PAPARAN HASIL PENELITIAN

IDENTIFIKASI 7-OH MITRAGYNINE

MENGGUNAKAN LC-HRMS

Erlana Nindya M.
Martin Luther S.

SUBBID RISET BID MUTU DAN RISET

P U S AT L A B O R AT O R I U M N A R KOT I K A B N N
Outline
1. Tinjauan Pustaka
a. Mitragynine dan 7-hydroxymitragynine (7-OH mitragynine)
b. LC-HRMS
2. Tujuan Penelitian
3. Sampel Penelitian
4. Optimasi Metode
5. Identifikasi 7-OH mitragynine dengan metode terpilih
6. Hasil penelitian
7. Kesimpulan
 Mitragyna speciosa
Klasifikasi Tumbuhan
Kerajaan : Plantae
Filum : Traceophyta
Kelas : Magnoliopsida
Bangsa : Rubiales
Suku : Rubiaceae
Marga : Mitragyna
Jenis : Mitragyna speciosa (Korth.) Havil

Pohon kratom secara normal tumbuh dengan tinggi ± 4-9 m

namun ada yang melaporkan tingginya bisa mencapai 15-30 m.

Kratom merupakan tumbuhan asli Asia Tenggara. Di Indonesia,

kebun kratom tersebar di sejumlah daerah di Kalimantan
Barat.
Kratom dikenal dengan nama biak-biak atau ketum (di Malaysia)
atau di Thailand disebut sebagai kakaum atau karton atau ithang
atau Thom.
Kandungan Kimia Mitragyna speciosa
 Terdapat lebih dari 40 senyawa telah diisolasi dan diidentifikasi dari
kratom, diantaranya alkaloid, terutama turunan indol (sebagai
kandungan utama), flavonoid, polifenol, tanin, triterpenoid, saponin
dan glikosida.
 Lebih dari 25 alkaloid berhasil diisolasi dari tumbuhan kratom.
Alkaloid pada tumbuhan ditemukan dalam kadar berbeda-beda
tergantung pada umur tumbuhan, lingkungan tempat tumbuh dan
bagian tumbuhan yang digunakan.
 Pada daun ditemukan mitragynine, 7-hydroxymitragynine, painantin,
spesiosiliatin, ajmalin, korinantidin, mitrasiliatin, korinantidin,
isokorinamtidin, spesiogenin, rinkosilin, siliafilin, spesionoksin,
isospesionoksin, rinkofilin, isorinkofilin, mitrafilin, isomitrafilin,
mitrajavin, javafilin, akuammigin, 3-dehidromitraginin dan 3,4,5,6,
tertrahidromitraginin.
 Senyawa yang memberikan efek psikoaktif pada kratom adalah
golongan alkaloid yaitu jenis mitragynine, mitragynine
hydroxyindolenin (7-hydroxymitragynine), dan mitragynine
pseudoindoxyl.

(Gogineni dkk., 2015; Said dkk., 1991, Novindriana dkk., 2015 , Preedy, 2016, Houghton dkk., 1991;
Shellard dkk., 1978, Leon dkk., 2009; Takayama dkk., 1998, dan Van Valkenburg, Bunyapraphatsara,
2002).
Mitragynine vs 7-Hydroxymitragynine
EFEK

Rendah Sedang Tinggi

(1 -5 g daun (5 –15 g) (16 g atau lebih)
segar)
• Opioid-like effect • Sedatif dan dapat
• Stimulan (menginduksi juga
ringan euforia tetapi menimbulkan
cenderung kurang stupor,
poten mneyerupai efek
dibandingkan opioid
efek yang
ditimbulkan oleh
opium)

Mitragynine dan 7-Hydroxymitragynine bertanggungjawab

terhadap efek sedatif yang ditimbulkan.
 Alkaloid utama dalam tumbuhan Prozialeck, W. C., dkk., 2012; Apryani dkk., 2010; Gogineni dkk., 2015.
kratom adalah mitragynine
 7-Hydroxymitragynine umumnya
ditemukan dalam jumlah sedikit
 7-Hydroxymitragynine

 Gugus fungsi yang berperan penting dalam kekuatan

ikatan dengan reseptor opioid adalah gugus substitusi pada
C-7.
 Gugus hidroksil pada C-7 menjadikan 7-hidroksimitraginin
46 kali lebih kuat efeknya dibandingkan mitraginin dan 13
kali lebih kuat dibandingkan morfin.
 Gugus hidroksil  meningkatan afinitas senyawa terhadap µ-
opioid reseptor yang ada di otak.
 Selain gugus substitusi pada C-7, hal lain yang menentukan
kekuatan aktivitas dari 7-hidroksimitraginin adalah posisi C-9
yang berperan dalam aktivitas intrinsik senyawa, keberadaan
beta metoksiakrilat penting untuk aktivitas reseptor opioid,
dan pasangan elektron pada gugus N penting untuk ikatan
dengan reseptor opioid.

Apryani dkk., 2010, Matsumoto dkk., 2004, Gogineni dkk., 2015

 Fragmentasi
7-Hydroxymitragynine
(proposed)
 Fragmentasi
7-Hydroxymitragynine
(proposed)

Vuppala, P.K. et al., 2013

LC-HRMS (Liquid Chromatography – High Resolution Mass Spectrometer)
Accurate mass

LC-HRMS (Liquid Chromatography – High Resolution Mass Spectrometer)

LC-HRMS
 High Resolution apabila R > 15.000
 R < 15.000 resolusi / pemisahannya jelek
 R = 25.000 – 50.000  sudah bisa
memisahkan, tetapi 100.000 jauh lebih baik
 HRMS bisa mencapai R = 100.000
 Accurate mass high resolution platforms
5 angka di belakang koma (lebih akurat)
 Akurasi massa bergantung pada resolusi
 Higher resolution  better mass accuracy
 TUJUAN Analisis serbuk daun kratom menggunakan GCMS

PENELITIAN Mitragynine
Rt : 33,424
 Melakukan identifikasi senyawa
7-OH mitragynine dalam sampel
serbuk daun kratom
menggunakan LC-HRMS

 Memanfaatkan teknologi resolusi Analisis serbuk daun kratom menggunakan UPLC-PDA

tinggi pada HRMS untuk
Mitragynine Standar mitragynine
mendeteksi 7-OH mitragynine
Rt : 3,129
yang merupakan minor alkaloid
dalam tanaman kratom, dimana
7-OH mitragynine tidak dapat
terdeteksi menggunakan
Mitragynine Sampel serbuk daun
instrumen GCMS & UPLC-PDA. Rt : 3,086 kratom

7-OH mitragynine tidak terdeteksi pada instrumen GCMS dan UPLC-PDA

 KASUS KRATOM DIKIRIM KE LAB BNN (2013-2018)
JUMLAH SAMPEL KRATOM YANG DIANALISIS Regulasi :
DI LAB BNN
6
 UNODC memasukkan kratom sebagai salah satu
5
jenis NPS sejak tahun 2013.
4  Kratom juga belum diatur dalam UN Convention
3 1961 maupun UN Convention 1971
2  Kratom belum diatur dalam Permenkes
1 Perubahan Penggolongan Narkotika/Psikotropika
0 di Indonesia
2013 2014 2015 2016 2017 2018

Diharapkan identifikasi senyawa 7-OH mitragynine

KASUS LAHGUN DATANYA MASIH TERBATAS KARENA
KRATOM MASIH LEGAL SEHINGGA TIDAK DITANGANI
LANGSUNG OLEH PENYIDIK YANG MENGIRIMKAN
SAMPEL KE LAB BNN
sebagai alkaloid minor dalam tanaman kratom
dapat memperkuat data dukung analisis
laboratorium dalam pengajuan kratom sebagai
narkotika/psikotropika
 Total sampel penelitian : 4 sampel
1. Serbuk daun kratom dalam kemasan ‘Kratom Green’

2. Serbuk daun kratom dalam kemasan ‘Kratom White’

3. Serbuk daun kratom dalam kemasan ‘Kratom Yellow’

4. Serbuk daun kratom dengan no. Lab SS 10 BJ (unknown strain)

SAMPEL
PENELITIAN
 PREPARASI SAMPEL
Menyiapkan sampel mitragynine (dengan kadar mitragynine terhitung) dari hasil
analisis UPLC-PDA pada pengembangan metode sebelumnya (@3 sampel replika)

Melakukan pengenceran bertingkat terhadap sampel dengan Water : MeOH (75 :

25) hingga diperoleh konsentrasi di bawah 1 ppb (800 ppb, 600 ppb)

Melakukan analisis sampel pada LC-HRMS

 PREPARASI STANDAR MITRAGYNINE
Menimbang 5 mg standar mitragynine dalam 50 ml
metanol (100 ppm) sebagai stock solution

Melakukan pengenceran bertingkat hingga diperoleh

konsentrasi di bawah 1 ppb (400 ppb, 200 ppb)

Melakukan analisis sampel pada LC-HRMS

Lipomed 93% purity
 Variabel yang dapat dioptimasi dalam analisis
menggunakan LC-HRMS antara lain :
OPTIMASI 1. Metode LC (fase gerak dan gradien)
METODE
2. Metode HRMS

3. Volume injeksi sampel

 Sampel (SS 10 BJ) ‘Tanpa Isolasi’ dibuat dalam
konsentrasi 100 ppb
Metode Injeksi :
Fase gerak A : 0,1% FA in water ; B : 0,1% FA in ACN
OPTIMASI
METODE

(1)
 Sampel (SS 10 BJ) ‘Tanpa Isolasi’ dibuat dalam
konsentrasi 100 ppb
Metode HRMS :
Q Exactive Plus Method Setting :

OPTIMASI  Heated ESI, positive and negative

METODE  Nebulizing & Collision Gas -
Nitrogen
 Full Scan @70,000 resolution
(1)  Top 5 ddMS/MS @17,500
resolution
 Compound Identification by
Compound
 Discover 2.1 with Forensic
Workflow
 Raw data interpretation by Xcalibur
and FreeStyle Software
 Hasil optimasi :
OPTIMASI Mitragynine dapat terdeteksi dengan baik dan terbaca pada
METODE library m/z cloud. Namun, 7-OH mitragynine tidak terdeteksi.
Terdapat fragmen m/z 415 (M+1) tetapi fragmen pecahan
lainnya tidak terdeteksi. 7-OH mitragynine terdapat dalam
(1) database m/z cloud.

MITRAGYNINE

Kesimpulan : Konsentrasi
kemungkinan terlalu kecil

Rencana Optimasi
selanjutnya :
MITRAGYNINE
 Menaikkan konsentrasi m/z cloud
sampel menjadi 2 kalinya database

 Ganti metode
 Sampel (SS 10 BJ) ‘Tanpa Isolasi’ dibuat dalam
konsentrasi 215 ppb
Metode Injeksi : Metode Isokratik sesuai jurnal
Vuppala, P.K., et al (2013)

OPTIMASI Fase gerak A : 0,1% AA in water

B : 0,1% AA in ACN
METODE

(2)

Hasil Optimasi Metode Isokratik

Terdapat fragmen m/z 415 (M+1) tetapi fragmen

pecahan lainnya tidak terdeteksi.
 Sampel (SS10BJ) ‘Tanpa Isolasi’ dibuat dalam konsentrasi 215 ppb
dan 400 ppb
Metode LC :

OPTIMASI
METODE

(3)
 Sampel (SS10BJ) ‘Tanpa Isolasi’ dibuat dalam konsentrasi 215 ppb
dan 400 ppb
Metode HRMS :

OPTIMASI
METODE

(3)
 Hasil optimasi :

Pada konsentrasi 215 ppb dan 400 ppb, mitragynine terdeteksi

namun 7-OH mitragynine tidak terdeteksi.

MITRAGYNINE
terdeteksi
OPTIMASI
METODE MITRAGYNINE

(3)
7-OH MITRAGYNINE
Tidak
terdeteksi

Kesimpulan :

Metode kurang sesuai karena Rt terlalu maju (0,35)  ganti fase

gerak dan gradien injeksi.
 Sampel (SS10BJ) ‘Tanpa Isolasi’ dibuat dalam konsentrasi 400 ppb

Mengganti LC :

OPTIMASI
METODE

(4)
 Sampel (SS10BJ) ‘Tanpa Isolasi’ dibuat dalam konsentrasi 400 ppb

Metode HRMS :

OPTIMASI
METODE

(4)
OPTIMASI Hasil Optimasi Metode 4 :

METODE  Rt mitragynine mundur menjadi 2,83 (lebih baik)

 Terdeteksi massa 7-OH mitragynine yaitu 415,22 (M+1) dan
beberapa pecahan frgamennya pada Rt 2,80, tetapi fragmen yang
(4) dihasilkan tidak lengkap.

397 ?
162 ?
175 ?
 Diputuskan untuk menggunakan metode
optimasi 4 (fase grak A : 0,1% FA in water dan
fase gerak B : LCMS grade methanol), dengan
menaikkan konsentrasi sampel menjadi 600 ppb
METODE
TERPILIH dan 800 ppb.

Standar mitragynine (purity 93%) dianalisis pada

konsentrasi lebih rendah yaitu mulai dari 200
ppb hingga 400 ppb.
HASIL PENELITIAN
 MITRAGYNINE; RT 3,03
Pada Standar
mitragynine 200
ppb terdeteksi
peak yang diduga
merupakan 7-OH
mitragynine.
Fragmen yang
dihasilkan sama
dengan fragmen
7-OH MITRAGYNINE; RT 2,63 7-OH mitragynine
pada jurnal
Vuppala P.K. et al
(2013).

Spektra Standar Mitragynine 200 ppb

 Standar
Replika 1 (Rt
bergeser, tidak
dianalisis ulang)

7-OHMG Tidak terdeteksi

Replika 2

7-OHMG Terdeteksi Replika 3

Line merah : 7-OHMG

Line biru : MG

Spektra Sampel dalam kemasan Kratom Green (Konsentrasi Mitragynine 600 ppb)
 Replika 1

Replika 2

Replika 3

Line merah : 7-OHMG

Line biru : MG

Spektra Sampel dalam kemasan Kratom Green (Konsentrasi Mitragynine 800 ppb)
 Mass Spektrum 7-Hydroxy Mitragynine

Fragmen Lengkap

Mass Spektrum Mitragynine

Fragmen Lengkap

Mass Spektrum Sampel dalam kemasan Kratom Green (Konsentrasi Mitragynine 800 ppb)
 Standar
Replika 1 (Rt
bergeser, tidak
dianalisis ulang)

7-OHMG Tidak terdeteksi

Replika 2

7-OHMG Tidak terdeteksi

Replika 3

Line merah : 7-OHMG

Line biru : MG

Spektra Sampel dalam kemasan Kratom White (Konsentrasi Mitragynine 600 ppb)
 Replika 1

Replika 2

Replika 3

Line merah : 7-OHMG

Line biru : MG

Spektra Sampel dalam kemasan Kratom White (Konsentrasi Mitragynine 800 ppb)
 Mass Spektrum 7-Hydroxy Mitragynine

Fragmen Lengkap

Mass Spektrum Mitragynine

Fragmen Lengkap

Mass Spektrum Sampel dalam kemasan Kratom White (Konsentrasi Mitragynine 800 ppb)
 Standar
Replika 1 (Rt
bergeser, tidak
dianalisis ulang)

7-OHMG Terdeteksi
Replika 2

7-OHMG Tidak terdeteksi Replika 3

Line merah : 7-OHMG

Line biru : MG

Spektra Sampel dalam kemasan Kratom Yellow (Konsentrasi Mitragynine 600 ppb)
 Replika 1

Replika 2

Replika 3

Line merah : 7-OHMG

Line biru : MG

Spektra Sampel dalam kemasan Kratom Yellow (Konsentrasi Mitragynine 800 ppb)
 Mass Spektrum 7-Hydroxy Mitragynine

Fragmen Lengkap

Mass Spektrum Mitragynine

Fragmen Lengkap

Mass Spektrum Sampel dalam kemasan Kratom Yellow (Konsentrasi Mitragynine 800 ppb)
 Standar
Replika 1 (Rt
bergeser, tidak
dianalisis ulang)

7-OHMG Terdeteksi
Replika 2

7-OHMG Terdeteksi Replika 3

Line merah : 7-OHMG

Line biru : MG

Spektra Sampel SS 10 BJ (Konsentrasi Mitragynine 600 ppb)

 Replika 1

Replika 2

Replika 3

Line merah : 7-OHMG

Line biru : MG

Spektra Sampel SS 10 BJ (Konsentrasi Mitragynine 800 ppb)

Mass Spektrum 7-Hydroxy Mitragynine

Fragmen Lengkap

Mass Spektrum Mitragynine

Fragmen Lengkap

Mass Spektrum Sampel SS 10 BJ (Konsentrasi Mitragynine 800 ppb)

 RANGKUMAN DATA
7-OH Mitragynine
7-OH Mitragynine (R2) 7-OH Mitragynine (R3)
Replikasi Mean Area
Ripitasi Area Rt Ripitasi Area Rt
1 252604
1 - - 1 - -
2 233425
2 - - 2 - -
3 - - 3 - - 3 222139.67
Mean - - Mean - - Mean 236056.2222
Stdev - - Stdev - - Mitragynine
RSD - - RSD - - Replikasi Mean Area
7-OH Mitragynine (R1) 7-OH Mitragynine (R2) 7-OH Mitragynine (R3) 1 113491834.67
Ripitasi Area Rt 2 102747631
Ripitasi Area Rt Ripitasi Area Rt
3 120736442.67
1 256957 2.8039 1 223878 2.7287 1 227915 2.7505 Mean 112325302.7778
2 255684 2.8019 2 245058 2.7471 2 215205 2.7361
3 245171 2.8010 3 231339 2.7520 3 223299 2.7408 Estimasi perbandingan kadar
Mean 252604 2.8023 Mean 233425 2.7426 Mean 222139.7 2.7425 (7-OH mitragynine /
Stdev 6468.558 0.0015 Stdev 10742.98 0.0123 Stdev 6433.822 0.0073
RSD 2.5608 0.0518 RSD 4.6023 0.4478 RSD 2.8963 0.2679
mitragynine) = 0,21%

Data Luas Area Sampel dalam kemasan Kratom Green

 RANGKUMAN DATA
7-OH Mitragynine
7-OH Mitragynine 7-OH Mitragynine Replikasi Mean Area
Ripitasi Area Rt Ripitasi Area Rt 1 256601.33
1 - - 1 - - 2 220614.33
2 - - 2 - - 3 210694
3 - - 3 - - Mean 229303.22
Mean - - Mean - -
Stdev - - Stdev - - Mitragynine
RSD - - RSD - - Replikasi Mean Area
1 98881649
7-OH Mitragynine 7-OH Mitragynine 7-OH Mitragynine 2 102484821.67
Ripitasi Area Rt Ripitasi Area Rt Ripitasi Area Rt 3 97472684
1 263124 2.7882 1 226745 2.7490 1 218936 2.7007 Mean 99613051.5556
2 250231 2.7950 2 219784 2.7435 2 210378 2.7477
3 256449 2.7891 3 215314 2.7512 3 202768 2.7816 Estimasi perbandingan kadar
Mean 256601.3 2.7907 Mean 220614.3 2.7479 Mean 210694 2.7433 (7-OH mitragynine /
Stdev 6447.85 0.0037 Stdev 5760.558 0.0040 Stdev 8088.631 0.0406
RSD 2.5128 0.1321 RSD 2.6111 0.1457 RSD 3.8390 1.4799
mitragynine) = 0,23%

Data Luas Area Sampel dalam kemasan Kratom White

 RANGKUMAN DATA
7-OH Mitragynine 7-OH Mitragynine 7-OH Mitragynine
Ripitasi Area Rt Ripitasi Area Rt Replikasi Mean Area
1 - - 1 - - 1 273116
2 - - 2 - - 2 375212
3 - - 3 - - 3 364907.33
Mean - - Mean - - Mean 337745.1111
Stdev - - Stdev - - Mitragynine
RSD - - RSD - - Replikasi Mean Area
7-OH Mitragynine 7-OH Mitragynine 7-OH Mitragynine 1 123829923.67
Ripitasi Area Rt Ripitasi Area Rt Ripitasi Area Rt 2 108444390
1 270018 2.7222 1 394175 2.3095 1 351921 2.3095 3 95760973
2 280811 2.7269 2 373163 2.2940 2 367580 2.2940 Mean 109345095.6
3 268519 2.7515 3 358298 2.2965 3 375221 2.2965
Mean 273116 2.7335 Mean 375212 2.3000
Estimasi perbandingan kadar
Mean 364907.3 2.3000
Stdev 6706.081 0.0157 Stdev 18026.05 0.0083 Stdev 11877.7 0.0083
(7-OH mitragynine /
RSD 2.4554 0.5757 RSD 4.8042 0.3620 RSD 3.2550 0.3620 mitragynine) = 0,31%

Data Luas Area Sampel dalam kemasan Kratom Yellow

 RANGKUMAN DATA
7-OH Mitragynine 7-OH Mitragynine 7-OH Mitragynine
Ripitasi Area Rt Ripitasi Area Rt Replikasi Mean Area
1 246904 2.64085 1 255318 2.63639 1 256874
2 225267 2.63778 2 257178 2.62894 2 200236.67
3 230891 2.63224 3 247664 2.62349 3 273611.67
Mean 234354 2.6370 Mean 253386.7 2.6296 Mean 243574.1111
Stdev 11226.5 0.0044 Stdev 5042.478 0.0065 Mitragynine
RSD 4.7904 0.1655 RSD 1.9900 0.2463 Replikasi Mean Area
7-OH Mitragynine 7-OH Mitragynine 7-OH Mitragynine 1 94663944.67
Ripitasi Area Rt Ripitasi Area Rt Ripitasi Area Rt 2 83311656.67
1 259524 2.6513 1 203343 2.6527 3 78733448.33
1 278337 2.6073
2 254818 2.6423 2 190008 2.6163 Mean 85569683.2222
2 273441 2.6267
3 256280 2.6873 3 207359 2.6283 3 269057 2.6205 Estimasi perbandingan kadar
Mean 256874 2.6603 Mean 200236.7 2.6324 Mean 273611.7 2.6182
(7-OH mitragynine /
Stdev 2408.576 0.0238 Stdev 9083.022 0.0186 Stdev 4642.353 0.0099
RSD 0.9376 0.8959 RSD 4.5361 0.7058
mitragynine) = 0,28%
RSD 1.6967 0.3773

Data Luas Area Sampel SS 10 BJ

 KESIMPULAN
 Metode analisis yang dioptimasi (metode optimasi 4) dapat diaplikasikan
untuk mengidentifikasi 7-OH mitragynine dalam sampel serbuk daun kratom.
 Peak diduga 7-OH mitagynine teridentifikasi pada Standar mitragynine 200
ppb (Lipomed, 93%).
 Sampel serbuk daun kratom dalam kemasan Kratom Green, White dan Yellow
mempunyai titik LOD yang sama yaitu pada konsentrasi mitragynine 800 ppb.
 Titik LOD Sampel SS 10 BJ diduga pada konsentrasi mitragynine 600 ppb,
namun perlu dilakukan analisis lanjutan terhadap sampel replika 1.
 Perbedaan titik LOD pada sampel dipengaruhi oleh umur tumbuhan dan
lingkungan tempat tumbuh tanaman. Secara visual, sampel SS 10 BJ
berwarna lebih hijau dan segar dibandingkan dengan sampel strain lain yang
diteliti.
 Estimasi perbandingan kadar 7-OH mitragynine dengan mitragynine dalam
sampel serbuk daun kratom adalah 0,21 – 0,31 %.
 THANKYOU

THANK YOU