kurva hubungan antara volume NaOH yang berikut :

Kurva Titrasi
3 2.5
2.5 2.1
volume NaOH

1.9
2
1.3 1.4
1.5
10.6 0.8
0.5
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Waktu
volume NaOH
Linear (volume NaOH)
Gambar 4. Kurva Hubungan antara Volume NaOH yang DiperlukanTerhadap Waktu

Dalam kurva tersebut dapat dilihat bereaksi. mg nitrogen asam amino

bahwa semakin lama larutan menyatakan bahwa jumlah asam amino
didiamkan maka akan semakin banyak yang dapat dihidrolisis oleh enzim tripsin.
volume NaOH yang diperlukan untuk Dalam penentuan massa nitrogen asam
mentitrasi larutan asam amino
tersebut. Daya hidrolisis dari enzim amino, diasumsikan bahwa larutan NaOH
tripsin dalam titrasi formal adalah : 0,1 N sebanyak 1 mL sebanding dengan 1,4
2,5−0,6 mg nitrogen asam amino, sehingga
tg= konsentrasi NaOH 0,02 M yang sama
90
1,9 dengan 0,02 N sebanding dengan 0,28 mg
tg=
90 nitrogen asam amino, dengan
tg=0,021 perhitungannya sebagai berikut :
Berdasarkan dari hasil titrasi tersebut, 0,02 N x mg
=
maka dapat dibuatkan kurva mg nitrogen 0,1 N 1,4 mg
asam amino terhadap waktu yang 0,1 x=0,02 8
diperlukan bagi larutan gelatin untuk x=0,28 m g

6
 Jadi, 1 mL NaOH 0,02 N ekivalen  Pada 30 menit, VNaOH = 1,4 mL,
terhadap 0,28 mg nitrogen asam amino maka 1,4 x 0,28 = 0,392 mg
Sebelum membuat kurva, mg nitrogen  Pada 60 menit, VNaOH = 1,9 mL,
terlebih dahulu dihitung dengan ketentuan 1 maka 1,9 x 0,28 = 0,532 mg
mL NaOH yang digunakan dalam titrasi  Pada 75 menit, VNaOH = 2,1mL,
ekuivalen dengan 0.28 mg nitrogen asam maka 2,1 x 0,28 = 0,588 mg
amino.  Pada 90 menit, VNaOH = 2,5 mL,
 Pada 0 menit, VNaOH = 0,6 mL, maka 2,5 x 0,28 = 0,7 mg
maka 0,6 x 0,28 = 0,168 mg Berdasarkan perhitungan diatas,
 Pada 15 menit, VNaOH = 0,8 mL, diperoleh data mengenai mg nitrogen
maka 0,8 x 0,28 = 0,224 mg terhadap waktu seperti tabel dibawah ini:
 Pada 30 menit, VNaOH = 1,3 mL,
maka 1,3 x 0,28 = 0,364 mg

Tabel 3. Data mg Nitrogen yang Dihasilkan Oleh Asam Amino pada Menit ke-0, 15, 30, 45, 60, 75 dan 90
Waktu Volume NaOH mg nitrogen
(mL) asam amino
Berdasarkan 0 menit 0.6 mL 0,168 dihasilkan oleh
data diatas, 15 menit 0.8 mL 0,224 asam amino
dapat dibuat 30 menit 1,3 mL 0,364 terhadap waktu
kurva 45 menit 1,4 mL 0,392 yaitu sebagai
hubungan 60 menit 1,9 mL 0,532 berikut :
antara mg 75 menit 2,1 mL 0,588
nitrogen yang 90 menit 2,5 mL 0,7

Kurva Hubungan antara mg Nitrogen Terhadap

Waktu
0.8 0.7
0.59
0.6 0.53
mg nitrogen

0.36 0.39
0.4
0.22
0.2
0
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Waktu
mg nitrogen Linear (mg nitrogen)
Gambar 5. Kurva Hubungan antara mg Nitrogen Terhadap Waktu

Ditunjukkan oleh kurva diatas yang Berdasarkan hasil dan pembahasan

mana terjadi peningkatan jumlah mg
nitrogen asam amino seiring dengan
bertambahnya waktu kontak antara larutan
gelatin dengan larutan tripsin. Enzim tripsin
yang semakin lama menghidrolisis gelatin
menyebabkan gugus karboksil dan gugus
amino yang dihasilkan semakin banyak,
sehingga nitrogen yang terdapat pada
dimetilol juga ikut bertambah.
KESIMPULAN
diatas, dapat disimpulkan bahwa derajat
hidrolisis yang dimiliki oleh asam amino
adalah sebesar 0,021. Dari data yang
diperoleh kurva hubungan antara volume
NaOH terhadap waktu dan kurva mg
nitrogen asam amino terhadap waktu pada
titrasi formal asam amino yang mana
jumlah asam amino yang terurai bertambah
sesuai dengan pertambahan waktu dapat
dibuktikan dengan meningkatnya
penggunaan NaOH dalam titrasi seiring

7
pertambahan waktu maka semakin banyak
pula mg nitrogen dari asam amino yang REFERENSI
dihasilkan. Protein (gelatin) dapat Fessenden, F dan Fessenden. 1994. Kimia
dihidrolisis dengan menggunakan enzim Organik Jilid 2. Jakarta: Erlangga
protease dari tripsin. Girindra, Aisjah.1993. Biokimia I. Jakarta:
PT. Gramedia
UCAPAN TERIMAKASIH I Wayan Muderawan, dkk. 2012. Buku Ajar
Penulis mengucapkan terima kasih Kimia Organik II. Singaraja.
kepada dosen pengampu mata kuliah Universitas Pendidikan Ganesha
praktikum biokimia yakni Dr. I Nyoman Tika, I Nyoman. 2010. Penuntun
Tika, M.Si dan Made Vivi Oviantari, S.Si., Praktikum Biokimia. Singaraja:
M.Si. atas bimbingan yang sudah diberikan Universitas Pendidikan Ganesha
pada saat penulis melakukan perkuliahan
praktikum biokimia secara daring.