Aplikasi Fermentasi Batch

Selama fermentasi batch tertentu kondisi lingkungan terus berubah,

terutama nutrisi dan konsentrasi produk, seperti halnya pertumbuhan spesifik,
karena sel-sel harus melewati urutan fase pertumbuhan. Akibatnya, sistem tidak
pernah mencapai kondisi steady-state. Kelemahan selanjutnya adalah bahwa
beberapa yang berbeda tahapan yang terkait dengan operasi fermentasi batch:

1. pengisian dari fermentasi dengan media segar;

2. sterilisasi fermentasi dan media;
3. inokulasi fermentor;
4. produksi produk mikroba;
5. pemanenan biomassa dan penghabisan kaldu fermentasi ;
dan akhirnya
6. pembersihan tempat.

Hal ini memiliki implikasi ekonomi utama untuk proses industri. Untuk
jangka waktu yang cukup lama, tempat fermentasi tidak menghasilkan mikroba
produk, tetapi sedang dibersihkan, diisi, disterilisasi, dll periode non-produktif
disebut sebagai down-time dari fermentor. Selama pengembangan proses batch,
parameter utama pertumbuhan dapat ditentukan kemungkinkan produksi
dari produk mikroba tertentu harus dioptimalkan, apakah itu adalah biomassa itu
sendiri atau metabolit tertentu. Parameter penting adalah koefisien yield (Y),
yang ditentukan berdasarkan jumlah tingkat membatasi nutrisi, biasanya sumber
karbohidrat, diubah menjadi produk mikroba. Dalam hal biomassa, itu
didefinisikan sebagai

(1.1)

di mana x = konsentrasi biomassa (g / L), Yx / S = koefisien yield (g biomassa / g

substrat digunakan), S = substrat awal konsentrasi (g / L), dan Sr = sisa substrat
konsentrasi (g / L).

Dalam kasus produksi biomassa, koefisien hasil berkaitan dengan

kuantitas biomassa yang dihasilkan per gram substrat digunakan. Oleh karena itu,
semakin tinggi koefisien yield, semakin besar persentase substrat asli dikonversi
menjadi biomassa mikroba. Untuk metabolisme mikroba produk (p) koefisien
hasil berkaitan dengan kuantitas metabolit yang dihasilkan dalam kaitannya
dengan kuantitas substrat yang digunakan (Yp / S). Penentuan koefisien hasil
sangat penting karena biaya media fermentasi, terutama sumber karbon,
bisa menjadi proporsi yang signifikan dari produksi keseluruhan biaya.

Dengan melakukan berbagai percobaan dengan di bawah kondisi berbeda,

berbagai media konstituen dan konsentrasi komponen, pH, suhu, dll, optimum
kondisi pertumbuhan / produksi dapat dibentuk. Hal ini juga penting untuk
menentukan spesifik maksimum tingkat pertumbuhan (µmax) dari organisme
produksi. Terutama berlaku untuk metabolit primer, di mana produk
formasi yang berhubungan dengan pertumbuhan. Untuk mengoptimalkan
keseluruhan produktivitas sistem, mikroorganisme harus biasanya tumbuh di
µmax nya. Seperti yang dinyatakan sebelumnya, konsentrasi substrat operasi
memiliki pengaruh besar pada laju pertumbuhan mikroorganisme. Dengan
melakukan serangkaian fermentasi batch, masing-masing dengan awal yang
berbeda konsentrasi substrat pembatas, spesifik tingkat pertumbuhan (µ) untuk
setiap percobaan dapat ditentukan. Data ini kemudian dapat digunakan untuk
memperkirakan kedua µmax dan konstanta saturasi (Ks) dengan hanya mengambil
timbal balik nilai dalam persamaan Monod dan menata ulang persamaan

(1.2)

atau

dan (1.3)
Kinetika Pertumbuhan Lanjut

Fermentasi kultur kontinyu memiliki banyak aplikasi untuk kedua

penelitian laboratorium dan skala industri proses. Studi dapat dilakukan pada
semua aspek sel pertumbuhan, fisiologi dan biokimia. Mereka berguna untuk studi
ekologi dan sebagai alat genetika untuk pemeriksaan tingkat mutasi, efek
mutagenik, dll. Aplikasi dalam fermentasi industri mengatasi banyak keterbatasan
proses batch. Awalnya, fermentasi kontinyu mulai sebagai biakan batch,
namun pertumbuhan eksponensial kemudian dapat diperpanjang tanpa batas
waktu, dalam teori, melalui penambahan terus menerus media fermentasi segar.
Reaktor secara terus menerus diaduk dan volume konstan dipertahankan dengan
memasukkan sebuah bendung meluap atau perangkat rata lainnya (Gbr. 1). Media
segar terus ditambahkan dan dapat digantikan oleh volume yang sama
menghabiskan kaldu fermentasi dan sel-sel di tingkat yang sama seperti media
segar diperkenalkan. Steady State kondisi berlaku, di mana tingkat sel mikroba
tumbuh sama dengan tingkat di mana sel-sel yang mengungsi dari bejana.

Gambar 1. Alat lanjutan biakan

Seperti fermentasi batch, tingkat tertentu pada yang mikroorganisme
tumbuh dalam biakan terus menerus dikendalikan oleh ketersediaan tingkat
pembatas nutrisi. Oleh karena itu, laju penambahan media segar mengontrol
tingkat di mana mikroorganisme tumbuh. Namun, tingkat pertumbuhan
sebenarnya tidak hanya bergantung pada laju aliran volumetrik dari media ke
dalam reaktor, tetapi juga pada tingkat pengenceran (D). Ini sama dengan nomor
volume reaktor melewati reaktor per unit waktu dan dinyatakan dalam satuan
waktu timbal balik, per jam.
 (1.4)

di mana D = pengenceran rate (per jam), F = aliran (L / h) dan V = volume reaktor

(L).

Istilah D adalah kebalikan dari tinggal rata-rata waktu atau waktu retensi
hidrolik, seperti yang digunakan dalam air limbah pemulihan. Penambahan media
segar ke dalam reaktor dapat dikendalikan pada nilai tetap, oleh karena itu
tingkat penambahan nutrisi tingkat-membatasi adalah konstan. Dalam batas-batas
tertentu, tingkat pertumbuhan dan laju hilangnya sel dari fermentor akan
ditentukan dengan tingkat masukan media. Oleh karena itu, di bawah SteadyState
kondisi keseimbangan biomassa bersih dapat digambarkan sebagai

(1.5)

(1.6)

Dalam kondisi steady-state laju pertumbuhan = tingkat kerugian, maka dx / dt = 0

dan karena itu

(1.7)

(1.8)

Akibatnya, pada tingkat aliran tetap dan tingkat pengenceran di bawah

kondisi operasi konstan fisik dan kimia, yaitu dalam kondisi steady-state, yang
laju spesifik pertumbuhan mikroorganisme tergantung pada operasi tingkat
pengenceran, sampai nilai maksimum sebesar µmax (Gbr. 2). Jika tingkat
pengenceran meningkat di atas µmax, lengkap dicuci keluar dari sel, karena sel-
sel punya waktu cukup untuk 'ganda' sebelum dicuci dari reaktor melalui
overflow. Titik di mana ini hanya dihindari disebut sebagai pengenceran kritis rate
(Dcrit).

Gambar 2. Pertumbuhan mikroorganisme dalam chemostat biakan terus menerus

Untuk setiap tingkat pengenceran tertentu, dalam kondisi steady-state,

konsentrasi substrat sisa dalam reaktor dapat diprediksi dengan menggantikan D
untuk µ di Monod persamaan

(1.9)

di mana Sr adalah konsentrasi sisa substrat steady-state dalam reaktor pada tingkat
pengenceran tetap.

Akibatnya, konsentrasi substrat sisa dalam reaktor dikontrol oleh tingkat

pengenceran. Perubahan apapun ini hasil tingkat pengenceran dalam perubahan
laju pertumbuhan sel-sel yang akan tergantung pada substrat ketersediaan di
tingkat pengenceran baru. Dengan demikian, pertumbuhan dikendalikan oleh
ketersediaan tingkat pembatas nutrisi. Sistem ini, di mana konsentrasi tingkat
pembatas nutrisi memasuki sistem adalah tetap, adalah sering digambarkan
sebagai chemostat, sebagai lawan untuk operasi sebagai turbidostat, di mana
nutrisi dalam medium tidak membatasi. Dalam hal ini kekeruhan atau absorbansi
budaya dimonitor dan dijaga pada nilai konstan dengan mengatur tingkat
pengenceran, yaitu konsentrasi sel konstan diadakan.

Oleh karena itu, konsentrasi biomassa di bawah kondisi Steady State

dikendalikan oleh konsentrasi umpan substrat dan tingkat pengenceran operasi. Di
bawah kondisi non-inhibitor, di mana tidak ada substrat atau inhibisi produk,
semakin tinggi konsentrasi pakan, semakin besar konsentrasi biomassa dan sisa
substrat, konsentrasi tetap konstan. Namun, tinggi tingkat pengenceran, semakin
cepat sel-sel tumbuh, yang hasil dalam peningkatan simultan dalam substrat sisa
konsentrasi dan penurunan konsekuen dalam konsentrasi biomassa steady state.

Pemantauan pertumbuhan mikroba dalam biakan

Selama fermentasi, metode yang diperlukan untuk penentuan rutin dari

populasi mikroba, sel jumlah dan / atau biomassa, untuk memantau kemajuan.
Banyak metode langsung dan tidak langsung yang tersedia untuk tujuan ini.
Prosedur langsung melibatkan penentuan berat, menghitung sel dengan mikroskop
dan metode penghitungan piring. Metode tidak langsung meliputi turbidimetri,
spektrofotometri, estimasi sel komponen (protein, DNA, RNA atau ATP), dan
secara online pemantauan produksi karbon dioksida atau oksigen pemanfaatan.
Metode yang diterapkan dalam situasi tertentu tergantung pada fermentasi dan
persyaratan khusus. Beberapa faktor yang harus dipertimbangkan, seperti
tingkat akurasi dan sensitivitas yang diperlukan, dan durasi analisis. Estimasi
organisme uniseluler, asalkan mereka tidak rentan terhadap flokulasi,
relatif mudah, tapi berserabut organisme, jamur dan aktinomisetes hadir tambahan

masalah.
Metode penghitungan mikroskopis langsung
Jumlah sel dalam suspensi dapat diukur, kecuali untuk organisme filamen,
berdasarkan mikroskopis jumlah langsung, menggunakan Petroff-Hauser atau
Neubauer Jenis penghitungan ruang. Yang pertama adalah lebih cocok untuk
menghitung bakteri. Perhitungan grid, ketika ruang tersebut ditutupi dengan
coverslip kaca, tahan volume yang diketahui biakannya. Dengan menghitung
jumlah sel dalam proporsi grid, jumlah sel per mililiter dapat ditentukan. Jumlah
mikroskopis langsung adalah cepat, tetapi dibatasi oleh ketidakmampuan mereka
untuk membedakan hidup dari sel-sel mati, kecuali dibedakan dengan
menggunakan pewarnaan penting teknik. Juga, sampel harus berisi relatif
konsentrasi sel yang tinggi, biasanya minimal 5X106 sel / mL.
Counter sel Elektronik
Sel elektronik penghitungan peralatan juga cepat, tapi
kebanyakan metode yang lebih cocok untuk yang lebih besar mikroba uniseluler,
seperti ragi, protozoa dan beberapa ganggang, dan kurang berguna untuk
memperkirakan bakteri. Coulter Counter, misalnya, digunakan untuk menghitung
dan partikel ukuran, dan berdasarkan pengukuran perubahan hambatan listrik
diproduksi oleh partikel non-konduktif ditangguhkan dalam elektrolit. Metode ini
melibatkan gambar suspensi sel melalui aperture kecil di mana
arus listrik dipertahankan. Namun, pada dasarnya menghitung partikel, dan
akibatnya rentan terhadap kesalahan karena sel-sel menggumpal dan adanya
puing-puing partikulat.
Teknik menghitung piring
Metode penghitungan piring mendeteksi sel-sel yang layak, yaitu orang
yang mampu membentuk koloni pada media nutrien padat yang sesuai. Dua
metode rutin digunakan tersebar plating dan tuangkan plating. Sebelum plating,
biasanya perlu untuk menyiapkan pengenceran seri seri di pengencer steril
untuk suspensi sel pekat. Atau, untuk sampel dengan jumlah sel yang rendah,
seperti dalam analisis air, langkah konsentrasi diperlukan.
Teknik Turbidimetri spektrofotometri
Metode ini sederhana, cepat dan nyaman berarti estimasi total biomassa.
Mereka biasanya dilakukan pada panjang gelombang optimum yang spesifik
untuk masing-masing mikroorganisme. Metode turbidimetri mengukur cahaya
tersebar oleh suspensi sel, yang proporsional dengan konsentrasi sel. Atau,
spektroskopi dapat digunakan, menggunakan absorbansi atau transmitansi dari
suspensi sel. Beberapa fermentasi yang modern sistem pemantauan sekarang
mempekerjakan metode berdasarkan spektroskopi dekat inframerah. Metode
turbidimetri dan spektrofotometri memerlukan pembangunan kalibrasi kurva yang
tepat, disusun dengan menggunakan suspensi sel standar yang mengandung
konsentrasi diketahui sel. Juga, perawatan harus diambil ketika menafsirkan hasil
jika fermentasi kaldu mengandung partikel atau sangat berwarna.
Estimasi berat kering
 Metode ini menentukan berat total sel, baik hidup dan mati, dalam sampel
biakan cair. Ini melibatkan pemisahan biomassa dari volume homogenyang
diketahui suspensi sel. Hal ini biasanya dicapai dengan filtrasi bawah vakum,
melalui membran menyaring dengan ukuran pori 0.2mm atau 0.45mm. Filter
dengan sel yang dikumpulkan adalah 'dicuci' dengan air untuk menghilangkan
media pertumbuhan sisa dan dikeringkan untuk konstan Berat dalam oven pada
105◦C. Hasil biasanya dinyatakan sebagai miligram per mililiter sel biakan.
ATP bioluminometer
ATP dengan cepat hilang dari sel-sel mati; akibatnya, sangat berguna
untuk menentukan konsentrasi mikroorganisme layak. Jumlah ATP dalam sampel
dapat dihitung menggunakan ATP bioluminometer. Teknik ini menggunakan
sebuah kompleks enzim-substrat, luciferase- luciferin, yang diperoleh dari
kunang-kunang, Photinus pyralis, yang menghasilkan foton cahaya untuk setiap
molekul ATP. Ketika alikuot luciferase-luciferin ditambahkan ke ATP diambil
dari sampel suspensi sel, cahaya dihasilkan dapat dideteksi dalam bioluminometer
yang dihasilkan sinyal diperkuat dan kemudian dinyatakan sebagai digital
atau data output analog.

Prosedur ini sangat cepat dan sensitif. Di bawah kondisi optimum sesedikit
10 femtomoles (1femtomole = 10-15 mol) dari ATP dapat dideteksi, yang kira-kira
setara dengan 1 ragi sel atau sekitar 10 bakteri. ATP bioluminometer yang paling
cocok untuk pengukuran langsung sampel yang tidak berwarna, seperti
pendinginan cahaya mungkin menjadi masalah. Namun, karena metode ini
sangat sensitif, sampel mungkin memerlukan pengenceran yang cukup besar,
yang sering mengatasi setiap pendinginan warna masalah.
Estimasi baris
Pada pemantauan garis fermentor dapat memberikan real time
estimasi biomassa, dan meminimalkan kebutuhan untuk pengambilan sampel
berulang dan analisis off line. pemantauan sistem mungkin melibatkan densitas
optik atau kapasitansi berbasis probe. Juga, mikroorganisme yang terlibat dalam
sebagian besar proses fermentasi akan baik memiliki persyaratan oksigen dan /
atau akan menghasilkan karbon dioksida. dalam kasus seperti itu secara teoritis
mungkin untuk membangun matematika hubungan antara faktor-faktor, seperti
karbon dioksida evolusi atau pemanfaatan oksigen, dan biomassa konsentrasi
dalam bioreaktor.