Judul Artikel : Novel human mutation and CRISPR/Cas genome-edited mice reveal the

importance of C-terminal domain of MSX1 in tooth and palate development

Halaman : 8 halaman
DOI : https://doi.org/10.1038%2Fsrep38398
Tahun : 2016
Penulis : Silvia Naomi Mitsui, Akihiro Yasue, Kiyoshi Masuda, Takuya Naruto,
Yoshiyuki Minegishi, Seiichi Oyadomari, Sumihare Noji, Issei Imoto & Eiji Tanaka1
Reviewer : Nadhifa Syahla (20220340128)

Abstrak
Agenisis gigi non-sindrom telah dikaitkan dengan mutasi pada berbagai gen yang
terlibat dalam morfogenesis gigi. Diantaranya, mutase pada MSX1 dan PAX9 telah dilaporkan
dalam agensisi premolar dan molar. Selain itu, AXIN2, WNT10A, dan EDA mutasi
menghasilkan agensis gigi yang parah dengan pola yang bervariasi.
Gen famili MSX mengkodekan faktor transkripsi yang memainkan peran penring
dalam interaksi jaringan induktif selama perkembangan vertebrata. MSX1 diekspresikan dalam
perkembangan tunas ektremutas dan struktur kraniofasial, termasuk puncak saraf, lengkungan,
cabang, dan plakoda sensorik. Protein MSXQ memiliki tujuh domain MSX Homology (MH)
kuno dan sangat terkonservasi yang bertindak sebagai domain pengikat atau fungsional. MSX1
juga telah dikaitkan dengan agenesis gigi sindrom pada sindrom Wolf Hirschhorn, sindrom
witkop, dan celah orofasial. Mutasi MSX1 hadir pada 2% kasus celah bibir dan langit-langit
non sindrom.
Model hewan telah memberikan konstribusi besar untuk menjelaskan mekanisme
molekuler dan perkembangan penyakit manusia serta target terapi potensial. Sementara itu,
transcription activator-like effector nucleases (TALENS) sistme clusterd regular interspaced
short palindromic repeat (CRISP)/CRISPR-associated protein (Cas) memungkinkan
pengeditan genom yang efisisen dan tepat. Teknik-teknik telah digunakan untuk menghasilan
mutasi gen pada organisme yang beragam dan dengan demikian untuk menilai kausalitas
mutasi manusia pada model hewan. Pada kasus ini dianalisis hubungan genotype-fenotipe
melalui pengeditas genom yang dimediasi CRISPR/Cas pada tikus.

Hasil
Data Klinis
Seorang gadis 14 tahun, memiliki agensis dari semua bicuspid pertama dan kedua
rahang atas, gigi insisivus sentral kiri bawah, dan bicuspid kedua. Ayahnya memiliki agensis
dari semua bicuspid pertama dan kedua rahang atas, molar ketiga kiri rahang atas, gigi seri
lateral rahang bawah dan bicuspid kedua, dan kedua molar ketiga rahang bawah. Geraham
pertama dan kedua kiri rahang bawahnya telah dicabut. Agenesis gigi saudara laki-laki proband
dikonfirmasi melalui wawancara saja. Tidak ada anomaly fisik lainnya, seperti celah mulut
atau kelainan kuku, kulit, rambut, atau kelenjar keringat.

Analisis mutasi
Tidak ada variasi nukleotida tunggal lainnya, penyisipan kecil dan atau penghapusan
(indel), atau keuntungan atau kerugian kotor yang diamati di sekitar gen kandidat lainnya.
Namun, segmen ekson 2 di MSX1 ditutupi oleh hanya beberapa pembacaan TES. Sekuensing
sanger di wilayah ini mengungkapkan penghapusan guanin heterozigot di ekson 2 dari MSX1
dalam probanddan ayah serta saudara laki-lakinya yang terpengaruh, tetapi tidak pada ibunya
yang tidak terpengaruh. Penghapusan ini diperkirakan akan menyebabkan pergeseran bingkai
yang mengubah 21 asam amino terminal-C mulai dari residu 282, menciptakan kodon stop
prematur yang menghasilkan protein terpotong residu 301, bukan 303, yang kekurangan MH6
domain. Urutan di sekitar MH6 sangat terkonservasi pada mamalia.
Mutasi taster memperkirakan bahwa mutasi penghapusan yang terdeteksi akan
menyebablan penyakit.

Generasi tikus yang terganggu MH6

Kebanyakan varian MSX1 yang diisolasi dari pasien dengan agensisi gigi sampai saat
ini melibatkan substitusi amino tunggal dalam urutan homeodomain/MH4 yang sangat
terkonservasi. Untuk memverifikasi kolerasi genotype-fenotipe in vivo, MH6 ditargetkan
menggunakan system CRISPR/Cas pada tikus. GRNA yang menargetkan wilayah hulu MH6
dirancang dan disintesis in vitro, dan kemudia disuntikkan bersama dengan Cas9 mRNA ke
dalam zigot satu sel.

Celah langit-langit sekunder dan agenesis gigi pada tikus yang kekurangan MH6
Fenotipe pertama kali dilakukan pada tikus mematikan. Bagian koronal MSX dan
MSX1 embrio menunjukkan perkambangan gigi dan langit-langit yang normal. Meskipun
MSX tikus menunjukkan perkembangan lahit-langit dan gigi yang normal, dua fenotipe
diamati pada MSX1 tikus. Celah langit-langit sekunder dengan agensisi gigi seri bawah dan
agenesis gigi seri bawah dengan langit-langit yang tipis. Semua homozigot yang baru lahir
dengan langit-langit sumbing meninggal pada neonatus, sedangkan mereka yang memiliki
langit-langit tipis dapat hidup. Mikro-CT pada usia 4 minggu menunjukkan tidak ada anomali
gigi pada tikus dengan mutasi homozigot dalam bingkai, tetapi pada homozigot MSX1 tikus
itu mengungkapkan agenesis molar ketiga atas dan molar kedua dan ketiga bawah serta
geraham kedua atas berukuran kecil, selain gigi seri bawah yang hilang diamati. Fenotipe
serupa diamati pada tikus dengan mutasi heterozigot senyawa yang mempengaruhi MH6.

Diskusi
Adanya mutasi frameshit baru pada ekson 2 dari MSX1 dalam keluarga dengan
pewarisan dominan autosomal oligodontia non-sindrom. Proband dan ayahnya memiliki
fenotipe agenesis gigi yang mirip dengan yang diamati dengan yang diidentifikasi sebelumnya.
Penghapusan guanin yang teridentifikasi berada di hulu domain MH6 dan menghasilkan
pergeseran bingkai yang menggantikan urutan MH6 dengan peptide yang tidak terkait. Mutasi
heterozigot yang mengganggu kodon stop asli dan membuka kerangka baca. Perlu dicatat
bahwa meskipun MSX1 mutasi dalam keluarga proband menunjukkan pewarisan dominan
autosomal, agenesis gigi dan celah langit-langit hanya diamati pada gangguan bialelik MH6.
MH6 adalah domain terminal-C paling banyak fi MSX1 yang dikenal sebagai domain
pengikatan PIAS. Hal ini diperlukan untuk lokalisasi protein MSX1 yang memungkinkan
represi MyoD di myoblasts. Selain itu, MSX1 dan MSX2 bertindak sebagai activator
transkripsi yang kuat daru promotor gen 1B protein kejutan panas 70kDaHSPA1B melalui
domain terminal-C.
Sebagian besarMSX1mutasi yang telah diidentifikasi sebelumnya sebagai penyebab
agenesis gigi non sindrom terletak di domain MH4, atau di daerah hulu yang mempengaruhi
MH4Domain MH4 terlibat dalam pengikatan DNA dan interaksi protein-protein. Fungsi
protein yang mengandung MH4 tidak dimediasi hanya melalui interaksi protein-DNA. Telah
ditunjukkan bahwa represi transkripsi oleh MSX1 terjadi tanpa adanya situs pengikatan DNA;
fungsi represor dikaitkan dengan beberapa domain di wilayah terminal N- dan C dari MSX136.
Dalam silikonstudi analisis telah menunjukkan bahwa mutasi missense yang mempengaruhi
MH4 di MSX1 mengubah struktur 3D protein yang dikodekan, khususnya dengan
mengacaukan motif helix-turn-helix atau mengubah interaksi protein-DNA-nya.
Sebagai kesimpulan, hal ini diidentifikasi mutasi baru dalam kasus keluarga agenesis
gigi non-sindrom yang mempengaruhi domain MH6 dari MSX1. Korelasi genotipe-fenotipe
dikuatkan melalui penargetan gen yang dimediasi sistem CRISPR / Cas pada tikus. Dengan
demikian, temuan ini menunjukkan bahwa MH6 secara fungsional diperlukan dalam MSX1
untuk perkembangan gigi dan langit-langit.