VALIDATION OF ANALYTICAL

METHODS INTRODUCTION
“Validasi Metode”
Objectives
• Memberikan pemahaman, bagi analis, cara bagaimana
terlibat dalam validasi metode/verifikasi melalui practical
guideline dan prosedur
• Memberikan overview persyaratan performance
karakteristik yang harus dievaluasi selama
validasi/verifikasi metode.
• Memberikan prosedur operasional umum untuk
mengases performance karakteristik suatu metode.
Agenda
• Validasi Metode & ISO 17025:2017
• Kapan, bagaimana dan sejauh mana validasi metode
dilakukan
• Siklus metode analisis validasi
• Lingkup aplikasi metode uji dan selektivitas
• Sensitivitas, linieritas dan kurva kalibrasi
• Analisa presisi dan rentang kerja
• Analisa kebenaran (trueness)
• Analisa Robustness
• Data validasi dokumentasi dan pelaporan hasil
• Latihan per kelompok
Validasi Metode dan ISO/IEC 17025:2017

Introduction
VAM
_____________________

Validation of Analytical Methods (VAM) Cycle

5 Pertanyaan yang harus dijawab
• Apa itu validasi metode?
• Mengapa validasi metode dibutuhkan?
• Kapan anda memerlukan validasi metode?
• Bagaimana cara anda memvalidasi?
• Bagaimana anda mengenali suatu metode telah
divalidasi?
APA ITU VALIDASI METODE?
Apa itu Validasi Metode?
ISO 17025:2017 : definitions

• 7.2.3.1 Laboratorium harus memvalidasi metode non-

standar, metode yang dikembangkan oleh laboratorium
dan metode standar yang digunakan di luar lingkup yang
dimaksudkan (metode standar yang dimodifikasi). Validasi
harus seluas yang diperlukan untuk memenuhi kebutuhan
aplikasi atau bidang aplikasi yang diberikan. Laboratorium
harus mencatat hasil yang diperoleh, prosedur yang
digunakan untuk validasi, dan pernyataan apakah metode
tersebut sesuai untuk penggunaan yang diinginkan.
• Validasi dapat mencakup prosedur pengambilan contoh,
penanganan dan transportasi
Apa itu Validasi Metode?
ISO 17025:2017 : definitions

• Validasi : konfirmasi melalui pengujian dan pengadaan

bukti objektif bahwa persyaratan tertentu untuk suatu
maksud khusus dipenuhi
(Validation : Confirmation, through the provision of objective evidence , that the
requiement for a spesific intended use or application have been fulfilled).
• Bukti Objektif : data pendukung eksistensi sesuatu atau
kebenaran sesuatu
(Objective evidence : data supporting the existence or verity or something).
• Persyaratan : kebutuhan atau harapan yang dinyatakan,
secara umum diterapkan dan menjadi keharusan.
(Requirements : needs or expectations that is stated, generally implied or obligatory).
Apa itu Validasi Metode?
• Validasi metode adalah proses pembuktian bahwa
metode tersebut sesuai untuk maksud/tujuan tertentu.
(Method validation is then the process of proving that a method is suitable for its
intended purpose).

• Proses validasi suatu metode biasanya sangat dekat

dengan proses pengembangan suatu metode.
(The process of validating a method is usually very close to the process of developing a
method).
MENGAPA VALIDASI METODE
DIBUTUHKAN?
Mengapa Validasi Metode dibutuhkan?
• Standard ISO/IEC 17025:2005 (persyaratan umum
laboratorium pengujian dan laboratorium kalibrasi)
• Validasi metode adalah sebuah mandatory untuk ISO 17025:2017
(klausul 5.4.5)
• Bagian yang harus dikomunikasikan kepada pelanggan (klausul
4.4.1)
• Penyajian bukti ilmiah akan unjuk kerja metode yang
digunakan dan untuk komunikasi kepada semua pihak
yang berkepentingan.
• Semua kriteria dan persyaratan yang ditetapkan
Mengapa Validasi Metode dibutuhkan?
• Standard ISO/IEC 17025:2017 (persyaratan umum
laboratorium pengujian dan laboratorium kalibrasi)
• 7.2.3.1 Laboratorium harus memvalidasi metode non-standar, metode yang
dikembangkan oleh laboratorium dan metode standar yang digunakan di luar
lingkup yang dimaksudkan (metode standar yang dimodifikasi). Validasi harus
seluas yang diperlukan untuk memenuhi kebutuhan aplikasi atau bidang aplikasi
yang diberikan. Laboratorium harus mencatat hasil yang diperoleh, prosedur yang
digunakan untuk validasi, dan pernyataan apakah metode tersebut sesuai untuk
penggunaan yang diinginkan
• 7.2.2.1 Laboratorium harus menggunakan metode untuk kegiatan laboratorium yang memenuhi
kebutuhan pelanggan dan yang sesuai untuk kegiatan laboratorium yang dilakukan. Laboratorium
harus memastikan bahwa ia menggunakan edisi standar terbaru yang berlaku kecuali jika tidak sesuai
atau mungkin untuk melakukannya. Bila diperlukan, penerapan standar harus dilengkapi dengan
rincian tambahan untuk memastikan penerapan yang konsistenPenyajian bukti ilmiah akan unjuk kerja
metode yang digunakan dan untuk komunikasi kepada semua pihak yang berkepentingan.
• Penyajian bukti ilmiah akan unjuk kerja metode yang digunakan dan untuk komunikasi kepada semua
pihak yang berkepentingan.

• Semua kriteria dan persyaratan yang ditetapkan

Mengapa Validasi Metode dibutuhkan?
• Mencapai hasil yang benar dan membuktikan
kebenarannya!
• Customers mempercayai laboratorium dalam hal hasil data yang
valid dan reliable. Validasi metode menjadi tahap PENTING dalam
mencapai tujuan ini.
• Validasi metode membantu praktisi laboratorium dalam proses
pembuktian bahwa fungsi dari sebuah metode telah sesuai dengan
tujuan.
• Sistem Manajemen Mutu
• Validasi metode seringkali menjadi bagian dari prosedur legal atau
bagian dari perundang-undangan/peraturan.
• Validasi metode memungkinkan untuk membandingkan hasil dari
contoh sampel yang dianalisis di laboratorium yang berbeda-beda.
KAPAN VALIDASI METODE
DIBUTUHKAN?
Kapan Validasi Metode dibutuhkan?
• ISO/IEC 17025:2017
• 7.2.3.1 Laboratorium harus memvalidasi metode non-standar, metode yang dikembangkan oleh
laboratorium dan metode standar yang digunakan di luar lingkup yang dimaksudkan (metode standar
yang dimodifikasi). Validasi harus seluas yang diperlukan untuk memenuhi kebutuhan aplikasi atau
bidang aplikasi yang diberikan. Laboratorium harus mencatat hasil yang diperoleh, prosedur yang
digunakan untuk validasi, dan pernyataan apakah metode tersebut sesuai untuk penggunaan yang
diinginkan
• 7.2.3.2 Bila perubahan dilakukan dengan metode standar yang tidak divalidasi, pengaruh perubahan
tersebut harus didokumentasikan dan jika sesuai, validasi baru harus dilakukan.
• 7.2.3.3 Rentang dan keakuratan nilai yang diperoleh dari metode yang divalidasi
(misalnya ketidakpastian pengukuran hasil, batas deteksi, batas kuantifikasi, selektifitas
metode, linieritas, batas pengulangan dan / atau reproduktifitas, ketahanan terhadap
pengaruh eksternal Dan / atau sensitivitas silang terhadap interferensi dari matriks
sampel / benda uji, ketelitian), sebagaimana dinilai untuk penggunaan yang dimaksud,
harus sesuai dengan kebutuhan pelanggan dan sesuai dengan persyaratan yang
ditentukan, bila diperlukan.
• Modifikasi metode baku untuk konfirmasi bahwa metode itu sesuai dengan
penggunaan yang dimaksud
• Umum:
Sebuah metode harus divalidasi bila performance parameter
metode uji tersebut belum valid atau belum dibuktikan valid untuk
penggunaan problem analisis khusus.
Kapan Validasi Metode dibutuhkan?
• Validasi metode diperlukan untuk pengembangan metode
• Evaluasi terhadap performance parameter
• Sebelum menggunakan metode yang dipublikasi
• Untuk mendapatkan jaminan bahwa hasil in-house sesuai dengan
hasil yang dipublikasi
• Perubahan penggunaan
• Jenis sampel baru, level analit, penggunaan, dan perubahan
lingkungan kerja.
• Mengikuti periode “tidak digunakan”
• Terlalu lama tidak digunakannya metode tersebut di laboratorium
 Kapan Validasi & Kapan Verifikasi?
Mulai
Apakah metode Tidak Verify :
benar benar
baru?
Selesai Limit of decision &
Detection
Apakah ini Tidak Capability
Tidak metode baku?
Ya
Verify :
Ya
Apakah Kalibrasi/ Ini memerlukan
Ya performance Ya Lakukan Linieritas tingkat deteksi
karateristik
tersedia? Verifikasi Trueness terendah?
Precision

Lingkup aplikasi Tidak Determine:

Validasi Selektivitas/ Ini metode
Limit of
kuantitatif
(Lengkap) Spesifikasi decision
Ruggedness
Ya
Determine:
Kalibrasi/ Harus Determine: Limit
Ini memerlukan
Linieritas of decision &
Determine: tingkat deteksi
Detection
Trueness terendah?
capability
Precision

Ya Estimate:
Memerlukan
Uncertainty?
Measurement Selesai
Uncertainty
Tidak
Selesai
BAGAIMANA CARA MEMVALIDASI?
Ayo memvalidasi metode !
• Siapa?
• Laboratorium yang sedang develop sebuah metode bertanggung
jawab atas benarnya validasi metode tersebut.
• Metode tidak baku, metode yang didesain/dikembangkan laboratorium,
metode yang digunakan di luar lingkup yang dimaksud, penegasan
serta modifikasi dari metode baku.
• Laboratorium menggunakan metode uji (official) bertanggungjawab
untuk mengecek bahwa metode yang tervalidasi tersebut benar
dalam penggunaannya.
• Apa?
• Praktisi laboratorium harus menentukan sejumlah parameter yang
diperlukan selama proses validasi, dan ini tergantung tingkat
validasi yang diperlukan (the degree of validation of the method)
Let’s validate a method
• Bagaimana?
• Seseorang harus merencanakan sebuah eksperimen denga tujuan
mendapatkan data statistik dari parameter pengukuran (sebuah
rencana matang dapat menghemat waktu dengan karakteristik
• Hasil?
• Seseorang harus dapat mengambil informasi yang berguna dari
parameter pengukuran (menggunakan statistik dan excel)
• Seseorang harus mengambil kesimpulan atas hasil yang didapat
dalam sebuah laporan yang mendetail.
Parameter utama yang harus divalidasi
• Ruang lingkup aplikasi
• Menjelaskan (keadaan analit), bagaimana metode uji menunjukkan
kesesuaian pengukuran/pengujian analit dalam suatu matrik dan
pada level konsentrasi yang diharapkan.
• Rentang kerja (ukur)
• Menjelaskan rentang konsentrasi dimana metode uji diaplikasikan
yang dinyatakan dalam presisi, akurasi (trueness) dan linieritas.
Parameter utama yang harus divalidasi
• Selektivitas
• Menunjukkan kemampuan suatu metode membedakan antara
analit yang dituju dan komponen lain / bentuk-bentuk analit lain
yang mungkin ada dalam matrik.

Can A be measured in
the presence of B?

A A+B
Parameter utama yang harus divalidasi
• Linieritas
• Menentukan kemampuan suatu metode untuk mendapatkan
respon yang proporsional terhadap konsentrasi analit.

100

80
Response

60

40
y = 10.833x - 15.583
20 R² = 0.9776

0
0 2 4 6 8 10
Concentration (mg/l)
Parameter utama yang harus divalidasi
• The Limit of Detection (LoD) is the lowest concentration
that can be detected with an acceptable confidence.
• The Limit of Quantification (LoQ) is the lowest
concentration that can be quantified with an acceptable
precision and accuracy.
• Decision Limit (CCα), Detection Capability (CCβ)
• The decision limit (CCα) is the lowest concentration at which one
can be sure that the analyte is present (equal to or greater than
LoD).
• The detection capability (CCβ) is the smallest content of the
substance that can be detected, identified and/or quantified in a
sample (equal to or greater than LoQ).
Parameter utama yang harus divalidasi
• Kebenaran (Trueness)
• Kebenaran (Trueness) suatu metode adalah ukuran sejauh mana
kedekatan hasil pengukuran dengan nilai sebenarnya.
• Ketepatan (Precision)
• Ketepatan menggambarkan tingkat kedekatan antara hasil uji
independen yang diperoleh di bawah kondisi yang sama yang
dinyatakan dalam repeatability (pengulangan dengan perbedaan
waktu yang relatif singkat antar pengukuran independen) dan
reproducibility (pengulangan dengan perbedaan waktu relatif lama
antar pengukuran independen).
Parameter utama yang harus divalidasi
• Robustness (ruggedness)
• Test Robustness adalah pengukuran kapasitas metode uji untuk
tetap tidak terpengaruh oleh perubahan kecil dari lingkungan
dan/atau kondisi operasional. Perlakuan tersebut sengaja
dilakukan untuk melihat perubahan karakteristik parameter metode
uji.
• Ketidakpastian Pengukuran (Measurement Uncertainty)
• Ketidakpastian adalah suatu parameter yang terasosiasi dengan
hasil pengujian/pengukuran yang mencerminkan ketersebaran
nilai-nilainya yang layak dimiliki pada benda yang diuji/ukur.

Result = 28 ± 4 mg
BAGAIMANA MENGENALI METODE
YANG TELAH DIVALIDASI?
Bagaimana anda mengenali metode yang
telah divalidasi
• Evaluate method performance parameters
• Are target values achieved?
• YES – Method is fit-for-purpose in its field of application meaning
that Method is validated.
• NO – More development required and method has then to be
revalidated.
Kesimpulan
• Validasi Metode sangatlah dibutuhkan! Walaupun akan
menambah biaya yang harus dikeluarkan namun tanpa
validasi metode, analisis bagaikan TANPA nilai.
• There is not one way of performing validation: tingkat dan
parameter validasi akan sangat bergantung pada
keadaan (kadangkala verifikasi saja cukup). Dalam
keadaan tertentu, sebuah parameter PENTING bagi
situasi khusus, dan tidak significant pada situasi yang
lain: use common sense!
• Validasi Metode adalah sebuah proses yang harus
direncanakan dan berdasarkan ‘reliable data’.
• Rekaman validasi harus memuat hasil validasi dan
karakteristik performance metode uji
 FIELD OF APPLICATION:
SELECTIVITY
Validation of Analytical Methods Training
Field of Application and application range
(working range)
• Lingkup Aplikasi (Field of Application) menjelaskan
keadaan analyte, matrix dan concentration yang
dengannya metode uji sesuai digunakan.
• Sebuah metode tervalidasi untuk tujuan lingkup yang
spesifik tidak dapat digunakan untuk matrices yang lain.
• Rentang aplikasi (Application / working Range)
menyatakan rentang dimana metode sesuai
peruntukkannya, dinyatakan dalam precision, trueness,
dan linearity.
Selectivity
• Selectivitas (also called spectifity or confirmation of
identity) adalah kemampuan untuk mengukur target analit
dengan keberadaan komponen-komponen lain dalam
matrik sampel.
• Can A be accurately measured in the presence of B?

Response
A =?
A
Response A
In the presence of B
A+B
Selectifity
• Selektifitas adalah parameter qualitatif
“metode uji selektif/tidak selektif bila pengukuran A
dengan keberadaan B”
• Pengujian selektivitas direncanakan dengan
menggunakan pengetahuan yang ada sebelumnya.
• Apa prinsip pengukurannya?
• Jenis spesi kimia seperti apa yang dapat mengganggu dalam
pengukuran?
• Bentuk substansi apa saja (bagian dari analit) yang ada dalam
matrix?
• Apakah substansi-substansi tersebut dapat mengganggu
pengukuran?
Selectifity
• Penentuan asam maleat dalam jus anggur merah dengan
titrasi asam-basa.
• What is the principle of the measurement?
• Titration of the acid groups with NaOH
• What kind of molecules can interface with the measurement?
• Other acids
• What substance (apart from the analyte) are present in the matrix?
• Sugars, minerals, organic acids, polyphenols….
• Can any of those substances interfere with the measurement?
• Yes, the other organic acids (citric acid, tartaric acid…)

The method is not selective when measuring L-Malic acid

in red grape juice.
Selectifity: Methodology
• L-Malic acid in grape juice by enzymatic determination
• What is the principle of the measurement?
• Reaction of L-Malic with an enzyme
• What kind of molecules can interfere with the measurement?
• Very strong acids (denaturation of enzyme)
• Subtances absorbing at 340nm
• What subtances (apart from the analyte) are present in the matrix?
• Sugars, minerals, organic acids, polyphenols….
• Can any of those substances interfere with the measurement?
• No
Bagaimana menetapkan selektivitas? (1)
• Analisa A tanpa dan adanya B dalam sampel.
• Evaluasi pengaruh B (bandingkan averages dan standard
deviasi dari hasil keduanya)

n replicates MA ± SDA

Is MA significantly different
? from MA+B?
Is SDA different from SDA+B?

n replicates MA+B ± SDA+B

Uji statistik “Average & Deviation
Standard”
• Membandingkan dua nilai rata-rata (t test)
t = (x-y)/sp
x dan y nilai rata-rata
sp standard deviasi gabungan
Nilai t kemudian dibandingkan dengan nilai t tabel dengan tingkat
kepercayaan biasanya 95% dan derajat kebebasan (degree of
freedom df yang sama)
• Membandingkan dua standard deviasi (F test)
F = s12/s22
s1 dan s2 nilai dua standard deviasi dengan s1>s2
Nilai F dibandingkan dengan nilai F tabel.
Bila F yang dihitung > F tabel berarti perbedaan s1>s2 adalah benar.
Bila F yang dihitung < F tabel berarti tak ada perbedaan antara s1>s2
Untuk uji t dan F perlu mengenal penggunaan tabel t dan F
If this is not possible…(2)
• Bandingkan dengan metode yang secara prinsip sama
sekali berbeda.
• Analisa dan bandingkan dengan material yang
terkarakteristik dengan baik (certified reference materials)
If this is not possible…(3)
• Analisa blank extracts dan check keberadaan
interferences.
• Spike (masukan dengan akurat) blank extracts dan
bandingkan dengan larutan standard

*blank extracts = matrix without analyte

How to make a method selective?
• Analisa secara kritis significance dari ketidakselektifan
• Check tingkat dan jenis gangguan pada analit dalam matrix
• Jika masih dibawah tingkat gangguan yang menyebabkan efek
yang significant, metode mungkin cukup selektif tanpa modifikasi.
• Lakukan step isolasi sebelum dilakukan analisa, dan
jadikan bagian dari keseluruhan metode.
• Forget it and try a different method!
 Limit of Detection (LoD)
Limit of Quantification (LoQ)
Validation of Analytical Methods Training
LoD, LoQ
• Limit of Detection (LoD) adalah konsentrasi terkecil yang
dapat dideteksi dengan presisi dan akurasi yang dapat
diterima.
• Limit of Quantification (LoQ) adalah konsentrasi terkecil
yang dapat dikuantifikasi dengan presisi dan akurasi yang
dapat diterima.
LoD, LoQ: Methodology
• Bagaimana menentukan LoD dan LoQ?
• Situasi 1: Noise dan pengukuran signal (e.g.
chromatographic or spectrometric methods)
• Situasi 2: Individual measurements (e.g. gravimetric,
photometric, enzymatic, titrimetic methods)
Situasi 1: Noise dan pengukuran signal
• Spike blank samples dengan sejumlah kecil analit
Situasi 1: Noise dan pengukuran signal
• Ukur signal dari base line hingga puncak peak (s) dan
bagi dengan noise (N).

N
Situasi 1: Noise dan pengukuran signal
• Tentukan kadar analit yang memberikan perbandingan
signal/noise 3 (LoD) atau 10 (LoQ)

6
5
4
S/N

3
2 y = 4.4785x + 0.6709
R² = 0.9776
1
0.505
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
Spiked amount
Situasi 1: Noise dan pengukuran signal
• Jika blank sample tidak tersedia:
• Sampel dengan konsentrasi rendah tersedia..
Gunakan prosedur yang sama dengan sampel konsentrasi rendah.
• Sampel konsentrasi rendah tidak tersedia..
Gunakan prosedur yang sama dengan mengencerkan larutan
standard.
Situasi 2: Individual measurements
• Lakukan pengukuran blank sampel 10 kali dan tetapkan
standard deviasi.
0.042119
0.094799
0.060727
0.039140
0.040518
SD = 0.0567
0.167555
0.195755
0.149793
0.160526
0.169883
Situasi 2: Individual measurement
• Apply the following formulas:

LoD = 3 * SD

LoQ = 10 * SD
Special Situations
• Jika blank sample tidak tersedia?
• Prosedur yang sama digunakan dengan sampel konsentrasi
rendah.
• Jika sampel konsentrasi rendah tidak tersedia?
• Prosedur yang sama digunakan dengan reagen blank (dalam hal
ini penentuan LoD tidak diperlukan)
Ccα, CCβ
• The limit of decision (Ccα) adalah konsentrasi terendah
dimana seseorang dapat yakin (dengan 1-α = 99%
confidence level) bahwa analit ada dalam sampel.
• α is the probability of a false positive decision = the result is
positive although the analyte is not present
• Detection capability (CCβ) adalah kandungan dari
substance terendah yang dapat dideteksi, diidentifikasi,
dan atau dikuantifikasi dalam sampel dengan tingkat
keprcayaan 1-β (umumnya 95%)
• β is the probability of a false negative decision = the result is
negative although the analyte is present
Ccα, CCβ
• Bagaimana menetapkan Ccα dan CCβ?
• Procedure 1: Prosedur kurva kalibrasi
• Procedure 2: Variabilitas dari blank
Procedure 1: Kurva Kalibrasi
• Direkomendasi untuk metode kuantitatif bila blank sample
tersedia.
• Data yang digunakan untuk prosedur ini dapat juga
digunakan untuk penentuan trueness dan precision.
Procedure 1: Kurva Kalibrasi
• Lakukan spike sampel dengan konsentrasi disekitar level
minimum performance yang diperlukan dan lakukan
pengulangan pengukuran sebanyak 6 kali.
• Analisa sampel dalam 3 periode yang berbeda
(repeatability dalam periode yang sama) dan intermediate
reproducibility antar periode.
True value of samples

Sample 1 Sample 2 Sample 3

0.50 1.00 1.50

Day 1
Sample 1 Sample 2 Sample 3
Rep 1 0.47 1.03 1.53
Rep 2 0.48 1.05 1.55
Rep 3 0.48 1.02 1.51
Rep 4 0.49 0.98 1.44
Rep 5 0.51 0.99 1.53
Rep 6 0.52 1.00 1.55
Procedure 1: Kurva Kalibrasi
• Plot response terhadap penambahan konsentrasi untuk
setiap periode.
• Hitunglah intercept untuk setiap periode
• Hitunglah standard deviasi dari intercept (SDintercept)
Procedure 1: Kurva Kalibrasi
Procedure 2: Signal to noise or variability
of the blank
• Gunakan sampel konsentrasi rendah sesuai dengan level
performance yang diinginkan
• Analisa 10 kali sampel tersebut
• Hitunglah mean dan standard deviasi atau perbandingan
signal/noise
• CCα = Performance level + 1.64 SD or 3 *(signal to noise)
CCβ = CCα + 1.64 SD
Sensitivity, Linearity, Calibration Curve
Validation of Analytical Methods Training
Sensitivity, Linearity, Calibration Curve
• Sensitivity adalah perubahan respon karena perubahan
yang bersamaan dalam konsentrasi (slope of the
calibration curve)
• Linearity “penetapan kemampuan metode untuk
mendapatkan hasil test yang proporsional pada
konsentrasi analit”
• Kurva kalibrasi menampilkan hubungan antara respon
analit dan konsentrasi
Sensitivity
• Sensitivity adalah perubahan dalam respon akibat
perubahan yang bersamaan dalam konsentrasi
Linearity: methodology
• Ukur respon (paling sedikit 3 kali) pada paling sedikit 6
level konsentrasi mengcover rentang 80-120% rentang
kerja dan rentang frekeuensi.

(mg/ml) Response
2.0 20.95 20.55 17.17
3.0 30.02 33.92 29.89
4.0 42.60 36.92 38.90
5.0 48.91 50.22 52.52
6.0 61.08 58.22 60.20
7.0 70.14 70.43 68.31
8.0 83.91 81.06 77.58
Linearity: methodology
• Plot konsentrasi analit yang berbeda-beda (X) terhadap
respon instrumen (Y) dan kaji secara visual.
• Tetapkan kurva linier: Y = 10.034* X-0.0012
Linearity: methodology
• Plot konsentrasi analit yang berbeda-beda vs respon
faktor (respon/konsentrasi) dan kaji secara visual
Linearity: methodology
• Ases kesusaian model (statistical parameters)
• Correlation coefficient
• Residual plot
• Residual standard deviation
• Standard error of regression coefficients (slope and intercept)
Linearity: methodology
• Ases kesusaian model: correlation coefficient (r)
Aturan umum, ini harus sedekat mungkin dengan 1
Linearity: methodology
• Ases kesusaian model: correlation coefficient (r)
80 100
60 80
60
40
R² = 0.9761 40
20 y = 9.6832x + 0.6421
20
0 R² = 0.9002
0
0 50 100 150 0 5 10
100 - Correlation coefficient (r) makin
80 mendekat ke nilai 1 korelasi makin
60 linier (high linearity)
40
R² = 0.9788
20
0
0 5 10
Linearity: methodology
• Ases kesusaian model: residual plot
Mewakili perbedaan antara nilai yang diamati dan
yang diprediksi.
100
y = 9.6832x + 0.6421
80 45
R² = 0.9002
60 Residual {
40
40
35
20 3.5 4 4.5
0
0 5 10
Linearity: methodology
• Ases kesusaian model: residual plot
Residuals randomly distributed around the central line indicate
good linearity 5
4
3
2
Residuals

1
0
-1
-2
-3
-4
0 2 4 6 8 10
Concentration (mg/mL)
Linearity: methodology
• Ases kesusaian model: residual plot
A pattern in the residuals means a degree of non-linearity
6
4
Y-Estimated Y

2
0
-2
-4
-6
0 2 4 6 8 10
Independent Variable
Linearity: methodology
• Ases kesusaian model: residual plot
In some cases the precision of the response is
proportional to the concentration of analyte
0.6

0.4

0.2
Y-Estimated Y

-0.2

-0.4

-0.6
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Independent Variable

- Split set data original di daerah nilai yang rendah dan tinggi
- Gunakan regresi yang berbobot
Linearity: methodology
• Ases kesusaian model: residual plot
Dalam kasus-kasus tertentu, kemungkinan terjadi
satu atau lebih data outlier, ini harus diinvestigasi
penyebabnya.
4
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
-0.5
-1
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

- Sekali penyebab outlier teridentifikasi,

titik tersebut dapat dikeluarkan
Linearity: methodology
• Ases kesusaian model: residual standard deviation (RSD)
Memberikan suatu indikasi penyebaran nilai-nilai
disekitar fitted line.

Warning!! Berbeda dengan RSD (Relative Standard

Deviation)

Dapat digunakan dalam estimasi ketidakpastian

dalam konsentrasi

µ(predicted concentration) = RSD / slope of

calibration
Linearity: methodology
• Ases kesusaian model: standard error of slope and
intercept
• Check the confidence intervals of the slope and intercept

Slope interval does not include zero

Intercept interval include zero

sound reason to use one-point calibration in routine analysis

Linearity: methodology summary
• Measure response (at least in triplicates) at least 6
consentratins level covering a range going from 80-120%
of working range and evenly spaced
• Plot concentration against response factor
• Evaluate visually
• Plot concentration against response
• Calculate the fitted line
• Plot if residuals
• Calculate statistical parameters
• Evaluate statistical parameters
• Critical evaluation of results
Linearity: Use of Q-Stat
• Q-Stat gives you the grapichs and coefficients that you
need
Response versus Concentration Residual Plot

5
4
3
2

Residuals
1
0
-1
-2
-3
-4
0 2 4 6 8 10
Concentration (mg/mL)
 Linearity: Use of Q-Stat
• Q-Stat gives you the grapichs and coefficients that you
need
Regression Result

The two sets are correlated (5% signification

General level)

95% Confidence interval

Model: Y = 0.0 + 10.03 X

Lower Central Upper Decision

Coefficient if
determination (R2): b 0.9908 Slope: [9.57 10.03 10.5] does not include

Correlation coefficient : 1 Intercept: [-2.5 0 2.5] includes 0

Residual standard deviation 2.03

Non-linear calibration curve
• What if response is not linear?

4.5 5
4

Absorbance (450 nm)

Absorbance (450 nm)

3.5 4

{
3
3
2.5
2
2
1.5
Linear range?
1 1
{

0.5
Linear range?
0 0
0 50 100 150 0 50 100 150
Concentration (mg/mL) Concentration (mg/mL)

1. Use the calibration curve only in the linear range

 Non-linear calibration curve
• What if response is not linear?

5 5
Absorbance (450 nm)

Absorbance (450 nm)

4 4

3 3

2 2

1 1

0 0
0 50 100 150 0 2 4 6 8
Concentration (mg/mL) Log[Concentration] (ng/mL)

2. Apply a transformation to your data to make it linear

(log(x), 1/x….)
To include in the validation file
• Parameters of the regression analysis
• Intercept, slope with 95% interval
• Correlation Coefficient
• Residual Standard Deviation
• Plot of the regression
• Residuals plot
 Precision Analysis
Validation of Analytical Methods Training
Precision
• Presisi menunjukkan kedekatan diantara hasil-hasil
pengujian yang independen dibawah kondisi yang
ditentukan (repeatability or reproducibility)
Precision Levels
• Repeatability (r)
• Laboratorium, analis dan peralatan yang sama serta dalam interval
waktu yang pendek.
• Intermediate Reproducibility (iR)
• Di dalam laboratorium: dilakukan pada hari, oleh analis dan
dengan peralatan yang berbeda.
• Reproducibility (R)
• Laboratorium, peralatan dan analis yang berbeda serta dalam
interval waktu yang lama.
How to express precision?
• Sebagai (Relative) Standard Deviation
• Ditentukan dari hasil replikasi dibawah kondisi yang ditentukan
• Sebagai suatu Limit
• Mewakili maksimum toleransi terhadap perbedaan antar duplikasi
pada tingkat probalitas tertentu.
• Nilainya sama dengan 2.772*SD (at a 95 % probability level)

Standard deviation SD ( r ) SD ( iR ) SD ( R )

Relative standard deviation RSD ( r ) RSD ( iR ) RSD ( R )

Limit r iR R
Precision: methodology
• Bagaimana menghitung karakteristik presisi dari suatu
metode?
• Analisis beberapa sampel dalam replikat atau duplikat (duplicates
or replicates design)
• Analisis satu sampel dalam replikat (simple design)
Repeatability designs
• Duplicate/Replicate design: analisis beberapa sampel
dalam replikat
1
2.
1 1
2.
2
• M : mean/median of observations
• SD( r ) : standard deviation
1
2.
(e.g. different production)

5
1
2.
5
of repeatability

possibly different days

9.

• r : repeatability limit
9
similar material

1
0.
1
1
0.
4

9.
8
9.
5

9.
7
M ± SD (r)
1
3.
1 1
3.
5
1
3.
2

1
4.
5 1
4.
5
1
4.
7

k: number of replicates
n(k-1)≥6 n: number of samples
Repeatability designs
• Simple repeatibility: analisis satu sampel dalam replikat

12.1
• M : mean/median of observations
• SD( r ) : standard deviation
of repeatability

Reproducibility conditions
12.3
• r : repeatability limit
12.5

11.9
M ± SD (r)
……

11.5

11.8

12.1
k≥6
Reproducibility designs
• Duplicate/Replicate design
• M : mean/median of observations
1
2.
1 1
2.
2
1
2. • SD(iR) : standard deviation
(e.g. different production)

5
1
2.
5
of reproducibility
• iR : reproducibility limit

possibly different days

9.
9
similar material

1
0.
1
1
0.
4

9.
8
9.
5

9.
7
M ± SD (iR)
1
3.
1 1
3.
5
1
3.
2

1
4.
5 1
4.
5
1
4.
7

k: number of replicates
n(k-1)≥6 n: number of samples
Reproducibility designs
• Simple reproducibility: analyze one sample
12.1 • M : mean/median of observations
• SD(iR) : standard deviation
of reproducibility

Reproducibility conditions
12.3
• iR : reproducibility limit
12.5

11.9
M ± SD (iR)
……

11.5

11.8

12.1
k≥6
Interlaboratories designs
• Dapat digunakan untuk interlaboratory study, collaborative study atau
ring test
• Tujuan: Karakterisasi reproducibility dan repeatibility untuk digunakan
lingkup laboratorium yang luas (banyak)
1
2.
1 1
2.
2
1
Lab 1
2.
5
1
2.
5
9.
9
1
Lab 2
0.
1
1
0.

Lab 3

Reprod.
4

…………. ………….
9.
8

Paling sedikit 9.
5
Lab 5
9.

5 sampel berbeda 7

1
3.
1 1
Lab 6
3.
5
1
3.
2

1
4.
Lab 7
5 1
4.
5
1
4.
7
Lab 8
Precision: Summary
• Simple designs (desain sederhana)
• Analisa sampel dalam replikat
• Jalankan test statistik: detection of outliers and normality
• Tentukan karakteristik presisi
• Evaluasi hasil
• Duplicate/replicate designs (desain duplikat/replikat)
• Analisa sampel dalam duplicates/replicates
• Jalankan test statistik : detection of outliers and normality
• Tentukan karakteristik presisi
• Evaluasi hasil
• Interlaboratory studies
• Analisa sampel oleh sejumlah laboratorium
• Jalankan test statistik
• Evaluasi hasil
Precision: How to decide?
• Duplicate/Replicate analysis
• Untuk rentang yang luas
• Desain yang lebih disukai (umum)
• Baik dalam perhitungan repeatibility
• Single designs
• Untuk rentang yang sempit
• Hanya valid untuk satu level dan satu matrik
• Interlaboratory studies
• Untuk metode yang divalidasi/dikarakterisasi secara lengkap
• Untuk validasi penuh
 Trueness Analysis
Validation of Analytical Methods Training
Trueness (Kebenaran)
• Trueness menunjukkan tingkat kedekatan antara nilai
rata-rata (average) yang didapat dari sejumlah serie
pengukuran dengan nilai reference (nilai benar)
• Trueness ditunjukkan dengan nilai bias

Presence of bias?
Trueness: methodology
• Bagaimana mengecek ada/tidak adanya bias?
• Using certified reference materials (CRM)
• Using spiked samples
• Comparing two methods
Trueness: methodology (CRM)
• Analyze certified reference material

• x0 : reference value
12.17
• u : uncertainty associated to the reference
value
12.12
• n : number of measures (should be higher
12.2 than 6)

:
n≥6
:

12.25
Xo ± u
12.21

12.23
Trueness: methodology (CRM)
• Run statistical evaluation

12.17
• M : mean/median of observations
• SD : robust standard deviation of observations
12.12

12.2

: Is M significantly different
n≥6 M ± SD
: than x0?

12.25
Xo ± u
12.21

12.23
Trueness: methodology (CRM)
Run statistical evaluation: confidence intervals and significance tests
Xo ± u M ± SD
Is M significantly different from x0?

Xo M

M is significantly different than x0

Xo
M
M is not significantly different than x0
Trueness: methodology (spiking)
• Analyze spiked samples • x0 : native amount
Xs ± Us • xs : spiked amount
• x1 : final amount
12.17
• u : uncertainty associated to
each value
12.12
• n : number of measures (must
12.2 be higher than 6)

n≥6

12.25
X0 ± U0 X1 ± U1
12.21

12.23
 Trueness: methodology (spiking)
• Run statistical evaluation • M : mean/median of observations
• SD : standard deviation of observations
Xs ± Us
12.17

12.12

12.2

Is M significantly
n≥6 M ± SD different
than x0?
12.25
X0 ± U0 X1 ± U1
12.21

12.23
Trueness: methodology (spiking)
• Run statistical evaluation: confidence intervals and
significance tests
X1 ± U1 M ± SD
Is M significantly different from x1?
BUT…

Xs ± Us
How to calculate u1?
BUT…

Could we use recovery rates?

X0 ± U0 X1 ± U1
Trueness: methodology (spiking)
• Run statistical evaluation: confidence intervals and
significance tests

R ± uR
𝑀
𝑅= Is R significantly different from 100 %?
𝑥1

PREFER TO USE CERTIFIED

REFERENCE MATERIALS!!!
Trueness: methodology (comparison)
• Design 1: Analyze one sample by the two methods

12.17 12.17

12.12 12.12

12.2 12.2

n≥6 n≥6

12.25 12.25

12.21 12.21

12.23 12.23

M1 ± SD1 M2 ± SD2
Trueness: methodology (comparison)
• Design 1: Run statistical evaluation: confidence intervals
and significance tests
M1 ± SD1 M2 ± SD2
Is M1 significantly different from M2?

M1 ± SD1 M2 ± SD2
M1 is significantly different from M2

M1 ± SD1

M2 ± SD2 M1 is not significantly different from M2

Trueness: methodology (comparison)
• Design 2: Analyze a number of samples by the two methods

11.9 12.1

12.0 12.2

possibly different days

different analysyst
13.6 13.7

13.3 13.2

12.2 12.1

12.3 12.4

13.0 13.1

13.2 13.5

14.0 14.5

13.9 14.2

Ensure stability between paired measures

Trueness: methodology (comparison)
• Design 2: Run statistical evaluation: analysis of differences and
analysis of regression

11. 12.
9 1
12. 12.
0 2
• Are method 1 and 2 comparable?
13. 13.
6 7 • Are the differences between the
13. 13.
3 2 result
12. 12. different from zero?
2 1
12. 12. • Are the two methods correlated?
3 4
13. 13.
0 1
13. 13.
2 5
14. 14.
0 5
13. 14.
9 2
Trueness: Summary
• Use of Certified Reference Material (CRM)
• Analyze Certified Reference Material in replicates
• Run statistical tests: detection of outliers and normality
• Run statistical tests: confidence intervals and significance tests
• Evaluate results
• Use of spiked samples
• Analyze spiked samples in replicates
• Run statistical tests: detection of outliers and normality
• Run statistical tests: confidence intervals and significance tests
• Evaluate results
• Comparing two methods
• Analyze samples by the two methdos
• Run statistical tests
• Evaluate results
Trueness: Use of Excel files
• Excel give you the statistical evaluation and interpretation
that you need
Trueness: Use of excel files
• Excel give you the statistical evaluation and interpretation
that you need
 Robustness
Validation of Analytical Methods Training
Typical key parameters
• pH of solution
• Temperature of a reaction
• Exctraction time
• Concentration of reagents…
Robustness
• Robustness (juga disebut ruggedness) menunjukkan
kemampuan metode untuk tetap tidak terpengaruh oleh
perubahan kecil dari lingkungan dan/atau kondisi
operasional.
• Robustness testing membolehkan analis mengidentifikasi
parameter eksperimen yang memiliki efek KUNCI pada
performance (kinerja) metode.
• Parameter kunci ini kemudian harus DIKONTROL
Robustness
• Robustness metode adalah menguji sebuah metode uji
dengan sengaja membuat perubahan kecil pada prosedur
dan mengevaluasi efeknya terhadap hasil uji.
How?
• Setiap parameter diinvestigasi secara terpisah masing-
masing, tetapi…
Time consuming and costly
• Desain eksperimen digunakan untuk meminimalisir
kondisi kerja yang dipersyaratkan.
 Robustness
Validation of Analytical Methods Training
Experimental design: method
• Identifikasi 3 parameter (A, B, C) untuk dipelajari
• Identifikasi keadaan normal (level 1) dan alternatif nilai-
nilai (level 2) untuk setiap masing-masing parameter.
• Lakukan 4 eksperimen yang dijelaskan berikut ini:
Example
• Suatu residu antibiotik diekstrak dari susu dengan
menggunakan pelarut.
• Hasil ekstrak dituangkan ke dalam suatu cartridge silika
dan dicuci dengan air.
• Antibiotik kemudian dielusi dengan acetonitrile dalam air
(5% v/v) dan dikuantifikasi dengan RP-HPLC
• Test robustness ini bertujuan untuk mengevaluasi step
clean-up
• Test robustness digunakan pada sampel susu yang
di“spike” dengan antibiotik pada konsentrasi sekitar 1,2
µg/l
Experimental design: method
Parameter Value
Letter Name Level 1 Level 2
A Brand of cartridge Brand 1 Brand 2
B Rate of elution 1 ml/min 3 ml/min
C Conc of acetonitrile used for 5% v/v 2% v/v
elution
Experimental design: method
• Lakukan setiap eksperimen dengan replikat (n=3) dan
tentukan mean
• Check masing-masing kelengkapan
• Number of trials for each experiment
• Standard deviation of repeatibility
• Number of replicates used for repeatibility calculation
Experimental design: method
• Check parameter yang memiliki efek significant terhadap
metode.
• Kontrol parameter KUNCI dengan cara sedemikian rupa
sehingga tidak ada problem karena variasi parameter.
• Inilah cara yang disebut ROBUST !
Robustness Experiment
Parameter Definition
Parameter Value
Letter Name Level 1 Level 2
A Brand of cartridge Brand 1 Brand 2
B Rate of elution 1 ml/min 3 ml/min
C Conc of acetonitrile used for 5% v/v 2% v/v
elution
Description of experiments
Experiment number
Parameter 1 2 3 4
A L1 L1 L2 L2
B L1 L2 L1 L2
C L1 L2 L2 L1
Observed result 1.1 1.06 0.96 0.9
Robustness Experiment
Result of each parameter
Parameter Mean L1 Mean L2 Difference
A 1.08 0.93 0.15
B 1.03 0.98 0.05
C 1 1.01 -0.01
(*) nilai yang nyata terpengaruh atas parameter A
Number of experiments at each level for each parameter : 3
Standard deviation of repeatibility (SD ( r )) : 0.02
Number of replicates used in SD( r ) determination : 3

Critical value of differences : 0.070262

Tabel F test untuk n=3

 Working Range
Validation of Analytical Methods Training
Working Range
• The working range defines the range of concentrations
where the method is applicable in terms of precision,
trueness and linearity
• In terms of validation, it is necessary to evaluate working
range and confirm that it corresponds to the concentration
range demanded by the analytical requirement
• Working range has to be larger than the application range!
How to determine the working range
• One has to first precise
• The correct linearity range
• The correct precision range
• The correct trueness range
• The intersection of these 3 ranges is the final working
range
How to determine working range
• Linearity range

• Precision range

• Trueness range

• Working range
Pembuatan Control Chart
• Control chart menampilkan nilai rata-rata untuk
mendisplay kontrol mutu dari suatu proses analisis.
• Bila data standard deviasi dan mean dari sampe (QC
sample) dilakukan secara routine control chart sangat
disarankan
• Grafik Control Chart menggambarkan hubungan mutu
hasil test dari waktu ke waktu atau sequence pengujian
dengan batasan nilai (specs) sesuai dengan kontrol
statistik yang telah ditetapkan.
Pembuatan Control Chart
Tahapan rasional untuk membuat Control Chart:
1. Identifikasi elemen-elemen penting yang akan menyusun
CC.
2. Tetapkan tujuan.
3. Pilih karakteristik yang akan diukur.
4. Tetapkan how, where, and when karakteristik yang akan
diukur.
5. Tetapkan besarnya set data.
6. Tetapkan prosedur untuk mendapatkan random sampel.
7. Tentukan estimasi rerata proses dan SD untuk jangka waktu
yang lama.
8. Buatlah lay out garis tengah (mean), garis peringatan, dan
batas tindakan (action limit).
Control Chart
Types of control chart
1. Precision controls charts based upon standard
solutions:
• Standard control should be run once every
2. Precision controls charts based upon duplicate
analyses:
• Test samplw examined should be within a narrow concentration
range;
• SD usually depends upon concentration and standard deviation of
differences between duplicate analyses also depends upon
concentration;
• At least 10 duplicate test sample (20 analyses) should be analyze
to construct a CC.
• The differences between the paired results are plotted with zero as
the expected value.
Batasan Control Chart
Types of control chart (lanjutan)
• Precision control charts based upon “Spiking” recovery
tests
• This CC are intended to determine bias in analyses, and provide
evidence of the lack of statistical control of appropriate part of the
measurement process.;
• Spike recovery test should only be applied in cases where RSD is
know to be small and the equivalent concentration of the spike
added lies between one and 10 times the concentration of the
analyte in the unspiked sample;
• Plots of values of blank determinations on a segmented
chart
• This is not true CC because this is no control limit on value;
• The chart is simply a plot oh the responses sequential obtain, with
zero as the base line value.
Interpretation of Control Chart
• Interpreting X-chart
• One or more points outside the three standard deviation limit (3s);
or
• Two or more consecutive points outside the two standard deviation
limit (2s); or
• A series of seven or more points above or below the mean; or
• An increasing or decreasing trend.
• Interpreting R-chart
• Similar to X-chart, five or more consecutive point above the 50%
confidence limit indicates a tendency toward the process being out
of control.
 Selesai
Terima kasih