UNIVERSITAS GADJAH MADA

LABORATORIUM GENETIKA DAN PEMULIAAN

INSTRUKSI KERJA UJI No. Dokumen : IKU/5.4/BI-GT/Krom-03

Halaman : 1 dari 5
PREPARASI KROMOSOM HEWAN Tgl. Terbit : 03/09/14
Revisi :0

METODE PREPARASI KROMOSOM HEWAN

DENGAN METODE SQUASH

1. RUANG LINGKUP
Metode ini digunakan untuk penentuan jam pembelahan sel dan jumlah kromosom.

2. ACUAN NORMATIF
Amemiya, C.T., J.W. Bickham, J.R. Gold. 1984. A Cell Culture Technique For
Chromosome Preparation in Cyprinid Fishes. Copeia1: 232-235.
Aristya, G.R., Daryono, B.S., Handayani, N.S.N., dan Arisuryanti, T. 2015. Karakterisasi
Kromosom Tumbuhan dan Hewan. Gadjah Mada University Press. Yogyakarta.
Ostergren, G., and Heneen, W.K. 1962. A Squash Technique For Chromosome
Morphological Studies. Insitute of Genetics,University of Lund, Sweden.
Suryo. 1995. Sitogenetika. Gadjah Mada University Press. Yogyakarta

3. ISTILAH DAN DEFINISI

A. Larutan kolkisin 2%
Larutan yang mempunyai kadar kolkisin sebanyak 2% dalam akuades. Larutan ini
berfungsi sebagai anti mitotic agent.
B. Larutan hipotonik potassium klorida (KCl) 0,56%
Larutan yang mempunyai kadar potassium klorida (KCl) dalam akuades.
larutan yang mempunyai kadar Asam Asetat Glasial (AAG) sebanyak 45% dalam
akuades. Larutan AAG 45% ini berfungsi sebagai larutan fiksatif sel.
C. Larutan Carnoy
Larutan Carnoy merupakan larutan yang terdiri dari campuran methanol dengan asam
asetat glasial (3:1).
D. Larutan Giemsa 2%
Larutan yang mempunyai kadar Giemsa 20%. Larutan Giemsa berfungsi sebagai
senyawa yang dapat berikatan dengan kromosom sehingga akan meningkatkan
visualisasi kromosom pada saat pengamatan menggunakan mikroskop.
 UNIVERSITAS GADJAH MADA
LABORATORIUM GENETIKA DAN PEMULIAAN

INSTRUKSI KERJA UJI No. Dokumen : IKU/5.4/BI-GT/Krom-03

Halaman : 2 dari 5
PREPARASI KROMOSOM HEWAN Tgl. Terbit : 03/09/14
Revisi :0

E. indeks sentromer (IS)

panjang lengan pendek kromosom (p) dibagi panjang kromosom (p+q) dikali 100.
Perhitungan IS ini bertujuan dalam klasifikasi bentuk-bentuk kromosom.
F. karyogram
suatu gambar pengaturan dari set kromosom somatis individu
(e.g. Hewan normal= 2n) berdasarkan jumlah dan disusun berdasarkan
IS (letak sentromer) kromosom.

4. CARA UJI
4.1.Prinsip
Sampel Hewan (e.g. darah) ditambahkan larutan kolkisin 2% untuk menghentikan
proses pembelahan sel dan depolimerisasi benang-benang spindle, suspensi darah
yang terbentuk lalu disentrifuse untuk mengendapkan sel darah putih, supernatan
dibuang lalu digantikan dengan larutan KCl 0,56% lalu difiksasi dengan larutan
Carnoy. Proses penggantian supernatan dilakukan dengan cara sentrifugasi sampel
terlebih dahulu. Penggantian supernatan dilakukan tiga kali, kemudian suspensi yang
terbentuk dipreprasi dengan teknik tetes ke gelas benda pada ketinggian 20 cm.
Cairan suspensi yang tersebar pada gelas benda kemudian dikering-anginkan pada
suhu ruang lalu diberi pewarna giemsa 2% selama 20 menit lalu dibilas pada air
pengalir.
4.2.Bahan
a) Larutan kolkisin 2%
b) Larutan potassium klorida (KCl) 0,56%
c) Larutan Carnoy
d) Akuades
e) Gliserin
f) Kutex
g) Larutan Giemsa
 UNIVERSITAS GADJAH MADA
LABORATORIUM GENETIKA DAN PEMULIAAN

INSTRUKSI KERJA UJI No. Dokumen : IKU/5.4/BI-GT/Krom-03

Halaman : 3 dari 5
PREPARASI KROMOSOM HEWAN Tgl. Terbit : 03/09/14
Revisi :0

4.3. Peralatan
a) labu ukur 100 mL; j) pipet tetes (tumpul);
b) gelas ukur 50 mL; k) pipet penghisap;
c) gelas ukur 100 mL; l) kulkas;
d) tabung gelap; m) mikroskop;
e) gelas benda; n) pensil;
f) gelas penutup; o) software AutocadMap;
g) suntikan; p) kertas tissue;
h) botol flakon; q) cawan petri

4.4.Persiapan Pengujian
Sampel darah hewan diambil lalu ditambahkan kolkisin 20% yang berfungsi sebagai
anti mitotic agent. Tiap 30 menit, sampel digoyang-goyang perlahan agar kolkisin
bekerja lebih merata.
4.5.Prosedur Pengujian
1. Suspensi sel yang terbentuk kemudian dimasukkan ke dalam botol sentrifuse
untuk disentrifugasi dengan kecepatan 750 gravitation (G) selama 10 menit.
2. Supernatan dibuang dan diganti dengan larutan hipotonik potasium klorida
(KCl) 0,56% sebanyak 4 ml serta dibiarkan selama 1 jam sambil diaduk
dengan hati-hati setiap 15 menit.
3. Setelah itu 2 ml larutan Carnoy ditambahkan ke dalam larutan dan
disentrifuse kembali dengan kecepatan dan waktu yang sama.
4. Proses sentrifuse dan pembuangan supernatan diulangi 2 kali.
5. Pelet yang terbentuk hasil sentrifuse terakhir difiksasi kembali dengan
larutan Carnoy sebanyak 1-1,5 ml.
6. Stok suspensi sel darah kemudian dipindahkan ke dalam tabung eppendorf
1,5 ml.
7. Stok suspensi sel ini dapat disimpan dalam refrigerator dan diaduk dengan
pipet jika akan digunakan.
8. Pembuatan preparat dan pewarnaan dilakukan dengan cara meneteskan
suspensi sel di atas gelas benda bersih dari ketinggian sekitar 15-20 cm.
 UNIVERSITAS GADJAH MADA
LABORATORIUM PENELITIAN DAN PENGUJIAN TERPADU

INSTRUKSI KERJA UJI No. Dokumen : IKU/5.4/BI-GT/Krom-03

Halaman : 4 dari 5
PREPARASI KROMOSOM HEWAN Tgl. Terbit : 03/09/14
Revisi :0

9. Preparat dibiarkan kering pada suhu kamar. Setelah itu preparat diwarnai
dengan Giemsa 2 % selama 20 menit pada suhu kamar.
10. Pewarnaan dilakukan dengan cara meneteskan Giemsa di atas preparat
hingga menutupi seluruh permukaannya.
11. Preparat didiamkan selama 20 menit, selanjutnya preparat dicuci dengan
akuades yang mengalir sampai giemsa terbilas dengan sempurna. Lalu
dikering-anginkan kembali lalu ditambahkan gliserin untuk meningkatkan
indeks bias kemudian ditutup menggunakan gelas penutup. Proses
menyegelan gelas penutup dapat menggunakan kutex pada bagian tepi gelas
benda.
12. Preparat diberi label dan dapat disimpan dalam kotak preparat pada suhu
kamar.
4.6.Pengamatan dan Pemotretan
1. Setelah preparasi selesai, preparat diamati di bawah mikroskop cahaya di
Laboratorium Genetika Fakultas Biologi UGM dengan perbesaran 10x, 40x,
dan 100x untuk mengamati fase mitosis yang terjadi
2. Pemotretan dilakukan ketika perbesaran 40x menggunakan kamera digital
3. Berdasarkan gambar tersebut kemudian diamati dan ditentukan jenis fase
mitosis yang tampak
4. Selanjutnya, preparat juga diamati menggunakan mikroskop milik LPPT
UGM dengan perbesaran 100x, agar kromosom pada fase prometafase
terlihat jelas
5. Dari sekian foto, diambil foto yang menunjukkan fase prometafase yang
paling jelas untuk dijadikan dasar dalam menghitung jumlah kromosom.

Isi Dokumen ini tidak diperkenankan untuk disalin atau digandakan tanpa seijin dari
Manajer Puncak Laboratorium Penelitian Pengujian Terpadu Universitas Gadjah Mada.
 UNIVERSITAS GADJAH MADA
LABORATORIUM PENELITIAN DAN PENGUJIAN TERPADU

INSTRUKSI KERJA UJI No. Dokumen : IKU/5.4/BI-GT/Krom-03

Halaman : 5 dari 5
PREPARASI KROMOSOM HEWAN Tgl. Terbit : 03/09/14
Revisi :0

5. PENGENDALIAN MUTU
Gunakan mikroskop dengan perbesaran tinggi agar kromosom yang diamati tampak
jelas saat dipotret. Lakukan preparasi triplo untuk kontrol presisi analisis.

Disiapkan Oleh Diperiksa Oleh Disahkan Oleh

Nama

Subakir Ganies Riza Aristya, Dr. Niken Satuti Nur

S.Si., M.Sc. Handayani, M.Sc.

Tanggal 26 Oktober 2015 26 Oktober 2015 26 Oktober 2015

Isi Dokumen ini tidak diperkenankan untuk disalin atau digandakan tanpa seijin dari
Manajer Puncak Laboratorium Penelitian Pengujian Terpadu Universitas Gadjah Mada.