REVIEW UJI BIOKIMIA

DANIEL – ANIN
7 DESEMBER 2021

Uji biokimia adalah uji yang dilakukan untuk mengidentifikasi spesies bakteri yang
berbeda berdasarkan aktivitas metabolismenya dan karakteristiknya.
Uji karbohidrat dibagi menjadi dua yaitu uji karbohidrat cair dan uji karbohidrat padat.
Uji Karbohidrat cair
1. Tujuan: Mengetahui kemampuan bakteri dalam memanfaatkan berbagai jenis gula sebagai
sumber karbon (sumber energi bagi bakteri).
- Uji ini menggunakan tabung Durham yang hanya dapat mengamati produksi gas insoluble
saja (cth. gas H2) secara kualitatif karena gas soluble (cth. gas CO2) tidak dapat diamati.
Tabung Durham digunakan jika gas yang diproduksi tidak perlu diketahui jumlah dan
macamnya.
- Tabung Smith digunakan jika gas yang diproduksi perlu diketahui jumlah dan macamnya.
- Dalam uji karbohidrat cair, terdapat 3 jenis media yaitu GB, LB, dan SB (glucose, lactose
dan sucrose broth) dimana cara inokulasi untuk media ini adalah dengan di shake
menggunakan ose loop. Inokulasi dengan cara di shake akan membantu melarutkan bakteri
secara merata pada media.
2. Komposisi media:
a. Gula (G, L, S) : sebagai sumber karbon
b. Pepton : sebagai sumber nitrogen
c. NaCl : untuk menjaga keadaan isotonis
d. Phenol Red : sebagai indikator pH rangenya 6,8-8,2 (kuning-merah)
Sebelum media di autoklaf pH diukur terlebih dahulu sekitar pH 7 untuk mencegah terjadinya
perubahan warna pada media.
3. Analisis hasil:
Hasil yang dapat terjadi:
a. Fermentasi gula: bakteri yang dapat melakukan fermentasi gula-gula tertentu (glukosa, laktosa,
dan sukrosa) akan menunjukkan hasil positif pada liquid carbohydrate berupa perubahan
warna media menjadi kuning. Warna kuning dihasilkan dari asam organik hasil fermentasi
berbagai jenis gula oleh bakteri. Asam akan bereaksi dengan phenol red dan membentuk
komplek warna kuning saat kondisi asam.
b. Deaminasi pepton: apabila bakteri tidak dapat melakukan fermentasi gula, maka bakteri akan
melakukan deaminasi pepton dan menghasilkan amonia yang bersifat basa (ditunjukkan
dengan perubahan menjadi warna merah pada media).
c. Pembentukan gas insoluble: pembentukan gas insoluble akan nampak berupa gelembung udara
dalam tabung durham.
Uji karbohidrat padat
1. Tujuan: Untuk mengetahui kemampuan bakteri menggunakan gula tertentu serta mengamati
pembentukan gas, deaminasi pepton, dan degradasi senyawa.
- Ada 2 jenis media yang digunakan yaitu TSIA (Triple Sugar Iron Agar) dan KIA (Kligler
Iron Agar). Perbedaan antara TSIA dan KIA adalah pada jenis gula yang terdapat
didalamnya. TSIA mengandung laktosa, glukosa, dan sukrosa, sedangkan KIA tidak
mengandung sukrosa.
2. Komposisi media:
a. Na-Thiosulfate (Na2S2O3) : untuk mendeteksi produksi H2S dan sukrosa
b. Ferrous Sulfate (FeSO4) : sebagai sumber sulfat, serta indikator keberadaan H2S
c. Gula (Glukosa:Laktosa:Sukrosa = 1:10:10)
d. Phenol Red
e. Pepton
f. Vitamin dan mineral : sebagai tambahan nutrisi untuk bakteri fastidious
Pada kedua media tersebut konsentrasi glukosa hanya 1/10 dari gula lainnya karena hampir semua
bakteri dapat menggunakan glukosa, sehingga jika diberi dalam konsentrasi besar hasilnya tidak
spesifik (false positive).
Cara inokulasi pada metode ini adalah dengan stab ¾ dan streak. Stab bertujuan untuk melihat
pembentukan gas insoluble. Jika ada gas insoluble maka media akan terangkat (cracked).
3. Analisis hasil
Hal-hal yang mungkin terjadi pada media:
a. Fermentasi gula: fermentasi gula menyebabkan terbentuknya asam sehingga media menjadi
kuning.
b. Pembentukan gas insoluble: pembentukan gas insoluble akan menyebabkan media jadi
terangkat (cracked).
c. Deaminasi pepton: bila bakteri tidak dapat menggunakan gula sebagai sumber karbon maka ia
akan beralih menggunakan pepton yang terdapat dalam media. Deaminasi pepton merupakan
proses pelepasan gugus amina pada pepton sehingga menghasilkan amonia yang bersifat basa
(media jadi merah). Prosesnya terjadi secara aerob sehingga terdapat pada slant.
d. Degradasi senyawa: beberapa bakteri memiliki kemampuan khusus akibat enzim yang
dimilikinya, sehingga mampu mendegradasi senyawa di media (cth: sistein dan thiosulfate).
4. Reaksinya:
5. Analisis hasil:

Kligler’s Ion Agar (KIA)

*C A/A, G A/A K/A K/A, *K/K,

*NC/NC H2S *K/NC

Hasil Simbol Intepretasi

Slant A/A Fermentasi seluruh gula (glukosa dan laktosa) sehingga
kuning/butt menghasilkan asam yang cukup banyak.
kuning
Slant merah/butt K/A Hanya terjadi fermentasi glukosa yang menghasilkan asam.
kuning Komponen protein dikatabolisis secara aerobik (bagian slant) dan
menghasilkan produk yang bersifat alkali (reversion)
Slant merah/butt K/K Tidak terjadi fermentasi. Pepton dikatabolisis secara aerobik dan
merah anaerobik, sehingga menghasilkan produk alkali di seluruh bagian
media. Bukan berasal dari Enterobacteriaceae.
Slant merah/butt K/NC Tidak terjadi fermentasi. Pepton dikatabolisis hanya secara
tidak ada aerobik, sehingga menghasilkan produk alkali di bagian slant.
perubahan Bukan berasal dari Enterobacteriaceae. Mirip seperti K/K hanya
bagian bawah sedikit lebih muda.
Slant & butt NC/NC Pertumbuhan organisme sangat lambat atau belum optimal
tidak berubah atau seutuhnya. Bukan berasal dari Enterobacteriaceae. Warnanya
warna C mirip seperti kontrol yang belum dinokulasi dan diinkubasi.
 Endapan hitam H2S Menghasilkan gas H2S melalui reduksi sulfur yang bereaksi
di agar dengan FeSO4 lalu terbentuk endapan FeS. Endapan FeS akan
dihasilkan pada media dalam kondisi asam
Crack dalam G Produksi gas insoluble
atau mengangkat
agar
Triple Sugar Iron Agar (TSIA)

*C A/A, G A/A K/A K/A, *K/K,

*NC/NC H2S *K/NC

Hasil Simbol Intepretasi

Slant kuning/butt kuning A/A Fermentasi seluruh gula (glukosa, laktosa, dan sukrosa)
sehingga menghasilkan asam yang cukup banyak.
Slant merah/butt kuning K/A Hanya terjadi fermentasi glukosa/glukosa dan
glukosa/laktosa atau glukosa/sukrosa yang
menghasilkan asam. Komponen protein dikatabolisis
secara aerobik (bagian slant) dan menghasilkan produk
yang bersifat alkali (reversion). Hasil dari solid
carbohydrate disesuaikan dengan liquid carbohydrate
untuk melihat jenis gula yang difermentasikan

Slant merah/butt merah K/K Tidak dapat fermentasi semua jenis gula. Pepton
dikatabolisis secara aerobik dan anaerobik, sehingga
menghasilkan produk alkali di seluruh bagian media.
Bukan berasal dari Enterobacteriaceae.
Slant merah/butt tidak K/NC Tidak terjadi fermentasi. Pepton dikatabolisis hanya
ada perubahan secara aerobik, sehingga menghasilkan produk alkali di
 bagian slant. Bukan berasal dari Enterobacteriaceae.
Mirip seperti K/K hanya bagian bawah sedikit lebih
muda.
Slant & butt tidak NC/NC Pertumbuhan organisme sangat lambat atau belum
berubah warna atau optimal seutuhnya. Bukan berasal dari
C Enterobacteriaceae. Warnanya mirip seperti kontrol
yang belum dinokulasi dan diinkubasi.
Endapan hitam di agar H2S Menghasilkan gas H2S melalui reduksi sulfur yang
bereaksi dengan FeSO4 lalu terbentuk endapan FeS.
Endapan FeS akan dihasilkan pada media dalam kondisi
asam
Crack dalam atau G Produksi gas insoluble
mengangkat agar

METABOLISME BAKTERI
A. Jalur Embden-Meyerhof-Parnas (EMP)
- Jalur ini ditemukan oleh Gustav Embden, Otto Meyerhof, dan Jakub Parnas pada tahun
1932-1937.
- Sering disebut juga sebagai glikolisis dan merupakan salah satu jalur paling umum yang
digunakan oleh bakteri dan organisme lainnya untuk mengubah glukosa menjadi piruvat,
energi, dan senyawa prekursor biosintesis lainnya seperti 3-fosfogliserat. Prosesnya terjadi
di matriks sitoplasma atau sitosol (bagian sel yang liquid) baik prokariot ataupun eukariot.
- Prosesnya jauh lebih panjang dan rumit, serta melibatkan enzim yang berbeda dengan EDP.
Hanya saja, energi yang dihasilkan jauh lebih besar yakni (2 NADH, 2 ATP).
- Jalur ini ditemukan di semua grup utama mikroorganisme dan dapat berjalan baik dalam
keadaan ada dan tidak ada oksigen.
- Contoh mikroba yang menggunakan jalur ini: Escherichia coli, Salmonella typhi
B. Jalur Entner-Doudoroff (EDP)
- Jalur ini ditemukan oleh Michael Doudoroff dan Nathan Entner pada tahn 1952.
- Merupakan bentuk atau alternatif jalur lain yang digunakan oleh bakteri untuk
mengkatabolisis glukosa menjadi piruvat dan energi menggunakan enzim yang berbeda
dengan EMP (contoh: 6-fosfoglukonat dehidratase dan 2-keto-3-deoksifosfoglukonat
aldolase)
 - Prosesnya jauh lebih sederhana, namun menghasilkan energi yang lebih sedikit (1 ATP, 1
NADH dan 1 NADPH). Kebanykan mikroorganisme yang menggunakan jalur ini bersifat
aerob karena rendahnya hasil ATP per glukosa.
- Contoh mikroba yang mensubsitusi dengan jalur ini berasal dari golongan Pseudomonas
dan Azotobacter.

UJI BIOKIMIA

Uji Indol
1. Tujuan dari uji ini adalah untuk mengidentifikasi jenis bakteri berdasarkan kemampuannya untuk
menggunakan triptofan dan mengetahui motilitas bakterinya. Dalam uji ini, teknik inokulasi yang
digunakan merupakan stab ¾.

2. Komposisi media
- Tripton
 - NaCl
- Agar bacto 0.3% yang merupakan semi-solid agar untuk melihat motilitas bakterinya.
- Akuades

3. Reagen
- Reagen yang digunakan merupakan Kovac-Ehrlich. Namun, pada praktikum ini hanya
Ehrlich yang digunakan dikarenakan reagen tersebur bersifat lebih sensitif dibandingkan
dengan Kovac.
- Pelarut dari reagen Ehrlich terdiri dari alkohol absolut serta HCl pekat. Sementara itu,
pelarut dari reagen Kovac tersusun atas amil/ isomasil alkohol serta HCl pekat.

4. Reaksi

Gambar 1 Reaksi pembentukan cincin rosindol pada uji Indol.

 5. Hasil dari uji Indol
- Pemanfaatan triptofan
o Positif: ditunjukkan oleh bakteri yang dapat menggunakan triptofan atau
menghasilkan enzim triptofanase. Bakteri tersebut akan menghidrolisis triptofan
menjadi senyawa indol, piruvat serta amonia. Kemudian, senyawa indol yang telah
dihasilkan akan bereaksi dengan reagen Ehrlich sehingga terbentuk cincin rosindol
yang berwarna pink dan bersifat tidak larut dalam air.
o Negatif: tidak terdapat perubahan pada media.

- Motilitas
o Positif: apabila bakteri bersifat motil, maka pertumbuhannya akan menyebar dan
memiliki bentuk seperti akar di sekitar daerah tusukan. Selain itu, pertumbuhannya
juga dapat ditandai dengan permukaan media yang menjadi keruh.
o Negatif: pertumbuhannya hanya terjadi di daerah inokulasi.

6. Uji lain yang dapat digunakan untuk melihat pemanfaatan triptofan menggunakan reagen Kovac/
Ehrlich
- Sulfide Indole Motility medium (SIM)
o Komposisi media terdiri dari tripton, pepton, ferrous ammonium sulphate,
Na2S2O3, agar
o Teknik inokulasi: stab
o Hasil positif:
▪ Pemanfaatan triptofan → terbentuk cincin rosindol berwarna pink
▪ Motilitas → pertumbuhannya akan menyebar serta memiliki bentuk
seperti akar di sekitar daerah tusukan, dan ditandai dengan permukaan
media yang menjadi keruh.
▪ Produksi gas H2S → terbentuk endapan hitam berupa FeS
o Hasil negatif:
▪ Pemanfaatan triptofan → tidak terdapat perubahan di media
▪ Motilitas → pertumbuhan hanya terjadi di daerah inokulasi
▪ Produksi gas H2S → tidak terbentuk endapan hitam berupa FeS
- Tryptophan / peptone broth:
o Komposisi media tryptophan broth: casein enzymic hydrolysate, NaCl, DL-
triptofan
o Komposisi media peptone broth: pepton, NaCl, Na2HPO4, KNa2PO4, akuades
o Teknik inokulasi:
o Hasil
▪ Positif: terbentuk cincin rosindol berwarna pink
▪ Negatif: tidak terdapat perubahan di media

Uji Sitrat
1. Tujuan dari uji ini adalah untuk mengetahui jenis bakteri yang mampu menggunakan sitrat sebagai
sumber karbon.
 2. Media yang digunakan pada uji ini
a. Media padat (Simmons Citrate Agar)
o Komposisi media terdiri dari (NH4)H2PO4, K2HPO4, NaCl, natrium sitrat, MgSO4,
indikator Bromothymol blue (BTB) yang memiliki rentang pH 6.0–7.6 (kuning–
biru) serta agar.
o Teknik inokulasi berupa continuous streak.
o Hasil positifnya adalah media yang berubah menjadi biru, sementara hasil
negatifnya adalah warna media berubah menjadi hijau.
o Bakteri yang tidak dapat memanfaatkan sitrat tetap mampu bertahan hidup di
media ini karena terdapat kandungan (NH4)H2PO4 yang dapat digunakan sebagai
sumber nitrogen.
b. Media cair (Koser Citrate Broth)
o Komposisi media terdiri dari sodium ammonium phosphate, KH2PO4, MgSO4
serta natrium sitrat.
o Teknik inokulasi berupa shake.
o Hasil positifnya adalah warna media berubah menjadi keruh, sementara hasil
negatifnya adalah tidak terjadi perubahan pada media.
o Media ini sering dimaanfatkan untuk membedakan antara bakteri coliform
(Enterobacter) dengan faecal coliform (Escherichia coli).

3. Reaksi
citritase / citrase*
Asam sitrat asam oksaloasetat + asam asetat
Asam asetat asam piruvat + CO2
CO2 + 2Na+ + H2O Na2CO3
*Enzim citritase/ citrase termasuk ke dalam kelompok EC4 (liase)

4. Uji lain untuk mengamati pemanfaatan sitrat oleh bakteri

- Christensen’s Citrate Agar
o Komposisi media terdiri dari yeast extract, L-sistein hidroklorida, natrium sitrat,
dekstrosa, KH2PO4, NaCl, Phenol red serta agar.
o Teknik inokulasi berupa continuous streak.
o Hasil positifnya adalah warna media yang menjadi merah sementara hasil
negatifnya adalah warna media yang menjadi kuning.
o Jika bakteri dapat memproduksi gas H2S, maka akan terbentuk endapan hitam pada
media. Hal ini dikarenakan gas H2S dapat bereaksi dengan senyawa logam seperti
ferrous ammonium citrate yang terkandung di media sehingga dihasilkan endapan
hitam.

Uji Urease
1. Tujuan dari uji ini adah untuk mengetahui jenis bakteri yang dapat menghasilkan enzim urease.
Enzim tersebut merupakan eksoenzim untuk memecah urea menjadi karbon dioksida dan amonia
yang dihasilkan oleh bakteri enterik. Amonia akan bergabung dengan karbon dioksida serta air
 untuk membentuk ammonium carbonate. Dalam uji ini, teknik inolasi yang digunakan adalah
streak.
2. Komposisi media
a. Urea solution merupakan sumber nutrisi dan bersifat tidak tahan panas sehingga
sterilisasinya harus dipisah.
b. Urea agar base mengandung indikator Phenol red dengan rentang pH 6.8–8.2 (kuning–
pink).

3. Hasil positif pada uji ini adalah warna media yang menjadi pink sementara hasil negatifnya adalah
warna media yang menjadi kuning atau tidak terjadi perubahan pada media. Jika bakteri tidak bisa
memproduksi enzim urease, maka bakteri tetap dapat hidup dengan melangsungkan fermentasi
dekstrosa yang terkandung di media sehingga membuat suasananya menjadi asam dan pH media
menurun. Alhasil, indikator Phenol red akan mengubah warna media menjadi kuning.

4. Uji lain untuk mengamati pemanfaatan urease

- Christensen’s Urea Agar
o Komposisi media terdiri dari dekstrosa, pepton, NaCl, buffer kalium fosfat, urea,
Phenol red serta agar.
o Teknik inokulasinya berupa continuous streak.
o Hasil positifnya adalah warna media yang menjadi pink sementara hasil negatifnya
adalah warna media yang menjadi kuning.
- Stuart’s Urea Agar
o Komposisi media terdiri dari ekstrak yeast, urea, buffer kalium fosfat tetapi 4x
lebih banyak dibandingkan dengan Christensen’s Urea Agar, Phenol red serta
agar.
o Teknik inokulasinya berupa continuous streak.
o Hasil positifnya adalah warna media yang menjadi pink sementara hasil negatifnya
adalah warna media yang menjadi kuning.

Uji Oksidase
1. Tujuan dari uji ini adalah untuk mengetahui adanya enzim sitokrom oksidase atau indofenol
oksidase yang dapat dihasilkan oleh suatu bakteri. Sitokrom oksidase merupakan bagian kompleks
enzim yang memiliki peran dalam fosforilasi oksidatif pada rantai transpor elektron dari donor ke
akseptor.

2. Reagen yang digunakan pada uji ini berupa Kovac’s Oxidase Reagent (1% b/v N,N,N’,N’-
tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride atau TMPD dalam akuades). TMPD merupakan
reagen artifisial yang berfungsi sebagai elektron donor untuk sitokrom oksidase. Sitokrom oksidase
akan mengatalasis reaksi oksidasi pada sitokrom tereduksi dengan oksigen untuk menghasilkan
H2O dan H2O2. TMPD akan mendonorkan elektron dan teroksidasi sehingga terbentuk indofenol
berupa bercak warna biru ungu oleh adanya oksidase dan oksigen bebas. Reaksi pembentukan
warna tersebut terjadi melalui beberapa tahap berikut ini,
a. TMPD merupakan reagen oksidase yang kaya akan elektron dan dalam keadaan tereduksi
akan bersifat colorless.
 b. Pada bakteri yang mampu menghasilkan sitokrom oksidase, elektron dari keempat molekul
sitokrom C akan ditransfer ke enzim tersebut untuk sementara waktu.
c. Hal tersebut menyebabkan terbentuknya empat molekul sitokrom C yang menjadi
kehilangan elektron namun di satu sisi terdapat sitokrom oksidase yang kaya akan elektron.
d. Tahap akhir respirasi dari bakteri yang melibatkan sitokrom oksidase dalam mentransfer
empat elektron ke molekul oksigen sekaligus empat proton untuk pembentukan 2 molekul
air akan menyebabkan sitokrom oksidase kembali ke bentuk semulanya.
e. Kemudian, molekul TMPD yang kaya akan elektron akan memberikan elektronnya kepada
sitokrom C ketimbang memperoleh elektron tersebut dari komponen lain yang berada di
rantai transpor elektron. Alhasil, sitokrom C akan kembali ke bentuk semulanya dan
molekul radikal TMPD yang telah kehilangan elektron akan menghasilkan warna biru
ungu.

Gambar 2 Reaksi pembentukan warna biru ungu pada uji oksidase.

3. Hasil dari uji

- Positif: terbentuk bercak biru ungu yang muncul dalan kurun waktu 10 detik
- Negatif: terbentuk bercak biru ungu dalam waktu lebih dari 10 detik atau tidak terjadi
perubahan
- Umumnya, bakteri aerob mampu memberikan hasil positif dikarenakan bakteri tersebut
memanfaatkan oksigen sebagai akseptor elektron terakhirnya. Lalu, produk akhir dari
proses ini berupa H2O dengan jumlah yang paling banyak serta H2O2.

4. Prosedur kerja dari uji oksidase

- Kertas filter diletakkan di atas kaca objek.
- Kultur bakteri ditambahkan ke atas kertas filter.
- Sebanyak 2-3 tetes reagen yang fresh ditambahkan.
Bakteri-bakteri yang digunakan dalam praktikum:

1. Escherichia coli
o Termasuk sebagai bakteri enterik dan mampu melakukan jalur metabolisme Embden-
Meyerhof atau glikolisis
o Dalam lingkungan anaerobik, E. coli mampu melakukan fermentasi asam campuran atau
mixed-acid fermentation dimana asam piruvat sebagai produk glikolisis akan dikonversi
menjadi berbagai macam asam organik yang meliputi asam asestat, asam laktat, asam
format, asam suksinat dan masih banyak lagi (namun tidak semua jenis asam dapat
dihasilkan). Asam yang telah terbentuk akan menghasilkan beberapa produk samping
seperti etanol, CO2, dan H2. Gas yang dihasilkan bergantung kepada jenis asam yang
diproduksi. Sebagai contoh, jika asam yang dihasilkan berupa asam laktat, maka tidak
ada gas yang dihasilkan. Sementara itu, jika asamnya dibentuk dengan bantuan enzim
piruvat format liase untuk menjadi asam format, maka akan dihasilkan gas CO2 dan O2.
o Dalam kondisi aerobik, E. coli dapat mengkonversi asam piruvat menjadi asetil koenzim
A melalui jalur siklus krebs.
o E. coli mampu menghasilkan gas yang insoluble dan tidak dapat menghasilkan H2S.
o E. coli bersifat motil dan dapat memanfaatkan triptofan tetapi tidak dapat memanfaatkan
sitrat dan menghasilkan sitokrom oksidase, serta tidak memiliki aktivitas urease.

2. Salmonella typhi
o Bakteri enterik dan melakukan jalur metabolisme Embden-Meyerhof (glikolisis)
o Dalam kondisi anaerob: melakukan fermentasi glukosa menjadi asam organik (mixed-
acid fermentation), tetapi fermentasi tidak sekuat Escherichia coli
o Produksi gas lemah
o Menghasilkan gas H2S karena memiliki enzim sistein desulfurase dan
tiosulfatreduktase yang akan bekerja pada kondisi asam, sehingga terbentuk endapan
FeS
o Jika gula di dalam media habis: melakukan deaminasi pepton dengan enzim deaminase
sehingga pH media menjadi basa akibat pembentukkan amonia

3. Pseudomonas aeruginosa
o Bakteri aerob golongan Pseudomonadaceae dan melakukan jalur metabolism Ertner
Doudoroff (glukosaà glukosa-6-fosfat à 6-fosfoglukonat)
o Non-fermentor gula
o Tidak menghasilkan gas
o Tidak menghasilkan H2S
o Jika gula di dalam media habis: melakukan deaminasi pepton dengan enzim deaminase
sehingga pH media menjadi basa akibat pembentukkan ammonia
o Tidak dapat menggunakan triptofan
 o Motil
o Dapat menggunakan sitrat
o Aktivitas urease lambat
o Dapat menghasilkan sitokrom oksidase

4. Proteus mirabilis
o Bakteri ini bersifat motil dan dapat memanfaatkan sitrat
o Memiliki aktivitas urease yang sangat cepat dimana hasil positifnya dapat diperoleh
dalam kurun waktu kurang lebih 8 jam
o Tidak dapat menggunakan triptofan dan tidak menghasilkan sitokrom oksidase