REVIEW

PENENTUAN PANJANG GELOMBANG OPTIMUM

Audrey – Stephanie

Faktor-faktor alat spektrofotometer yang mempengaruhi pembacaan:

a) Usia lampu : semakin tua usia lampu, cahaya yang dihasilkan semakin redup sehinga
menjadi tidak sensitif. Oleh karena itu, panjang gelombang optimum harus dicari supaya
meningkatkan sensitivitas agar absorbansi maksimal didapatkan.
b) Jenis lampu : mempengaruhi panjang gelombang yang dihasilkan
● Lampu deuterium (190 – 370 nm)
● Tungsten (320 – 1100 nm)
● Xenon (190 – 1100 nm)
c) Filter lampu : menyeleksi panjang gelombang atau spektrum warna yang dipancarkan.
Semakin tua usia spektrofotometer, semakin kotor filter lampu dan mempengaruhi
pembacaan.

Panjang gelombang optimum adalah panjang gelombang puncak ketika panjang gelombang (λ)
paling baik digunakan untuk mengukur suatu senyawa karena memiliki peak paling tinggi
(pembacaan paling sensitif).

Panjang gelombang maksimum adalah λ yang melewati λ optimum dan mendekati nol. Setelah
melewati panjang gelombang maksimum, pembacaan sudah tidak dapat dilakukan.

Hal hal yang perlu diperhatikan dalam pengukuran spektrofotometri :

a) Arah cahaya : Kuvet harus menghadap arah cahaya
b) Homogenitas cairan : Cairan harus berupa larutan bening atau suspensi homogen.
c) Jenis cairan : Cairan tidak boleh merusak kuvet, seperti asam sulfat pekat
(asam dan korosif), aseton (pelarut plastik)
d) Konsentrasi cairan : Semakin pekat maka cairan semakin sulit diukur dan pembacaan
menjadi salah
e) Suhu larutan : Suhu mempengaruhi akurasi pembacaan absorbansi larutan. Apabila suhu
terlalu tinggi (dibandingkan suhu ruang), larutan dapat memuai dan terbentuk uap.
Apabila suhu larutan terlalu rendah, dapat terbentuk butiran air pada dinding kuvet
sehingga mengganggu pengukuran. Suhu optimum untuk pengukuran adalah suhu ruang
f) Jenis kuvet

Jenis-jenis kuvet :
a) Plastik : murah, disposable, kurang baik untuk pengukuran larutan organik karena dapat
bereaksi, ada yang bisa untuk pengukuran UV
 b) Kaca : baik, sering digunakan, harganya tidak murah dan tidak mahal, reusable, dapat
dipakai terus selama kaca tidak rusak, tidak bisa untuk pengukuran UV (seperti untuk
DNA)
c) Kuarsa : paling baik, paling mahal, baik di panjang gelombang UV, dan baik untuk
pengukuran zat yang dapat merusak plastik

Ketiga jenis kuvet dapat digunakan untuk mengukur konsentrasi sel.

Jenis-jenis spektrofotometer :
a) Single beam : Menggunakan satu cahaya. Karena arah cahaya hanya 1, harus
ditera terus
b) Double beam : Menggunakan dua cahaya, salah satu cahaya ke sampel dan yang
lainnya ke blanko. Sumber cahaya hanya satu tetapi dipantulkan

Bahan Dan Metode

Panjang gelombang optimum dari Quinoline Yellow adalah 400 nm, Sunset Yellow adalah 487
nm, dan Amaranth adalah 500 nm. Ketiga pewarna ini merupakan pewarna sintetik.

DNS (3,5 – Dinitrosalicylic acid) merupakan pewarna yang digunakan untuk mengukur gula
pereduksi. Perubahan warna yang terjadi adalah dari kuning menjadi merah.
DNS akan mengoksidasi gugus aldehid (R-COH) pada gula pereduksi menjadi gugus karboksil
(R-COOH), kemudian DNS akan tereduksi menjadi 3-amino dan 5-nitrosalicylic acid.

Bradford digunakan untuk mengukur protein (BSA: Bovine Serum Albumin). Senyawa aktif yang
ada dalam Bradford adalah CBB (Coomassie Brilliant Blue).
CBB R-250 : digunakan untuk elektroforesis (warna biru laut)
CBB G-250 : digunakan untuk pewarnaan protein (warna hijau)

Komposisi Bradford: CBB G-250 dan asam fosfat

CBB G-250 bermuatan negatif sehingga akan berikatan pada gugus amina (NH2) yang bermuatan
positif. Kandungan asam fosfat akan membuat gugus amina bermuatan positif untuk berikatan
pada CBB. Perubahan warna akan terjadi dari biru kehijauan menjadi biru. Sampel basa tidak
dapat diukur menggunakan pewarna ini.

Kegunaan panjang gelombang optimum :

a) Agar reaksi dapat terbaca karena panjang gelombang optimum merupakan daerah paling
sensitif untuk pewarna tersebut.
b) Mempermudah pembuatan kurva standar. Pembuatan minimal duplo supaya error
terlihat.