BAB I

PENDAHULUAN

1.1 LATAR BELAKANG

Kefir adalah produk susu fermentasi yang mempunyai rasa yang spesifik sebagai hasil
fermentasi bakteri asam laktat dan khamir yang hidup bersama sama dan saling
menguntungkan. Rasa susu fermentasi (kefir) didominasi rasa asam yang disebabkan oleh
aktivitas bakteri asam laktat yang timbul pada proses fermentasi laktosa oleh starter (Zakaria,
2009). Di Indonesia sendiri kefir belum begitu dikenal oleh masyarakat karena minuman
kefir bukanlah minuman yang bersal dari Indonesia. Kefir berasal dari pegunungan Kaukasus
di antara Laut Hitam dan Laut Kaspia, Rusia Barat Daya. Kefir memiliki nama yang berbeda-
beda seperti kepi, kippe, kapov, kephir, dan kiaphir. Jenis susu fermentasi ini telah banyak
dikonsumsi oleh beberapa negara Asia dan Skandinavia (Usmiati, 2007).
Kefir pada umumnya terbuat dari bahan dasar susu, baik dari susu sapi maupun susu
kambing. Susu kambing dikenal sebagai susu yang memiliki nilai gizi yang tinggi
(Verdamuthu,1982). Menurut Lampert (1975) susu kambing memiliki kandungan total solid
13,09%, lemak 4,8%, protein 3,7%, bahan keringtan palemak 9,10%, abu 0,85% dan laktosa
5%. Berdasarkan komposisi kimianya susu kambing berbeda dengan susu sapi karena
memiliki kandungan total protein,kasein, lemak susu, mineral dan vitamin A yang lebih
tinggi dibandingkan susu sapi (Haenlein,2004). Susu kambing memiliki globula lemak yang
lebih kecil sehingga lebih mudah dicerna (Aroraet al.,2013). Selain itu menurut Boychevaet
al., 2011 menyatakan bahwa asam lemak susu kambing kaya akan asam lemak volatile yaitu
kaproat,kaprilat dan kaprat yang berkontribusi pada pembentukan rasa dan bau spesfik.
Terdapatnya aroma yang spesifik pada susu kambing atau biasa juga disebut dengan aroma
prengus yang menyebabkan susu kambing jarang untuk dikonsumsi. Untuk menghilangkan
aroma prengus biasanya susu kambing diolah dengan cara fermentasi, salah satu produk hasil
fermentasi susu kambing adalah kefir.
Fermentasi kefir susu kambing dengan nilai organoleptik atau kesukaan rasa paling tinggi
dan viskositas terbaik adalah dengan menggunakan konsentrasi biji kefir sebanyak 5%
dengan waktu fermentasi selama 8 jam (Purbasari, 2013). Yulinery (2007) menyatakan
bahwa untuk pembuatan kefir susu kambing dengan hasil yang maksimal adalah dengan
menggunakan starter kefir dengan konsentrasi 7% pada pembuatannya. Dalam proses
fermentasi kefir terdapat aktivitas dari mikroba yang mana aktivitas mikroba dipengaruhi

1
oleh konsentrasi, suhu serta lamafermentasi. Arbangi (2014) menyatakan bahwa total
mikroba yang paling banyak didapatkan adalah pada kefir yang diberi kosentrasi 3%.
Fermentasi kefir berlangsung dalam dua tahap inkubasi yaitu pada suhu 25°C selama 24 jam
serta dilanjutkan dengan inkubasi pada suhu 5°C selama 12 jam (Bankhofers, 2002).
Penelitian mengenai fermentasi kefir susu kambing telah dilakukan oleh beberapa peneliti
antara lain Yulinery (2007) tentang fermentasi kefir dari susu sapi dan susu kambing serta
pengaruh persentase starter terhadap kualitas kefir. Arbangi (2014) tentang jumlah Bakteri
Asam Laktat (BAL), mikroba dan kadar air kefir, susu kambing dengan konsentrasi biji kefir
dan waktu fermentasi berbeda. Selanjutnya Purbasari (2013) menyatakan tentang pengaruh
konsentrasi biji kefir dan waktu fermentasi terhadap viskositas dan penilaian organoleptik
kefirsusu kambing.
Mengacu pada penelitian yang telah dilakukan diatas belum dilaporkan dosis yang efektif
dan waktu pemanenan yang tepat untuk mendapatkan kefir terbaik dengan jumlah mikroba
paling banyak dalam minuman fermentasi susu kambing. Berdasarkan hal tersebut perlu
dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai minuman fermentasi kefir susu kambing.

1.2 RUMUSAN MASALAH

1.2.1 Bagaimana cara mengisolasi bakteri Acetobacter sp., Lactobacillus plantarum,
dan, Lactococcus lactis dari kefir?
1.2.2 Apakah kefir mengandung bakteri Acetobacter sp., Lactobacillus plantarum,
dan, Lactococcus lactis?
1.3 TUJUAN
1.3.1 Mengisolasi bakteri Acetobacter sp., Lactobacillus plantarum, dan,
Lactococcus lactis dari kefir.
1.3.2. Membuktikan bahwa kefir mengandung bakteri Acetobacter sp., Lactobacillus
plantarum, dan, Lactococcus lactis.

2
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Kefir
Terdapat beberapa jenis susu fermentasi yang telah dikenal oleh masyarakat anatara
lain adalah yoghurt, kefir dan olahan susu lainnya. Namun tidak semua orang mengetahui
olahan susu tersebut. Salah satu produk olahan susu yang masih jarang di kenal oleh
masyarakat adalah kefir. Kefir merupakan produk susu fermentasi dapat dibuat dari bahan
baku susu sapi, susu kambing atau susu domba dengan menambahkan bibit kefir (kefir
grains) yang terdiri dari bakteri asam laktat dan khamir (Kosikwoski, 1982). Kandungan gizi
kefir sama dengan gizi bahan susu. Kefir kaya akan kalsium, asam amino, magnesium,
berbagai vitamin B, vitamin K, zinc, dan asam folat. Manfaat mengkonsumsi kefir secara
konsisten selain dapat menyembuhkan berbagai macam penyakit juga dapat merangsang
pembentukan sistem imun atau kekebalan tubuh. Bakteri Asam laktat dalam kefir bisa
menjadi sumber probiotik, sebagai probiotik dia bermanfaat menekan populasi bakteri
patogen di dalam saluran pencernaan.

Beberapa bakteri baik yang terkandung di dalam biji kefir, antara lain Lactobacillus
acidophillus, Lactobacillus kefiri, Lactobacillus kefirgranum, Lactobacillus kefiranofaciens,
Lactobacillus parakefir, Lactobacillus delbrueckii-subsp. Lactobacillus fructivorans,
Lactococci, Bulgaricus, Acetobacter, Lactobacillus brevis, Lactobacillus helveticus,
Lactobacillus viridescens, Lactobacillus casei, Lactobacillus kefiranofaciens, Lactobacillus
kefirgranum, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus delbrueckii,
Lactobacillus rhamnosis, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus fructirorans, Lactobacillus
hilgardii, , Lactobacillus Riridescens, Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis
subsp. cremoris, Streptococcus thermophilus, Enterococci durans, Leuconostocs sp.,
Leuconostocs mesenteroides, Acetobacter sp., Bacillus sp., Bacillus subtilis, Micrococcus
sp., Escherechia coli, Kluyveromyces lactis, dan Kluyveromyces marxianus. Bakteri-bakteri
tersebut merupakan bakteri yang sangat berguna untuk menjaga kesehatan tubuh manusia.
Selain itu pada kefir juga terdapat yeast yang mampu menfermentasi laktosa (Kluyveromyces
marxianus) dan fermentasi selain laktosa (Saccharomyces unisporus, Saccharomyces
cerevisiae dan Saccharomyces exiguus).

Cara pembuatan kefir kurang lebih sama dengan pembuatan yoghurt. Perbedaannya
terletak pada bibit yang digunakan, untuk kefir dibutuhkan biji kefir. Biji kefir yaitu butiran-
butiran putih atau krem dari kumpulan bakteri, antara lain Streptococcus sp, Lactobacilli, dan

3
beberapa jenis ragi atau khamir nonpatogen. Disamping itu waktu fermentasi kefir lebih lebih
lama dibandingkan yoghurt. Bibit kefir adalah campuran protein susu dan mikroba kefir
berbentuk seperti biji-biji berwarna putih kekuningan, berukuran 0,1–2 cm.
Langkah pembuatan kefir dapat diterangkan sebagai berikut: seliter susu dimasak
hingga mendidih. Api dipadamkan dan ditunggu sampai susu dingin. Sejumlah biji kefir
dimasukkan ke dalam susu, kurang lebih 2–5 g per liter susu. (Semakin banyak biji yang
ditambahkan tentunya berakibat proses fermentasi menjadi lebih cepat.) Setelah selesai,
bahan disimpan selama 10–12 jam. Untuk menghasilkan kefir yang mengandung gas dan
alkohol, perlu disimpan dalam wadah yang ditutup rapat (kedap udara). Jika wadah terbuka
atau ditutup tak rapat, hasil kefir akan menyerupai plain yoghurt. Setelah penyimpanan
dilakukan pengadukan secukupnya. Kemudian biji kefir disaring dan dipisahkan dari kefir
yang baru jadi. Kefir dapat langsung diminum atau ditutup wadah kefir dan disimpan lagi
selama 12–24 jam sebelum diminum. Setelah disaring, biji kefir dapat dimasukkan ke dalam
susu yang baru. Sebelum itu sebaiknya biji ini dibilas dengan air matang yang hangat terlebih
dahulu. Cara yang lebih baru untuk membuat kefir ialah dengan menggunakan bibit serbuk
kefir (seperti bibit serbuk yoghurt), berasal dari campuran kefir dan biji kefir yang diawetkan.
Kefir lebih awet dibanding yoghurt, dan dapat bertahan sehingga lebih dari satu bulan jika
disimpan dalam lemari pendingin, namun jika dibiarkan di suhu normal kefir hanya bertahan
dua hari. Untuk menyimpan biji kefir dapat direndam di dalam kefir atau susu dan ditaruh
dalam lemari pendingin. Setelah sekitar 10 hari hingga dua minggu berlalu, biji kefir
dipindahkan ke susu yang baru untuk menjaga keaktifan mikroba kefir. Untuk mengeringkan
biji kefir basah, mula-mula biji kefir disaring dari campuran susu lalu dibersihkan dengan
cara masukkan biji kefir ke dalam gelas. Perlahan-lahan diisikan air keran hingga gelas penuh
dan air meluber. Kecepatan aliran air diatur sedemikian rupa sehingga hanya gumpalan-
gumpalan kecil susu yang terbuang, sementara biji kefir tertahan di gelas. Perlu dilakukan
dengan hati-hati karena sebagian gumpalan susu yang agak besar merupakan calon biji kefir
yang baru. Setelah beberapa menit campuran akan menjadi lebih bersih dari susu. Disaring
kembali, lalu biji kefir ditaruh di atas kain halus yang kering. Dibiarkan selama 2 hari. Biji
akan mengerut dan menjadi keras. Keunikan cita rasa kefir juga ditentukan oleh kadar
senyawa volatile, seperti asetaldehida, diasetil, propionaldehida, 2-butanon, n-proponal, iso-
amil alcohol, dan asam asetat (Widodo, 2002).
Kandungan protein kefir lebih mudah dicerna dan mengandung asam amino
tryptophan yang memiliki efek menenangkan saraf (relaksasi). Efek penenang kefir pada

4
system saraf bermanfaat mengatasi masalah imsomia, stress, depresi dan ADHD (Attention
Deficit Hyperactive Disorder). Kandungan gizi kefir dapat dilihat pada Tabel 2.1.

Kandungan Gizi Kefir

Per porsi (227 g)
Energi 160 kkal
Karbohidrat 8 gram
Protein 14 gram
Lemak 3 gram
Natrium 90 mg
Kalsium 300 mg
Vitamin A 500 IU
Vitamin D 1000 IU

2.2 Bahan Baku Kefir

Terdapat beberapa bahan baku yang dibutuhkan dalam proses pembuatan kefir,
diantaranya susu segar yang merupakan bahan baku utama dan starter kefir yang merupakan
bahan yang ditambahkan untuk susu segar menjadi kefir.
a. Susu
Susu disebut juga darah putih bagi tubuh karena mengandung banyak
vitamin dan berbagai macam asam amino yang baik bagi kesehatan tubuh. Dalam segelas
susu terdapat antara lain: Potasium, yang menggerakkan dinding pembuluh darah agar tetap
stabil, menghindarkan anda dari penyakit darah tinggi dan jantung. Zat besi, mempertahankan
kulit tetap bersinar. Tyrosine, mendorong hormon kegembiraan dan membuat tidur lebih
nyenyak. Kalsium, menguatkan tulang. Magnesium, menguatkan jantung dan sistem saraf
sehingga tidak mudah lelah. Yodium, meningkatkan kerja otak besar. Seng, menyembuhkan
luka dengan cepat. Vitamin B2, meningkatkan ketajaman penglihatan. Kompisisi susu
umumnya berbeda untuk masing-masing species hewan yang berbeda. Perbedaan tersebut
juga ditemukan dalam ras dan breed sebagai sifat genetik dan pengaruh pemulia biakan
(Hidayat, 2006). Selengkapnya komposisi susu segar dapat dilihat pada Tabel 2.2.

Komponen Presentase
Bahan Kering 13
Lemak 4
Protein 3.4
Kasein 2.8
Laktosa 4.8
Abu 0.7

5
 b. Starter kefir
Starter kefir yang merupakan bahan tambahan yang digunakan untuk mengubah susu
segar menjadi kefir. Starter kefir merupakan butiran-butiran bibit kefir terdiri dari
mikroorganisme yang dikelilingi oleh matriks berbentuk lendir yang terdiri atas gula
polisakarida yang disebut kefiran (ini diproduksi oleh bakteri tertentu). Bibit kefir juga terdiri
atas campuran berbagai bakteri dan kamir (ragi), masing-masing berperan dalam
pembentukan cita rasa dan struktur kefir (Pangkal ide, 2008). Spesies mikroorganisme dalam
bibit kefir di antaranya Lactocococcus lactis, Lactobasillus acidophilus, Lactobasillus kefir,
Lactobasillus kefirgranum, dan Lactobasillus parakefir yang berfungsi dalam pembentukan
asam laktat dari laktos. Lactobasillus kefiranofaciens sebagai pembentuk lendir (matriks
butiran kefir), Leuconostoc sp. membentuk diasetil dari sitrat, dan Candida kefir pembentuk
etanol dan karbondioksida dari laktosa. Selain itu juga ditemukan Lactobassilus brevis, dan
kamir (Torulopsis holmii dan Saccharomyces). Komposisi kimia kefir dapat dilihat pada
Tabel 2.3
Komponen Presentase
Protein 4–6
Lemak 0.1 – 10
Laktosa 2–3
Karbohidrat 5 – 25
Ph 3.5 – 4.6
Keasaman 0.5 – 1.6
Alkohol 0.5 – 2

2.3 Manfaat kefir

Kefir memiliki banyak manfaat sehat dan memiliki banyak kelebihan dibandingkan
dengan susu ( bahan pembuat kefir ). Kandungan asam dalam kefir dapat memperpanjang
masa simpan, mencegah pertumbuhan mikroorganisme pembusuk sehingga mencegah
kerusakan susu, dan mencegah pertumbuhan mikroorganisme patogen. Kalsium, Magnesium,
dan nutrisi yang terkandung di dalam kefir membantu meningkatkan kecerdasan anak juga
baik sekali untuk ibu hamil.
Kefir memiliki khasiat yang baik bagi kesehatan. Banyak penelitian telah dilakukan
untuk menemukan apa sebenarnya yang membuat kandungan kefir memiliki khasiat yang
luar biasa. Menurut Pangkal ide (2008), berdasarkan riset dan pengalaman, kefir dapat
membantu menyembuhkan keluhan-keluhan seperti:
- Alergi, asma, bronchitis

6
 - Asam urat, encok, arthritis
- Batu ginjal, gangguan fungsi ginjal
- Diabetes, jantung, hipertensi
- Gangguan fungsi usus, maag
- Herpes, lupus, jerawat, eksim, borok
- Kanker, tumor
- Kolestrol
- Memperlambat menopause
- Mengembalikan stamina penderita setelah sakit keras
- Menghaluskan dan mengencangkan kulit
- Menghindari efek kemotrapi dan radiasi
- Migrain
- Obesitas, diet ( mendukung penurunan berat badan )
- Osteoporosis/keropos tulang
2.4 Karakteristik kefir
Karakteristik kefir dapat digambarkan sebagai berikut, warna putih atau kekuningan,
aromanya seimbang, rasanya asam, tetapi menyenangkan dan menyegarkan, dan tekstur agak
tebal, tetapi tidak lengket, dengan konsistensi elastis. Asam laktat, asam volatil, diacetyl,
karbon dioksida dan etanol adalah komponen utama yang mempengaruhi sifat sensori dari
kefir (Wszolek, 2006). Butiran lemak susu kambing berukuran antara 1-10 milimikron sama
dengan susu sapi, tetapi jumlah butiran lemak yang berdiameter kecil dan homogen lebih
banyak terdapat pada susu kambing sehingga susu kambing lebih mudah dicerna alat
pencernaan manusia, serta tidak menimbulkan diare pada orang yang mengkonsumsinya.
Susu kambing juga tidak mengandung karoten, sehingga warna susu kambing lebih putih
daripada susu sapi.
Kefir mengandung 0.5-1% alkohol dan 0.9-1.1% asam laktat yang dihasilkan oleh
mikroflora dalam biji kefir. Komposisi kadar nutrisi biji kefir adalah air sebanyak 89.5%,
lemak 1.5%, protein 3.5%, abu 0.6%, laktosa 4.5%, dengan nilai pH 4.6 (Rahmanet al.,
1992). Biji kefir berwarna putih kekuningan, konsistensinya elastis serta berdiameter 1-6 mm,
namun demikian saat dipanen dari susu dan dicuci dengan air, diameter biji kefir menjadi 0.5-
3.5cm, bentuknya tidak beraturan dan berlekuk-lekuk, menyerupai kembangkol (cauli
flower), elastis berwarna krem atau kuning gading. Biji kefir yang telah dicuci dan
dikeringkan dalam larutan garam dapat disimpan selama satu bulan pada suhu dingin.

7
 Penyimpanan kefir pada suhu rendah mutlak harus dilakukan dengan tujuan untuk
menghambat aktivitas BAL berlanjut sehingga keasaman kefir relatif stabil juga bertujuan
menghambat kontaminasi bakteri pathogen yang berasal dari lingkungan. Kosikowski (1982)
menyatakan bahwa penyimpanan pada suhu 4֩C dapat membuat body dan tekstur kefir lebih
stabil. Menurut Brewer (1994) menyatakan lama simpan kefir pada suhu rendah sekitar 10
hari, jika berlebih maka kualitasnya akan menurun. Wijayanti (2002) juga menyatakan bahwa
kefir yang dibuat dengan konsentrasi bibit kefir 3% dengan lama simpan 3 hari akan
menghasilkan kefir dengan kualitas yang sesuai dengan standar susu fermentasi. Penggunaan
susu rendah lemak dengan konsentrasi kefir grains serta lama simpan kefir dalam suhu
rendah akan berpengaruh terhadap kadar lemak, kadar protein dan kadar alkohol kefir.
2.5 Acetobacter sp.

www.gettyimages.com

Acetobacter adalah sebuah genus bakteri penghasil asam asetat, ditandai dengan
kemampuannya mengubah etanol (alkohol) menjadi asam asetat (asam cuka) dengan
www.visualsunlimited.photoshelter.com/
bantuan udara. Ada beberapa bakteri dari golongan lain yang mampu menghasilkan asam
asetat dalam kondisi tertentu, namun semua anggota genus Acetobacter dikenal memiliki
kemampuan ini.

Bakteri-bakteri Acetobacter dikenal penting secara komersial, antara lain karena

8
 Dapat digunakan dalam produksi cuka (dengan sengaja mengubah etanol
pada anggur menjadi asam asetat.
 Namun dapat juga merusak anggur, dengan menghasilkan asam asetat atau etil asetat,
yang merusak rasa anggur tersebut.

Pertumbuhan Acetobacter pada anggur dapat dicegah dengan sanitasi yang efektif, pemisahan

udara dari anggur secara sempurna, maupun penggunaan secukupnya sulfur
dioksida sebagai pengawet pada anggur.

Acetobacter dikenali dengan mudah dengan pertumbuhan koloninya di medium yang

mengandung 7% etanol, dan ditambahi kalsium karbonat secukupnya
untuk memburamkan medium sebagian. Ketika koloni tersebut membentuk asam asetat yang
cukup, kalsium karbonat kemudian melarut sehingga terbentuk daerah bening yang jelas pada
medium.

Bakteri Acetobacter sp. Bersifat gram negatif, tidak membentuk endospore, hidup
bersifat aerob obligat, tidak melakukan fermentasi alcohol, berbentuk bulat lonjong sampai
batang pendek, tumbuh baik pada pH 3,5-4,3 dan suhu 25-30 0C, dapat mengoksidasi etanol
dan menghasilkan asam asetat. Metabolisme bakteri Acetobacter sp. menghasilkan enzim
katalase, secara fisik bakteri Acetobacter sp. mampu mengoksidasi glukosa menjadi rantai
atau polimmer yang panjang yang disebut dengan polisakarida atau selulosa berupa serat-
serat putih, yang terbentuk secara bertahap dari lapisan tipis pada awal fermentasi hingga
mencapai ketebalan sekitar 12 mm pada akhir fermentasi, kemudian disebut sebagai nata
yang termasuk metabolit sekunder. Selain metabolit sekunder Acetobacter sp. juga
menghasilkan metabolit primer berupa asam asetat, air, dan energi yang digunakan kembali
dalam siklus metabolismenya. Asam asetat dimanfaatkan oleh Acetobacter sp. sebagai
substrat, agar tercipta kondisi yang optimum untuk pertumbuhannya dan untuk membentuk
CO2 dan H2O.

2.5.1 Klasifikasi Acetobacter sp.

Kingdom : Bacteria

Filum : Proteobacteria

Kelas : Alphaproteobacteria

Ordo : Rhodospirillales

9
Family : Acetobacteraceae

Genus : Acetobacter

Spesies : Acetobacter sp.

2.5.2 Manfaat Acetobacter sp.

Menurut Mandel (2004) bakteri Acetobacter sp. bersifat overoksidizer yaitu

kemampuannya yang dapat mengubah asam asetat dalam medium fermentasi menjadi CO2
dan H2O, apabila gula dalam medium fermentasi telah habis dimetabolisir. Banyaknya
mikroba yang tumbuh pada suatu media sangat dipengaruhi oleh nutrisi yang terkandung di
medium.

Bakteri Acetobacter sp. memiliki kemampuan untuk memproduksi biofilm selulosa

(nata). Terbentuknya biofilm selulosa (nata) ini merupakan hasil metabolisme Acetobacter
sp. yang prosesnya dikendalikan oleh plasmidnya. Nata ini banyak digunakan pada berbagai
industri bahan-bahan biomedik dan untuk pembuatan kertas yang mempunyai mutu yang
lebih bagus dibandingkan kertas yang diperoleh dari serat tumbuhan, dapat digunakan
sebagai makanan ringan atau cuci mulut, dapat juga digunakan untuk mengurangi sembelit
dan makanan bagi yang sedang menjalani diet.

2.6. Lactobacillus plantarum

www.microbewiki.com www.tgw1916.net

www.microbewiki.com

10
 Bakteri Lactobacillus plantarum adalah bakteri asam laktat dari famili
Lactobacilliceae dan genus Lactobacillus. Bakteri ini bersifat Gram positif, non motil, dan
berukuran 0,6-0,8 μm x 1,2-6,0 μm. Bakteri ini memiliki sifat antagonis terhadap
mikroorganisme penyebab kerusakan makanan seperti Staphylococcus aureus,
Salmonella,  dan Gram negatif (Buckle et al., 1987). Lactobacillus plantarum bersifat toleran
terhadap garam, memproduksi asam dengan cepat dan memiliki pH ultimat 5,3 hingga 5,6
(Buckle et al., 1987). Pengolahan pangan dan pakan menggunakan BAL adalah teknologi
yang telah ada sejak dulu yang dapat meningkatkan kandungan obat dan anti penyakit serta
mencegah kebusukan dan perjangkitan penyakit yang disebabkan oleh bakteri patogen
(Elegado et al., 2004). Bakteri L. plantarum umumnya lebih tahan terhadap keadaan asam
dan oleh karenanya menjadi lebih banyak terdapat pada tahapan terakhir dari fermentasi tipe
asam laktat.
2.6.1 Klasifikasi Lactobacillus plantarum
Kingdom : Bacteria

Filum : Firmicutes

Kelas : Bacilli

Ordo : Lactobacillales

Family : Lactobacillaceae

Genus : Lactobacillus

Spesies : Lactobacillus plantarum

2.6.2 Manfaat Lactobacillus plantarum

Bakteri Lactobacillus plantarum sering digunakan dalam fermentasi susu, sayuran,
dan daging (sosis). Fermentasi dari L. plantarum bersifat homofermentatif sehingga tidak
menghasilkan gas (Buckle et al., 1987). Bakteri Lactobacillus plantarum terutama berguna
untuk pembentukan asam laktat, penghasil hidrogen peroksida tertinggi dibandingkan bakteri
asam laktat lainnya dan juga menghasilkan bakteriosin yang merupakan senyawa protein
yang bersifat bakterisidal (James et al., 1992). Lactobacillus plantarum dapat memproduksi
bakteriosin yang merupakan bakterisidal bagi sel sensitif dan dapat menyebabkan kematian
sel dengan cepat walaupun pada konsentrasi rendah. Bakteriosin yang berasal dari L.
plantarum  dapat menghambat Staphylococcus aureus dan bakteri Gram negatif (Branen dan

11
Davidson, 1993). L. plantarum  mempunyai kemampuan untuk menghasilkan bakteriosin
yang berfungsi sebagai zat antibiotik (Jenie dan Rini, 1995). Lactobacillus plantarum 2C12
merupakan isolat indigenus yang diisolasi dari daging sapi lokal Indonesia. Arief et al. (2008)
melaporkan bahwa suatu senyawa antimikroba diproduksi oleh bakteri asam
laktat Lactobacillus plantarum yang diisolasi dari daging sapi lokal. Senyawa antimikroba
tersebut dapat menghambat pertumbuhan bakteri patogen Escherichia coli, Salmonella
typhimurium dan Staphylococcus aureus.

2.7 Lactococcus lactis 

www.wikipedia.org www.ilmuveteriner.com/

www.textbookofbacteriology.net/
Lactococcus lactis semula diberi nama Streptococcus lactis. Lactococcus
lactis  merupakan bakteri Gram positif yang digunakan secara luas dalam produksi mentega
dan keju. Lactococcus lactis tidak menghasilkan spora (nonsporulatif) dan tidak bersifat
motil. Bakteri ini termasuk ke dalam genus Lactococcus dan digolongkan sebagai bakteri
mesofilik yang dapat hidup antara suhu 10-45°C. Bakteri ini memiliki metabolisme
homofermentatif dan khusus menghasilkan L (+) asam laktat saja (Roissart & Luquet 1994).
Selain itu, bakteri ini dapat berkembang pada pH antara 4,4 sampai 9,6 (Axelsson 2004).

12
Menurut Presscott et al. (2002), untuk hidup bakteri ini membutuhkan oksigen tapi bersifat
fakultatif tentu dan membutuhkan media yang bernutrisi kompleks. Lactococcus
lactis  merupakan salah satu mikroorganisme yang penting dalam industri pengolahan susu.
Ketika Lactococcus lactis ditambahkan ke dalam susu, bakteri menggunakan enzim untuk
menghasilkan molekul energi (ATP) dari laktosa. Produk sampingan dari produksi energi
ATP adalah asam laktat. Asam laktat yang dihasilkan oleh bakteri akan menggumpalkan susu
kemudian memisahkan antara whey  dengan gumpalan (curd) yang digunakan untuk
menghasilkan keju (Ghosh J & Rajorhia 1989). Selain itu, Dahhan et al. (1984)
merekomendasikan penggunaan Lactococcus lactis dalam pembuatan produk yogurt karena
memiliki kesamaan dengan produk komersial yang terdapat di pasar.
Lactococcus lactis mempunyai dua subspesies yang sangat berperan dalam fermentasi
susu diantaranya L. Lactis subsp. lactis dan cremoris. Subspesies L. lactis mempunyai
perbedaan pada karakteristik phenotypic. L. lactis subsp. lactis tumbuh pada suhu 40 °C dan
4% NaCl serta menghasilkan amonia dari arginin sedangkan L. lactis subsp. cremoris tidak
dapat tumbuh pada suhu 40 °C dan 4% NaCl serta tidak menghasilkan amonia dari arginin.

2.7.1 Klasifikasi Lactococcus lactis

Kingdom : Monera

Filum : Firmicutes

Kelas : Bacilli

Ordo : Lactobacillales

Family : Streptococcaceae

Genus : Lactococcus

Spesies : Lactococcus lactis

2.7.2 Manfaat Lactococcus lactis

Lactococcus lactis merupakan salah satu spesies dari Lactococcus dan merupakan

salah satu mikroorganisme yang diklasifikasikan ke dalam bakteri asam laktat karena mampu
memfermentasi gula (laktosa) dalam susu menjadi asam laktat. Lactococcus lactis telah
banyak digunakan secara luas sebagai kultur starter pada fermentasi susu di seluruh dunia.
Strain L. Lactis digunakan untuk menghasilkan produk makanan seperti keju, kefir, sour

13
cream  dan  buttermilk. L. Lactis tidak hanya berperan dalam memberikan karakteristik rasa,
aroma dan tekstur dari produk tetapi juga membantu pengawetan produk dengan
menghasilkan asam organik, bakteriosin dan hidrogen peroksida.
2.8 Metode Cawan Gores
Metode cawan gores atau streak plate menggunakan loop ose dan menggoreskannya
ke permukaan medium agar dengan pola tertentu dengan harapan pada ujung goresan seperti
yang ditunjukkan pada gambar , hanya sel-sel bakteri tunggal yang terlepas dari ose dan
menempel ke medium. Sel-sel bakteri tunggal ini akan membentuk koloni tunggal yang
kemudian dapat dipindahkan ke medium selanjutnya agar didapatkan biakan murni.

Pengerjaan isolasi dengan metode cawan gores

(Sumber http://ahahermanto.wordpress.com/)

2.9 Metode Cawan Tuang

Metode cawan tuang atau pour plate dilakukan dengan mencampur suspensi bakteri
dengan medium agar pada suhu 50ºC kemudian menuangkannya pada petridish atau dengan
menyemprotkan suspensi pada dasar petridisk, kemudian menuang medium agar keatasnya
dan diaduk. Setelah agar mengeras, bakteri akan berada pada tempatnya masing-masing dan
diharapkan bakteri tidak mengelompok sehingga terbentuk koloni tunggal.
Teknik pengerjaannya dilakukan seperti gambar berikut:

14
 Gambar 3.5. Pengerjaan isolasi dengan metode cawan tuang
(sumber http://ahahermanto.wordpress.com/)
Dari cawan yang berisikan koloni-koloni terisolasi dilanjutkan dengan iisolasi biakan murni
mikroba dengan memindahkan sebagian dari satu koloni ke dalam tabung berisikan medium
steril.

2.10 Pemeliharaaan dan Pengawetan Biakan Murni

Sesudah satu mikroba berhasil diisolasi dalam biakan murni maka perlu memelihara
biakan itu dalam keadaan hidup untuk masa yang cukup lama. Sesungguhnya kebanyakan
laboratorium mikrobiologi memelihara koleksi besar biakan biakan seperti itu acap kali
dinamakan koleksi biakan sediaan. Pemeliharaan dapat dilakukan dengan berbagai cara
diantaranya dalam

15
  media cair

 plat agar

 agar miring

 liofilisasi : pengering bekuan /penggunaan nitrogen cair suhu -1760C

2.11 Pewarnaan sederhana

Menggunakan satu macam zat warna (biru metilen/air fukhsin) tujuan hanya untuk
melihat bentuk sel. Pewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang paling umum digunakan.
Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat
dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana, yaitu mewarnai sel-sel bakteri hanya
digunakan satu macam zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-
pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-
zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen
kromoforiknya bermuatan positif).

Zat warna yang dipakai hanya terdiri dari satu zat yang dilarutkan dalam bahan pelarut.
Pewarnaan Sederhana merupakan satu cara yang cepat untuk melihat morfologi bakteri
secara umum. Beberapa contoh zat warna yang banyak digunakan adalah biru metilen (30-60
detik), ungu kristal (10 detik) dan fukhsin-karbol (5 detik).

(http://wikipedia.org/)

2.12 Pewarnaan Gram

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode untuk membedakan spesies
bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat
kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya,
ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada
tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae.

16
 Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu
bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat
tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh
karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak
mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp Contoh bakteri yang tergolong bakteri tahan
asam, yaitu dari genus Mycobacterium dan beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia.
Bakteribakteri dari kedua genus ini diketahui memiliki sejumlah besar zat lipodial (berlemak)
di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel
terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode
pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Gram.
Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu :
 Zat warna utama (violet kristal)

 Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna
utama.

 Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang digunakan
uantuk melunturkan zat warna utama.

 Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel
yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan denga alcohol.

Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil
ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan zat warna
metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada
uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu,
yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda.
Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan
struktur dinding sel mereka.
Pewarnaan gram dilakukan dalam 4 tahap yaitu :

1. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.

2. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ.
3. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.
4. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin

17
 (http://barwienie.blogspot.co.id/)
2.13 Pewarnaan negatif
Tujuannya yaitu mempelajari penggunaan prosedur pewarnaan negatif untuk
mengamati morfologi organisme yang sukar diwarnai oleh pewarna sederhana. Bakteri tidak
diwarnai, tapi mewarnai latar belakang. Ditujukan untuk bakteri yang sulit diwarnai, seperti
spirochaeta .Pewarnaan negatif, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai
latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan
transparan. Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan
ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia,
maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat
diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina.
Pewarnaan negatif memerlukan pewarna asam seperti eosin atau negrosin.pewarna
asam memiliki negatif charge kromogen,tidak akan menembus atau berpenetrasi ke dalam sel
karena negative charge pada permukaan bakteri. oleh karena itu, sel tidak berwarna mudah
dilihat dengan latar belakang berwarna.

(http://wikipedia.org)

BAB III

METODOLOGI

3.1 Waktu dan Tempat

18
 Studi lapangan dilakukan pada bulan Januari 2018 bertempat di Laboratorium
Bioproses Teknik Kimia Politeknik Negeri Malang.

3.2 Alat dan Bahan

Alat yang digunakan untuk penelitian pada studi lapangan ini adalah: tabung reaksi
streril, tutup tabung reaksi, cawan petri steril, pembakar spiritus, batang pengaduk, hot
plate, lup inokulasi, mikroskop, preparat, cover preparat, pipet mikro, incubator,
autoclave, oven, vortex mixer, penjepit kayu, kulkas, ball pipet, neraca analitik, spatula,
pipet ukur, dan rak tabung reaksi.

Bahan yang diperlukan diantaranya: etanol, aquades, nutrient agar, kefir, nigrosine,
methyl blue, kristal violet, carbol fuchsin, iodin, dan safranin.

3.3 Langkah Kerja

3.3.1 Persiapan dan Sterilisasi Alat Bahan

1. Siapkan tutup tabung reaksi,tutup botol aquades, penyumbat pipet ukur dan tutup
Erlenmeyer, pastikan benar-benar rapat.
2. Siapkan 4 gram nutrient agar, timbang di neraca analitik, jangan sampai lebih dan
langsung tutup setiap selesai mengambil agar untuk cegah kontaminasi pada agar
yang tidak dipakai.
3. Larutkan 4 gram NA tadi kedalam erlenmeyer yang berisi 200 ml aquades, Panaskan
dengan Hotplate supaya cepat larut.
4. Tutup tabung reaksi, botol aquades, dan Erlenmeyer berisi NA yang akan disterilkan,
serta bungkus cawan petri dan pipet ukur yang sudah disumbat yang akan disterilkan
dengan tutup dan kertas pembungkus yang sudah disiapkan.
5. Masukkan Semuanya kedalam autoclave, pastikan mengoperasikan autoclave sesuai
SOP dan jangan lupa mengecek ketinggian aquades yang akan digunakan.
6. Sterilkan dalam Autoclave selama 30 menit dengan suhu 121 oC dengan tekanan 1,2
Atm.
7. Setelah selesai dan suhu sudah turun, keringkan dalam oven selama 2 jam dengan
suhu.
8. Angkat dan Simpan alat-alat tersebut di kotak penyimpanan yang telah disiapkan
(KecualiErlenmeyer Berisi NA, 6 Tabung Reaksi, 3 cawan petri, pipet ukur untuk
isolasi cawan tuang )

19
3.3.2 Isolasi Bakteri Cawan Tuang
1. Bersihkan Terlebih dahulu Meja kerja, dan tangan untuk mencegah Kontaminasi.
2. Siapkan 6 Tabung Reaksi, , Pipet Ukur, pembakar spirtus, dan botol isi aquades steril.
3. Taruh Tabung reaksi di rak tabung reaksi dan mulai nyalakan pembakar spirtus.
4. Isi masing-masing keenam Tabung-tabung reaksi 9 ml aquades stteril secara aseptis
dengan pipet ukur kemudian langsung tutup.
5. Labeli Tabung reaksi tersebut untuk setiap pengenceran.
6. Maksukan 1 ml Kefir ke tabung reaksi 1 dengan mikropipet secara aseptis, kemudian
homogenkan dengan vortex mixer.
7. Pindahkan Biakan yang sudah lebih encer dan homogen di Tabung reaksi 1 ke tabung
reaksi 2 dengan mikropipet secara aseptis, kemudian homogenkan dengan vortex
mixer.
8. Ulangi langkah 6 hingga pengenceran ke 6, lakukan secara aseptis.
9. Siapkan 6 buah cawan petri, 3 buah Tabung Reaksi dan Erlenmeyer berisi NA yang
sudah steril.
10. Tuang kira-kira 1/3 dari cawan petri NA steril tersebut ( kira-kira 20-25 ml), lakukan
didekat pembakar Bunsen secara aseptis.
11. Tuang ke tabung Reaksi kira-kira 1/3 penuh (± 8ml ) miringkan hingga menyisakan
1/3 area kosong tabung reaksi dari tutup.
12. Tutup tabung reaksi tersebut dan bungkus cawan petri serta masukan ke plastic dan
simpan di kulkas (kecuali 3 cawan petri untuk isolasi cawan tuang.
13. Bila suhu agar sudah ± 40-50oC atau suasana hangat, ambil 3 Cawan Petri tersebut
dan tuang biakan dari hasil pengenceran ke secara aseptis ke masing- masing cawan
petri berisi NA.
14. homogenkan dengan memutar diatas meja, lalu tunggu hingga agar mengeras.
15. Setelah mengeras, inkubasi dalam Incubator oven selama 12-36 jam (bergantung pada
pertumbuhan mikroba).
16. Setelah Tumbuh Mikroba bisa dicek atau disimpan dalam kulkas untuk Praktikum
berikutnya
3.3.3 Isolasi Mikroba Cawan Gores
1. Siapkan Cawan Petri isi Agar steril, dan cawan petri hasil biakan.
2. Cek di Mikroskop dengan menyiapkan preparat secara aseptis.
3. Jika sesuai dengan spesies yang diinginkan Siapkan cawan gores berisi agar yang
steril, pembakar spirtus, jarum ose, dan spidol. Lakukan di Laminar Flow.

20
 4. Sterilkan area Laminar Flow dengan etanol, lalu mulai memberi kuadran pada bawah
cawan gores.
5. Pijarkan ose, lalu dinginkan dan ambil biakan di cawan tuang yang sudah
diidentifikasi mikrobanya.
6. Putarkan Cawan Gores dibawah pembakar spirtus, Buka sebagian kecil cawan petri
dan mulai menggoreskannya di area 0 dengan goresan sempit, pastikan dilakukan
secara aseptis.
7. Tutup cawan petri, lalu sentuhkan ke api spirtus , lalu pijarkan ose
8. Setelah ose dingin, sentuhkan sekali gores di area 0, lalu menggoreskannya di area 1
secara aseptis dan goresannya sempit ( tidak asal-asalan)
9. Tutup cawan petri lagi, lalu sentuhkan ke api spirtus , lalu pijarkan ose
10. Setelah ose dingin, sentuhkan sekali gores di area 1, lalu menggoreskannya di area 2
secara aseptis dan goresannya sempit
11. Tutup cawan petri lagi, lalu sentuhkan ke api spirtus , lalu pijarkan ose
12. Setelah ose dingin, sentuhkan sekali gores di area 2, lalu menggoreskannya di area 3
secara aseptis dan goresannya luas melengkung di sisa area 3
13. Tutup cawan petri lagi, lalu sentuhkan ke api spirtus , lalu pijarkan ose
14. Beri label dan Bungkus cawan petri tersebut
15. Masukan ke Incubator oven selama 12-24 jam
16. Angkat dan cek isinya, jika sudah tumbuh, simpan dalam kulkas untuk Praktikum
Berikutnya

3.3.4 Isolasi Mkroba Agar Miring

1. Siapkan cawan petri hasil Cawan gores dan Tabung reaksi berisi agar miring
2. Cek di Mikroskop dengan menyiapkan preparat secara aseptis
3. Jika koloni tunggal sesuai keinginan, siapkan jarum ose dan pembakar spirtus,
lakukan di Laminar flow
4. Pijarkan ose, lalu dinginkan dan ambil biakan di cawan gores yang sudah
diidentifikasi koloninya
5. Buka tabung reaksi, pegang tutupnya dan panaskan
6. Goreskan ose pada agar miring secara hati-hati dan aseptis
7. Panaskan Kembali tutup tabung kemudian tutup segera, jangan lupa pijarkan kembali
ose
8. Beri label, lalu masukan ke plastic dan taruh di incubator oven selama 12-24 jam

21
 9. Setelah tumbuh simpan koloni tunggal di Kulkas untuk praktikum selanjutnya

3.3.5 Pewarnaan Negatif

1. Siapkan Biakan agar miring, Kaca Preparat, Pembakar Spirtus, Tinta Cina, Serta
Jarum ose yang diperlukan
2. Bersihkan Kaca Preparat sampai benar-benar bersih, Lalu Keringkan
3. Semprotkan Alkohol, lalu kering anginkan
4. Ambil Biakan Murni di Agar Miring secara Aseptis
5. Teteskan Nigrosine ke Kaca preparat, lalu campurkan dengan suspensi dengan cara
menggeret Kaca Preparat ke suspensi dan nigrosine tersebut
6. Keringkan Suspensi sampai benar-benar kering
7. Tutup dengan Cover Glass, Amati di Mikroskop
8. Bersihkan kaca preparat, dan cover glass hingga bersih

3.3.6 Pewarnaan Sederhana

1. Siapkan Biakan agar miring, Kaca Preparat, Pembakar spirtus, Metilen Blue, Karbol-
fuchsin, Aquades steril, dan jarm ose
2. Bersihkan Kaca Preparat sampai benar-benar bersih, Lalu Keringkan
3. Semprotkan Alkohol, lalu kering anginkan
4. Ambil Aquades steril dengan jarum ose secara aseptis
5. Ambil Biakan Murni di Agar Miring secara Aseptis
6. Fiksasikan di pembakar spirtus hingga terasa panas
7. Teteskan Salah satu antara Metilen blue/ Karbol-fuchsin ke hasil fiksasi
8. Tunggu hingga warna dari pewarna tersebut menyerap secara sempurna (metilen blue
1-2 menit, karbol-fuchsin 15-30 detik )
9. Bilas dengan aquades, jangan sampai mikroba ikut hanyut
10. Seka kaca preparat perlahan dengan tissue hingga kering
11. Tutup dengan cover glass lalu amati di mikroskop
12. Bersihkan kaca preparat, dan cover glass hingga bersih

3.3.7 Pewarnaan Gram

1. Membersihkan object glass dan cover glass dengan menggunakan alkohol sampai
bebas lemak, lalu membersihkan lagi dengan tisu.
2. Mengfiksasi diatas nyala lampu bunsen.
3. Mengambil secara aseptik satu ose suspensi bakteri dan meratakan diatas object glass.

22
4. Mengeringkan object glassdengan diangin-anginkan hingga terbentuk noda.
5. Mengfiksasi dengan dipanaskan diatas lampu bunsen.
6. Mendinginkan, lalu diteteskan zat warna crystal violet sebanyak 2 atau 3 tetes dan
membiarkan selama 1 menit.
7. Mencuci dengan aquades sampai sisa-sisa zat warna tercuci seluruhnya.
8. Mengeringkan dengan cara diangin-anginkan.
9. Meneteskan larutan lugol dan membiarkan selama 1 menit.
10. Mencuci dengan aquades dan mengeringkan dengan diangin-anginkan.
11. Mencuci dengan alkohol selama 30 detik.
12. Meneteskan larutan zat warna safranin sebanyak 2 atau 3 tetes.
13. Mencuci dengan aquades.
14. Mengamati dengan menggunakan mikroskop.

DAFTAR PUSTAKA

 http://ilmuveteriner.com/taksonomi-dan-klasifikasi-lactococcus-lactis/
 https://visualsunlimited.photoshelter.com/image/I0000Up6lsrkQrvA
 http://www.gettyimages.com/detail/photo/acetobacter-aceti-bacteria-are-a-
widespread-high-res-stock-photography/128554789
 http://www.repository.ipb.ac.id/

23
 http://www.repository.upi.edu/
 http://www.repository.unair.ac.id/
 http://pustaka.litbang.pertanian.go.id/publikasi/wr292078.pdf

 http://barwienie.blogspot.co.id/
 http://wikipedia.org
 http://ahahermanto.wordpress.com/
 http://www.textbookofbacteriology.net/
 http://www.tgw1916.net
 http://www.microbewiki.com/
 http://www.gettyimages.com
 Jusman Nainggolan. 2009. Kajian Pertumbuhan Bakteri Acetobacter sp. Dalam
Kombucha Rosela Merah. Medan: USU Press
 Attin Nur Atthariq. 2013. Isolasi dan Identifikasi Senyawa Metabolit Sekunder.
Bandung: UPI Press
 Fardiaz, S. 1989. Mikrobiologi Pangan. Departemen Pendidikan dan Kebudayaan
Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi. IPB

24